مقدمه

تولید پروتئین‫های نوترکیب در بذرهای تراریخته یک جایگزین جذاب و از لحاظ اقتصادی به صرفه برای سیستم‌های سنتی است که بر پایه سلول‌های باکتریایی و جانوری می‌باشد. تجمع پایدار پروتئین نوترکیب در یک غلظت نسبتا بالا در یک بیوماس فشرده برای استخراج و فرآیندهای بعدی بسیار مفید است (1). موفقیت در تولید پروتئین‌های نوترکیب درون بذر به‫وسیله‌ی فاکتورهای متعددی از جمله استفاده از پیشبرنده مناسب اختصاصی بذر، افزایش بیان ژن، پایداری بیان ژن و ... تعیین می‌شود. از طرف دیگر بیان موفقیت‌آمیز تراژن در گیاه، نیازمند آماده کردن سازه ژنی مناسب قبل از انتقال به گیاه است. در این تحقیق سازه ژنی حاوی پیشبرنده Napin‫، توالی Ω (امگا) در بالادست ژن GUS، ژن GUS و توالی SAR ( Scaffold attachment region) در پایین‌دست ژن GUS طراحی و تهیه شد. پیشبرنده قوی و اختصاصی  بذر Napinاز گیاه کلزا جداسازی شده و موجب بیان ژن تحت کنترل خود در بذر می‌شود. با توجه به اینکه بیان نهائی پروتئین نوترکیب تحت تاثیر دو مرحله­ی اساسی رونویسی و ترجمه قرار می گیرد، بنابراین استفاده از عناصری که اثر افزایندگی آن­ها در مرحله­ی ترجمه نمود می­یابد، راه‫کاری است که می­تواند برای بهبود بیان پروتئین نوترکیب مد­نظر قرار گیرد. توالی Ω از RNA ویروس موزائیک توتون به‫دست آمده که به‫‌طور اختصاصی به‫عنوان یک تنظیم‌کننده ترجمه عمل می‌کند و میزان ترجمه را هم در پروکاریوت‫ها و هم در یوکاریوت‫ها افزایش می‌دهد. (2). یکی از مشکلاتی که در زمینه‌ی انتقال ژن وجود دارد، ناپایداری تراژن درنسل‫های متوالی است که به‫طور کلی به آن خاموشی ژن اطلاق می‫شود. توالی دیگری که در طراحی سازه ژنی مورد نظر، استفاده شد، به اختصار SAR گفته می‌شود و حداقل از دو طریق نقش خود را در جلوگیری از خاموشی ژن‫ها در مرحله نسخه‌برداری ایفا می‫کنند: 1- از آنجا که تراژن‌های چند نسخه‌ای ممکن است انواع متفاوتی از برهمکنش‌های جفت‌شدگی را متحمل شوند که می‌تواند منجر به خاموشی ژن شود، عناصر SAR با اتصال به ماتریکس هسته از جفت‌شدگی بین نسخه‌های تراژن ممانعت به‫عمل می‌آورند (3) . 2- زمانی که چندین نسخه از تراژن به حالت سیس در یک لوکوس وارد می‌شود SAR‌ها به‫عنوان خاتمه‌دهنده رونویسی عمل کرده و از توسعه رونویسی از یک تراژن به تراژن دیگر جلوگیری کرده و پتانسیل رونوشت‌های تکراری معکوس را کاهش می‌دهند (4). نواک و همکاران (5) یک SAR سنتزی را در مجاورت ژن GUS تحت پیشبرنده 35S به کار بردند و گیاهان توتون را توسط اگروباکتریوم تراریخت کردند که اثرش بر سطح بیان 8/3 تا 3/2 برابر بود. در مطالعه­ای که توسط ورما و همکاران (6) انجام شد، برگ­های برنج با استفاده از تفنگ ژنی تحت تراریختی با 35S-GUS در مجاورت RB7 (نوعی توالی SAR) قرار گرفتند و 77 برابر افزایش در بیان ژن خارجی گزارش شد.  در این تحقیق فرض بر این بوده که سازه ژنی تهیه شده ضمن بیان ژن GUS در بذر گیاه، موجب افزایش بیان و نیز پایداری آن خواهد شد برای بررسی این موضوع سازه مدنظر به توتون منتقل شد که یک گیاه رایج در بیان پروتئین‫های نوترکیب می‌باشد.

مواد و روش‌ها

سویه‌های باکتری و پلاسمید‌های مورد استفاده: در این تحقیق از باکتری E. coli سویه´TOP10F (مقاوم به تتراسایکلین)، اگروباکتریوم سویه LBA4404، پلاسمید دوگانه pBI121 حاوی پیشبرنده Napin و ژن nptII به‫عنوان نشانگر انتخابی، ناقل همسانه‌سازی pTZ57R/T حاوی ژن lacz و ژن مقاومت به آمپی‌سیلین (شرکت Fermentase) استفاده شد.

 طراحی آغازگر‌ها: از آغازگرهای اختصاصی شماره 1 و2 برای تکثیر ژن GUS به همراه قطعه‌ی امگا و آغازگرهای 3 و 4 برای جداسازی قطعه SAR از ژنوم توتون (جدول 1) استفاده شد. قابل ذکر است که آغازگرهای قطعه SAR با استفاده از توالی pS206-1 با شماره دسترسیAF065883.1  طراحی شد. آغازگر شماره 1 از سمت '5 شامل جایگاه آنزیم برشی XbaI، توالی امگا، کد آغاز ترجمه و 13 نوکلئوتید ابتدایی ژن GUS است. آغازگر شماره 2 از سمت '5 شامل 20 نوکلئوتید ابتدایی SAR، کد پایان ترجمه و 18 نوکلئوتید انتهایی GUS می‌باشد. آغازگر شماره 3 از سمت '5 شامل 18 نوکلئوتید انتهاییGUS، کد پایان و 20 نوکلئوتید ابتدایی SAR است. آغازگر شماره 4 از سمت '5 شامل جایگاه آنزیم برشی SacI و انتهای توالیSAR می‌باشد.

جدول1: آغازگرهای طراحی‌شده برای جداسازی و تکثیر قطعات  Ω-GUSو SAR

تکثیر قطعه‌ی -GUSΩ و جداسازی SAR: به‫منظور قرار دادن قطعه‌ی امگا در ابتدای ژن GUS، در هنگام طراحی آغازگرها توالی این افزاینده (55 نوکلئوتید) در ابتدای آغازگر مستقیم (شماره 1) قرار گرفت و واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای شماره‌ی 1 و 2 انجام شد. مواد واکنش PCR مطابق با غلظت‫های استاندارد و برنامه واکنش نیز برنامه استاندارد برای 25 سیکل واکنش، دمای اتصال آغازگرها 58 درجه سانتی‫گراد و زمان یک دقیقه در نظر گرفته شد. از پلاسمید pBI121 حاوی ژن   GUS به‫عنوان الگو در واکنش PCR استفاده شد.

از برگ گیاه‫چه‌های توتون (در مرحله‌ی 3 تا 4 برگی) استخراج DNA ژنومی به روش دلاپورتا (7)  انجام شد. سپس قطعه‌ی SAR با استفاده از آغازگرهای شماره 3 و 4، از ژنوم توتون جداسازی و تکثیر شد. مواد واکنش PCR به استثناء MgCl2 (mM75/2) مطابق با PCR

استاندارد و دمای اتصال آغازگرها در این واکنش، 7/55 درجه ساتی‫گراد می‌باشد. به‫منظور استفاده از محصولات PCR در مراحل بعدی، خالص‌سازی آن‫ها از روی ژل

آگارز 1 درصد با استفاده از کیت استخراج از ژل (شرکت Qiagene) و مطابق با دستورالعمل کیت انجام شد.

اتصال قطعات Ω-GUS و SAR با استفاده از SOEingPCR: برای انجام واکنش SOEingPCR، ابتدا مقادیر مناسبی از محصولات خالص‌سازی شده‌ی دو قطعه Ω-GUS و SAR حاصل از PCR اول و دوم ‌به ‌صورت مخلوط، تحت تیمار با آنزیم Taq polymerase (بدون استفاده از آغازگرها) به تعداد 5 چرخه قرار گرفتند؛ سپس با افزودن آغازگرهای شماره 1 و 4، قطعه‌ی نهایی (Ω-GUS-SAR) تکثیر شد. مراحل و شرایط انجام این واکنش در جدول 2 آورده شده است.

جدول2: شرایط چرخه دمایی-زمانی SOEing PCR

تهیه قطعه -GUS-SARΩ در ناقل‌های همسانه‌سازی و بیانی بعد از تهیه قطعه‌ی نهایی (-GUS-SARΩ) برای تعیین توالی و نیز تسهیل کلونینگ آن در ناقل pBI121، ابتدا این قطعه مطابق با پروتوکل کیت در ناقلpTZ57R/T  کلون و انتخاب اولیه کلونی‌های سفید در محیط حاوی X-Gal و IPTG صورت گرفت شد. ناقل pTZ57R/T حاوی قطعه‌ی موردنظر، جهت توالی‌یابی به شرکت Macrogen کشور کره ارسال شد. برای انتقال قطعه‌ی -GUS-SARΩ به ناقل بیانی pBI121 ابتدا هر دو ناقلpTZ57R/T (حاوی قطعه موردنظر) و pBI121 با آنزیم‌های SacI و XbaI برش داده شد و پس از خالص‌سازی قطعه‌ی Ω-GUS-SAR و پلاسمید pBI121 فاقد GUS اولیه از ژل آگاروز 1 درصد، با توجه به غلظت باندهای مشاهده‌شده، واکنش اتصال بین آن‫ها انجام گرفت و پلاسمید نوترکیب pBI121-N-Ω-GUS-SAR به سلول‌های مستعد باکتری  E.coli سویه ′TOP10F انتقال داده شد. به‫منظور اطمینان از کلون‌شدن قطعه‌ی موردنظر، PCR بر روی کلونی‫های رشد کرده در محیط کشت حاوی تتراسایکلین و کانامایسین انجام شد و جهت اطمینان از صحت طول

قطعه‌ی کلون‌شده، هضم آنزیمی توسط آنزیم‫های برشی XbaI و SacI انجام شد. در ادامه پلاسمید pBI121-N-Ω-GUS-SAR  با روش انجماد و ذوب به اگروباکتریوم

سویه LBA4404 انتقال داده شد (8).

انتقال سازه ژنی به ریزنمونه‌های برگی توتون و باززایی گیاهان تراریخت ضدعفونی بذرهای توتون رقم Xanthi با استفاده از هیپوکلریت سدیم 5 درصد به‫مدت 10 دقیقه و 5 بار شستشو با آب مقطر استریل هر بار به‫مدت 10 دقیقه انجام شد. ﺑﺮای ﺟﻮاﻧﻪ زﻧﻲ ﺑﺬور از ﻣﺤﻴﻂ MS در دﻣﺎی 26 درجه سانتی‫گراد ﺑﺎ دوره ﻧﻮری 16 ﺳﺎﻋﺖ روﺷﻨﺎﻳﻲ و 8 ﺳﺎﻋﺖ ﺗﺎرﻳﻜﻲ اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. بعد از تقریبا ۲ هفته،  گیاهان رشد کرده و جوان‫ترین برگ‫ها با طول تقریبا ۴ سانتی‌متر برای تراریخت نمودن انتخاب (که هرکدام از آن‌ها به ۸ تا ۱۰ قطعه تقسیم شدند) و جهت تلقیح آماده شدند. ﻳﻚ روز ﻗﺒﻞ از اﻧﺠﺎم آﻟﻮدﮔﻲ، ﺗﻚ ﻛﻠﻨﻲﻫﺎی اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﺣﺎوی ﺳﺎزه ﻣﻮرد‌ﻧﻈﺮ در ﻣﺤﻴﻂ    (g/ml + LBµ 50) ﻛﺎﻧﺎﻣﺎﻳﺴﻴﻦ در دﻣﺎی 28 درجه سانتی‫گراد و ﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻛﺸﺖ داده ﺷﺪ، وﻗﺘﻲ ﻛﻪ OD ﺑﺎﻛﺘﺮی رﺷﺪ ﻛﺮده ﺑﻪ 5/0 تا 1 رﺳﻴﺪ، در دﻣﺎی 4 درجه سانتی‫گراد و دور ×g 3500 ﺑﻪ‫ﻣﺪت 5 تا 8 دﻗﻴﻘﻪﺳﺎﻧﺘﺮﻳﻔﻮژ ﺷﺪ. ﭘﺲ از ﺧﺎرج ﻧﻤﻮدن ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ ﺑﺎﻛﺘﺮی (LB)، ﻣﺤﻴﻂ ﺗﻠﻘﻴﺢ (MS مایع و هورمون‌های BAP با غلظت  mg/l3 و NAA به مقدار   mg/l1/0، ﺑﻪ سلول‫های ﺑﺎﻛﺘﺮی اﺿﺎﻓﻪ و ﺳﻠﻮل‌ﻫﺎﻛﺎﻣﻼ در آن ﺣﻞ ﺷﺪﻧﺪ. ﺑﻌﺪ ازآﻣﺎده ﻛﺮدن ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن ﺑﺎﻛﺘﺮی، رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪ‌ﻫﺎ ﺑﻪ‫ﻣﺪت 20 تا 30 ﺛﺎﻧﻴﻪ در ﺗﻤﺎس ﺑﺎ ﺳﻮﺳﭙﺎﻧﺴﻴﻮن اﮔﺮوﺑﺎﻛﺘﺮﻳﻮم ﻗﺮار ﮔﺮﻓﺘﻪ و در ﻣﺤﻴﻂ ﻫﻢ‫ﻛﺸﺘﻲ (MS کامل و هورمون‌های BAP با غلظت  mg/l3 و NAA به‫مقدارmg/l 1/0) ﺑﻪ‫ﻣﺪت 48 اﻟﻲ 72 ﺳﺎﻋﺖ در دﻣﺎی 26 درجه سانتی‫گراد در ﺗﺎرﻳﻜﻲ ﻗﺮار داده ﺷﺪﻧﺪ. در ﻣﺮﺣﻠﻪ ﺑﻌﺪی اﻳﻦ رﻳﺰﻧﻤﻮﻧﻪ‌ﻫﺎ در ﻣﺤﻴﻂ ﻛﺸﺖ اﻧﺘﺨﺎﺑﻲ (شامل محیط هم‌کشتی و آنتی‌بیوتیک‌های کانامایسین با غلظت  µg/ml100-25 و سفوتاکسیم با غلظت  µg/ml200) در دﻣﺎ و دوره ﻧﻮری ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ ﺑﻪ ﻣﺪت 4 ﻫﻔﺘﻪ ﻧﮕﻬﺪاری ﺷﺪﻧﺪ. واﻛﺸﺖ ﻧﻤﻮﻧﻪ‫ﻫﺎ ﺑﻪ‫ﻓﺎﺻﻠﻪ ﻫﺮ 15 روز ﻳﻚﺑﺎر اﻧﺠﺎم ﺷﺪ. ﺑﺮای ﻃﻮﻳﻞ ﺷﺪن نوﺳﺎﻗﻪ‌ها از ﻣﺤﻴﻂ طویل شدن ساقه (MS کامل به‌همراه  µg/ml100 آنتی‌بیوتیک کانامایسین) و ﺑﺮای رﻳﺸﻪ‌زایی گیاهچه‌ها از ﻣﺤﻴﻂ ریشه زایی (MS کامل به‌همراه  µg/ml1/0 هورمون NAA) اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. ﮔﻴﺎﻫﺎن رﻳﺸﻪ دار ﺷﺪه اﺑﺘﺪا ﺑﻪ ﮔﻠﺪان‫ﻫﺎی ﺣﺎوی ﭘﺮﻟﻴﺖ (در دﻣﺎ و ﻧﻮر ﻣﺸﺎﺑﻪ ﻣﺮﺣﻠﻪ ﻗﺒﻞ) ﺳﭙﺲ ﺑﻪ ﺧﺎک ﻣﻨﺘﻘﻞ ﺷﺪه و تا زمان جمع‌آوری بذور در ﺷﺮاﻳﻂ ﮔﻠﺨﺎﻧﻪ نگه‫داری ﺷﺪﻧﺪ (9).

بررسی مولکولی گیاهان تراریخت: بررسی در ﺳﻄﺢ :DNA از ﺑﺮگ‌ﻫﺎی ﺟﻮان ﮔﻴﺎهچه‌های رشد‌ کرده در محیط انتخابی و گیاهان ﺷﺎﻫﺪ (ﮔﻴﺎه ﻏﻴﺮﺗﺮارﻳﺨﺖ)، DNA ژﻧﻮﻣﻲ به‫روش دلاپورتا اﺳﺘﺨﺮاج ﺷﺪ. ﺳﭙﺲ ﺑﺎ اﺳﺘﻔﺎده از آﻏﺎزﮔﺮﻫﺎی اﺧﺘﺼﺎﺻﻲ ژن nptII F: 5'ATGATTGAACAAGATGGATTGCACGCAG -3')  و R: 5'-TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG-3') و آغازگرهای ژن GUS (F: 5'-GTAATTATGCGGGCAACGTCTGGTATC -3' و R: 5'-(TCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAG-3' واکنش PCR انجام شد.

بررسی در ﺳﻄﺢ RNA: ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ RNA از روش RT-PCR اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ. استخراج RNA از بافتهای بذری و برگی با استفاده از محلول استخراج RNA (RNX-Plus - 25ml RN7713C) تهیه شده از شرکت سیناژن انجام شد. ساخت cDNA از روی RNAی استخراج شده، به‫وسیله کیت دومرحله‌ای RT-PCR (vivantis,RTPL12) انجام گرفت. برای استخراج RNA از بذر، برداشت بذور نارس از گیاهان PCR مثبت، 20 روز پس از گل‫دهی انجام شد. قابل ذکر است که زمان مناسب برای فعالیت پیشبرنده Napin، حدود 20 روز پس از گل‫دهی است (10) به‫همین دلیل این زمان برای نمونه‌برداری انتخاب شده است. همچنین برگ‌های مناسب نیز از گیاهان PCR مثبت انتخاب شدند. برای انجام واکنش RT-PCR از آغازگرهای مرحله قبل استفاده شد.

ﺑﺮرﺳﻲ ﻣﻮﻟﻜﻮﻟﻲ ﮔﻴﺎﻫﺎن ﺗﺮارﻳﺨﺘﻪ در ﺳﻄﺢ پروتئین: آزمون هیستوشیمیایی جهت تایید بیان ژن GUS، بر روی برگ و بذور گیاهان شاهد و تراریخت توتون، با روش جفرسون و همکاران (11) صورت گرفت. سوبسترای مورد استفاده برای این آنزیم X-gluc (شرکت (Fermentas بود. برای از بین بردن رنگ کلروفیل برگ‫ها از اتانول استفاده شد. در مورد نمونه‫های بذری، ابتدا بذور با استفاده از ازت مایع خرد و سپس آزمون هیستوشیمیایی انجام شد. ﺑﺮای ﺑﺮرﺳﻲ ﺑﻴﺎن ژن در ﺳﻄﺢ پروتئین، ابتدا استخراج پروتئین کل از بذرهای گیاهان تراریخت و شاهد (غیر تراریخت) انجام گرفت و سپس از تکنیک SDS-PAGE به‫روش Laemmli (12) اﺳﺘﻔﺎده ﺷﺪ.

نتایج

تهیه قطعات -GUSΩ، SAR و -GUS-SARΩ و کلونینگ در پلاسمیدها

محصول اولین واکنش PCR، قطعه‌ای به‫طول 1895 جفت باز است که این قطعه شامل قطعه‌ی Ω (bp 63(، ژن GUS ( bp1812) و 20 نوکلئوتید ابتدایی قطعه‌ی SAR می‌باشد (شکل A1). تعبیه‌کردن 20 نوکلئوتید ابتدایی SAR در سمت '5 آغازگر شماره 2 منجر به قرار‌گرفتن این 20 نوکلئوتید در انتهای ژن GUS می‌شود. هدف از این کار ایجاد همپوشانی لازم (به‫طول41

نوکلئوتید) بین محصولات PCR اول و دوم بود که در واکنش SOEing PCR از قسمت همپوشان به‫هم وصل شوند. محصول واکنش دوم PCR به‌طول bp334 است، که به‫ترتیب از سمت '5 شامل 21 نوکلئوتید انتهایی ژن GUS و قطعه‌ی SAR به طول bp306 (شکل B1). در زمان طراحی آغازگرها، 21 نوکلئوتید انتهایی ژن GUS در ابتدای آغازگر شماره 3 قرار گرفت تا بدین ترتیب همپوشانی لازم بین محصولات PCR اول و دوم در هنگام SOEingPCR برقرار شود. با توجه به وجود توالیهای همپوشان درانتهای '3

قطعه‌ی Ω-GUS و انتهای '5 قطعه SAR، این دو قطعه در دمای اتصال مناسب از ناحیه همپوشان به‫هم وصل شده و هریک به‫عنوان آغازگر برای رشته‌ی دیگر عمل کرده و بدین ترتیب ضمن وصل شدن دو قطعه‌ی مورد نظر، یک قطعه کامل دو رشته‌ای (-GUS-SARΩ(نیز تولید شد. در مرحله‌ی بعدی واکنش و پس از افزودن آغازگرهای 1و4، قطعه‌ی مورد نظر به‫عنوان الگوی این آغازگرها قرار گرفت و بدین ترتیب قطعه نهایی با طول 2188 جفت‌باز، در حجم بالا تکثیر شد (شکل C1).

شکل 1: تکثیر قطعات Ω-GUS (A) ، SAR (B) و Ω-GUS-SAR (C) با PCR.  A) 2،1 و 3: قطعه Ω-GUS تکثیریافته 4: نشانگر kb1. B) 1: نشانگرbp 100،  3،2 و 4 : قطعات تکثیریافته SAR 5: کنترل منفی (C 1: نشانگر bp 100، 3،2 و 4 : قطعات تکثیریافته 

بعد از تهیه -GUS-SARΩ، واکنش اتصال این قطعه با ناقل pTZ57R/T انجام و محصول واکنش اتصال به سلول‫های مستعد باکتری E.coli منتقل شد. کلونی PCR بر روی کلونی‌های سفید انجام شد. کلونی‌هایی که محصول PCR آنها قطعه‌ای به اندازه 2188 جفت‌باز بود (شکلA2)،

به‫عنوان کلونی‌های حاوی قطعه‌ی موردنظر انتخاب شدند و واکنش هضم آنزیمی با استفاده از آنزیم‌های XbaI و SacI انجام شد. با خروج قطعه‌ای به‫طول 2188 جفت‌باز، صحت انجام کلونینگ مورد تایید نهایی قرار گرفت (شکلB2) و نتیجه‌ی توالی‌یابی، صحت توالی قطعه‌ی موردنظر را تایید کرد.

شکل 2: محصول کلونی  PCR(A) و هضم آنزیمی (B) با ناقل نوترکیب pTZ57R/T-Ω-GUS-SAR. A) 1: نشانگر kb1  2، 3 و 4 : قطعه تکثیر شده Ω-GUS-SAR با کلونی PCR B) 1 و 2: قطعه bp 2188 حاصل از هضم آنزیمی ناقل نوترکیب pTZ57R/T-Ω-GUS-SAR  3: نشانگر kb1

برای ساب کلونینگ قطعه -GUS-SARΩ در ناقل pBI121، واکنش‫های هضم آنزیمی، اتصال و انتقال به سلول‫های باکتری مجددا انجام شد. کلونی PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی 1 و 4 بر روی کلونی‌های رشد کرده در محیط تتراسایکلین و کانامایسین، قطعاتی به طول 2188 جفت‌باز تولید شد که تاییدکننده‌ی کلون‌شدن قطعه‌ی مورد نظر در کلونی‌های به‫دست آمده بود. به‫منظور تایید نهایی سازه‌ی مورد نظر، هضم آنزیمی توسط آنزیم‌های برشی XbaI و SacI

به‫طور هم‫زمان بر روی ناقل‫های نوترکیب pTZ57R/T-Ω-GUS-SAR  و pBI121-N-Ω-GUS-SAR و ناقل pBI121 اولیه (حاوی ژن GUS بدون توالیهای Ω و SAR) انجام شد. با آزادشدن قطعه‌ی 1812جفت‌باز از ناقل pBI121 اولیه و قطعه‌ی 2188جفت‌باز از ناقل‌های نوترکیبpTZ57R/T-Ω-GUS-SAR  و pBI121-N-Ω-GUS-SAR، سازه‌ی ساخته شده مورد تایید نهایی قرار گرفت (شکل 3).

شکل 3: سازه نهایی تهیه شده در ناقل pBI121. از چپ به راست به ترتیب پیشبرنده NOS (پیشبرنده عمومی)، ژن nptII، پیشبرنده Napin (اختصاصی بذر)، توالی

تراریزش ریزنمونه‌ها و باززایی گیاهان تراریخت

با توجه به نتایج تحقیقات قبلی از سویه LBA₄₄₀₄ اگروباکتریوم و همچنین مدت زمان هم کشتی 48 ساعت و تاریکی برای تلقیح ریزنمونه‫های توتون استفاده شد. حداقل زمان لازم برای فعالیت پروتئین‫های Vir و انتقال  T-DNA به ژنوم سلول‫های گیاهی، ۱۶ ساعت می باشد ، زمان‫های کمتر از ۴۸ ساعت باعث کاهش کارایی تراریختی می‫شود و

افزایش زمان، باعث افزایش آلودگی باکتریایی می‫شود که آلودگی زیاد موجب انهدام ریزنمونه‫ها می‫شود. مرحله هم کشتی در دمای 26 درجه سانتی‫گراد و تاریکی انجام شد. دمای کمتر موجب کاهش فعالیت اگروباکتریوم و موجب اختلال در روند انتقال T-DNA می‌شود. دمای بالاتر در حدود ۲۸ تا 30 درجه سانتی‫گراد که دمای بهینه رشد اگروباکتریوم است به‫علت رشد بیش از اندازه اگروباکتریوم

موجب مرگ ریز نمونه‫ها می‫شود. حضور نور فعالیت سلول‫ها را درجهت تمایز هدایت می کند و تاریکی موجب افزایش تقسیم سلولی و تشکیل کالوس می‫شود (13) لذا هم‫کشتی در شرایط تاریکی انجام شد.در خصوص مصرف کانامایسین به‫عنوان عامل انتخابگر نوساقه‫ها باید توجه داشت که برای توتون محدوده بین mg/lit 100 -25 مناسب است و افزایش این مقدار حتی ممکن است موجب حذف گیاهان تراریخت نیز شود.گیاهچه‌های سبز و رشد‌یافته در محیط انتخابی به‫منظور طویل‌شدن ساقه و ریشه‌زایی به محیط طویل شدن ساقه و ریشه‌زایی انتقال یافتند. ریزنمونه‌هایی که تراریخت نشدند در محیط انتخابی به رنگ سفید در آمدند همچنین ریز نمونه‌هایی که باززایی نشدند پس از مدتی نکروزه شدند (شکل 4).

شکل4: گیاهان باززائی شده در مراحل مختلف رشد. A: پیدایش و رشد جوانه‌های اولیه از ریزنمونه‌های برگی : B نکروزه شدن ریز نمونه‫های تراریخت نشده 2 تا 3 هفته بعد از تلقیح  C: انتقال نوساقه به محیط طویل شدن ساقه D: گل‫دهی گیاهان منتقل شده به پرلایت و خاک.

بررسی مولکولی گیاهان تراریخت

به‫منظور بررسی مولکولی گیاهان، DNA ژنومی گیاهان نسل اول (T0) و شاهد، به‫عنوان الگو و آغازگرهای اختصاصی ژن nptII و ژن GUS در واکنش PCR استفاده شد و قطعه bp 795 مربوط به ژن nptII و قطعه bp 1512 مربوط به ژن GUS در گیاهان تراریخت مشاهده شد در حالی‫که در گیاهان شاهد باندی مشاهده نشد (شکل5). لازم به ذکر است که اندازه ژن GUS برابر bp 1812 می‌باشد ولی چون دو

آغازگر فوق در داخل ژن طراحی شده بود اندازه قطعه تکثیر شده کوچک‫تر و برابر bp 1512 می‌باشد. گیاهانی که نتیجه PCR آن‌ها مثبت بود برای استخراج RNA از برگ و بذر انتخاب شدند. نتایج RT-PCR نشان داد که بیان ژن nptII به‫علت وجود پیشبرنده عمومی Nos در بذر و برگ صورت می‌گیرد (شکل 6)، ولی بیان ژن GUS به‫علت وجود پیشبرنده اختصاصی بذری Napin تنها در بذر گیاهان تراریخت مشاهده شد و در برگ گیاهان تراریخت مشاهده نشد (شکل7).

شکل5: بررسی حضور ژن GUS (A) و nptII (B) در گیاهان باززائی شده با PCR . W: گیاه شاهد T3, T2,T1 : قطعات تکثیر شده (گیاهان تراریخت متفاوت) L: نشانگر kb1.

شکل 6: تایید سنتز mRNA ژن  nptIIبا واکنش  RT-PCRدر برگ (A) و در بذر (B) گیاهان توتون تراریخت. –C: کنترل منفی  W: گیاهان شاهد T1 ، T2 و T3 : ژن تکثیر شده nptII (گیاهان تراریخت متفاوت).

شکل 7: بررسی نسخه برداری از ژن GUS در بذر (A) و در برگ (B) گیاهان باززائی شده با RT-PCR.  T1 و T2: cDNA گیاهان باززایی شده –C: کنترل منفی C+: کنترل مثبت W: گیاهان شاهد.

بررسیگیاهانتراریختدرسطح پروتئین

نمونه پروتئین‌های استخراج‌شده از بذر گیاهان تراریخت و گیاه شاهد، تعیین غلظت و از نظر غلظت همتراز شده و برای آنالیز پروتئین مورد استفاده قرار گرفت. نتیجه SDS-PAGE با پروتئین‌های استخراج شده از گیاهان تراریخت وجود یک قطعه اضافی مشخص با وزن kDa 60  در مقایسه با گیاهان شاهد را نشان داد. آزمون هیستوشیمیایی GUS مربوط به بذر، بر روی نمونه‌های بذری شاهد و تراریخت صورت گرفت و بعد از

24 ساعت نتایج مورد بررسی قرار گرفت. بذور تراریخت رنگ آبی را از خود نشان دادند ولی در بذور شاهد هیچ گونه تغییر رنگی مشاهده نشد (شکل8). نتیجه این آزمون نشان داد که آنزیم بتا گلوکلورونیداز تولید شده بر سوبسترا اثر کرده و فعالیت لازم را دارد. در نمونه‫های برگی هیچ گونه تغییر رنگی مشاهده نشد و این تایید دیگری بر بیان نشدن ژن GUS در برگ می‫باشد.