Quarterly
Document Type : Research - Scientific
Authors
1 M.Sc. of Plant Medicinal, Department Of Green Space Engineering, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran
2 Department Of Plant Breeding and Biotechnology, Faculty of Agriculture, University of Zabol, Zabol, Iran
3 Faculty Scientific member, Agricultural Research Institute, University of Zabol, Zabol, Iran
Highlights
-
Keywords
سیاهدانه (Nigella sativa)، دارای (12n=2) کروموزوم، یکساله، از خانواده آلاله (Ranunculaceae)، برای درمان بیماریهایی مثل آسم، فشار خون، دیابت، التهاب، سرفه، تب، سردرد، اگزما، سرگیجه و آنفولانزا نیز مصرف و حتی بهعنوان افزودنی غذایی نیز مفید است (1) همچنین اثرات ضد نفخ، ادرارآور، شیرآور، ضد سرطانی (2)، ضد انگلی، ضد باکتریایی (3)، آنتیاکسیدانی و ضدالتهابی (4) روغن سیاهدانه اثبات رسیده است. تایموکوئینون، تیمول، کارواکول، پاراسیمن و ترپینول از اجزای فعال و مهم روغن سیاهدانه و عصارهی کالوس سیاهدانه میباشند (5). اکثر مولکولهای زیست فعال موجود در اسانس سیاهدانه از دسته فنلها میباشند (6).
گیاه سیاهدانه منبع غنی از ترکیبات فنلی است که در اثر تنشهای زنده و غیر زنده مقدار آن افزایش مییابد این ترکیبات با فعالیت پلی فنل اکسیدازها که در پلاستهای سلول وجود دارند، اکسیدشده و در کشت بافت موجب قهوهای یا سیاه شدن بافت گیاه و عدم تثبیت ریزنمونهها در محیط کشت میگردد. تیره شدن نسبی محیط کشت بدون اسید آسکوربیک در تکثیر سیاهدانه تاییدی بر تولید ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی فراوان در محیط کشت است که میتواند برای رشد ریزنمونه مضر باشد، بنابراین استفاده از این ماده (اسید آسکوربیک ) در محیط کشت مربوط توصیه میشود (7).
استفاده از داروهای گیاهی بهخاطر عوارض جانبی داروهای شیمیایی بیشتر شده (8) و پیشنهاد شده که بایستی ماده موثره گیاهان دارویی آنهم در شرایط کشت بافت (درون شیشهای) افزایش یابد (9). استفاده از کالوس، سوسپانسیون سلولی و تولید ریشههای مویین جهت تولید متابولیتهای ثانوی و ترکیبات دارویی نظیر انواع آلکالوئیدها، ساپونینها، فلاونوئیدها، مواد فنلی، آمینواسیدها، مواد ضد سرطان و غیره از کاربردهای کشت بافت گیاهی بوده (10) و میتوان در کشت بافت، متابولیتهای با ارزش موردنظر را در تمام فصول سال و با مقدار و کیفیت دلخواه در بیوراکتورها با اعمال الیسیتور تولید کرد (11).
واژه الیسیتور در گیاهان به مواد مختلف شیمیایی اطلاق میشود که منجر به پاسخهای مورفولوژیک و فیزیولوژیک و در نهایت تجمع فیتوالکسینها میشود. واضح است که تیمار گیاهان با الیسیتور و یا یک پاتوژن غیر رقیب موجب بروز پاسخهای دفاعی مانند تجمع متابولیتهای ثانوی در گیاهان و یا کشتهای سلولی میشود. الیسیتورها بر اساس طبیعتشان به الیسیتورهای زیستی و الیسیتورهای غیر زیستی و بر اساس و منشأشان به الیسیتورهای بیرونی و الیسیتورهای درونی طبقهبندی میشوند (12). الیسیتورها ممکن است با تغییر و تنظیم میزان بیوسنتز، تجمع و یا تبادل مواد ذخیرهشده در واکوئلها، تبدیل و یا تجزیه متابولیتهای ثانویهی آنها را تحت تاثیر قرار دهند. میزان فیتوالکسینها ممکن است تحت تاثیر یک و یا تعداد بیشتری از این ساز و کارها تغییر کند (13).
با توجه به اینکه اثر الیسیتور زیستی و غیر زیستی بر میزان تولید برخی آلکالوئیدها و مواد آنتی اکسیدانتی برخی گیاهان از جمله خشخاش (14)، فندق (15)، بذرالبنج (16)، بادرنجبویه (17)، نعناع فلفلی (18) و غیره انجام شده اما تاکنون بر روی سیاه دانه انجام نشده لذا هدف از تحقیق حاضر ضمن بهینهسازی کالوس زایی، اثر الیسیتورهای زیستی و غیر زیستی بر میزان ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی گیاه دارویی سیاهدانه در شرایط کشت بافت مورد ارزیابی قرار خواهد گرفت.
مواد و روشها
مواد گیاهی و جوانهزنی: بذرها سیاهدانه در سال 1395 از مرکز تحقیقات کشاورزی سیستان تهیه شد. برای بهدست آوردن گیاهچههای استریل، بذرها با الکل 70 درصد بهمدت 50 ثانیه و هیپوکلریت سدیم (2 درصد) بهمدت 5 دقیقه تحت شرایط استریل، ضدعفونی سطحی شده و پس از 3 تا 5 بار شستشو با آب مقطر دو بار استریل به محیط کشت½MS و MS فاقد تنظیمکننده رشد با 30 گرم در لیتر ساکاروز و 8 گرم در لیتر آگار در ظروف استریل کشت شدند و جهت جوانهزنی به اتاق کشت با دمای 2±23 و تناوب نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انتقال یافتند (19).
کالوس زایی
جوانهزنی بذرها در محیط کشت بعد از گذشت دو هفته آغاز شد و پس از دستیابی به گیاهچههایی به ارتفاع حدود 10-8 سانتیمتر، ریزنمونههای از هیپوکوتیلدون، ریشه، برگ و کوتیلدون برای کالوس زایی، انتخاب و پس از ضدعفونی کردن به محیط کشت MS به همراه تیمار تنظیمکننده رشدی (mg/l 25/0، 5/0 و 1) BAP و (mg/l 1، 2، 4 و 8)2,4-D منتقل شدند. پس از کالوس زایی ریزنمونهها، کالوسهای موردنظر پس از دو بار واکشت و بعد از گذشت چهار هفته از آخرین واکشت، مورد ارزیابی قرار گرفتند و جهت به دست آوردن فنل کل و فلاونوئید کل، کالوس ها در محیط کشت پایه MS که حاوی تیمارهای نانو نقره (Nano-Ag) (ppm 30، 60 و 90) و عصاره مخمر (Yeast Extract) (ppm 100، 250 و 500) بودند واکشت و در دو بازه زمانی سه و هفت روز بعد از واکشت مورد ارزیابی شدند (20).
سنجش میزان فنل کل و فلاونوئید
1/0 گرم کالوس در 5 میلیلیتر اتانول 95 درصد ساییده و به مدت 72-24 ساعت در تاریکی بهمنظور سنجش ترکیبات فنلی کل و فلاونوئید کل نگهداری و سپس عصاره حاصل به مدت 15 دقیقه در 10000 درو سانتریفیوژ شدند.
جهت سنجش فنل کل؛ پس از سانتریفیوژ به یک میلیلیتر محلول رویی، یک میلیلیتر اتانول 95 درصد اضافه گردید و با آب مقطر، حجم محلول به 5 میلیلیتر رسانده شد. سپس 5/0 میلیلیتر معرف فولینسیوکالتیو (50%) (Folin–Ciocalteu) و یک میلیلیتر کربنات سدیم 5 درصد به آن اضافه گردید. مخلوط حاصل به مدت یک ساعت در تاریکی نگهداری شد و سپس جذب هر نمونه در طولموج 725 نانومتر خوانده شد و با استفاده از منحنی استاندارد گالیک اسید (
شکل 1)، غلظت ترکیبات فنلی کل برحسب میلیگرم در گرم وزنتر محاسبه گردید. رسم منحنی استاندارد فنل کل در غلظتهای mg/l) 0، 50، 100، 250 و 350) صورت گرفت (21).
شکل 1: منحنی استاندارد گالیک اسید جهت اندازهگیری مقادیر فنل
جهت سنجش فلاونوئید کل نیز پس از سانتریفیوژ به یک میلیلیتر محلول رویی، 250 میکرو لیتر کلرید آلومینیوم 10 درصد، 250 میکرو لیتر پتاسیم استات یک مولار اضافه و جذب نمونهها در طولموج 415 نانومتر خوانده
شد. از غلظتهای مختلف کوئرستین (mg/l 0، 10، 15 و 20) بهعنوان استاندارد استفاده و مقدار فلاونوئید (mg quercetin g-1 FW) بر اساس منحنی استاندارد کوئرستین (شکل 2) سنجیده شد (22).
شکل2: منحنی استاندارد کوئرستین جهت اندازهگیری مقادیر فلاونوئید
سنجش میزان کویرسیتین با استفاده از HPLC: حدود 3/0 گرم پودر کالوسهای موردنظر در 10 سیسی بافر استخراج (100 سیسی متانول، 2 سیسی اسید استیک و 100 سیسی آب) حل شد و بهمدت 1 ساعت بر روی شیکر قرار گرفت و پس از آن 2 میلیلیتر از همین محلول در دور 2 هزار بهمدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و از فیلتر (پالایه) های مخصوص عبور داده شد، در نهایت از محلول پالایه شده جهت انجام HPLC استفاده شد (23).
برای اندازهگیری کوئرستین از دستگاه HPLC مدل unicam-crystal-200 ساخت انگلستان حاوی کشف
کننده از نوع photodiod array که در طولموج 368 نانومتر تنظیمشده استفاده شد. برای اندازهگیری کوئرستین، ابتدا غلظتهای ( ppm1، 5، 10و 15) از محلول استاندارد کوئرستین در متانول تهیه و به دستگاه HPLC تزریق و محتوای کوئرستین بر اساس سطح زیر منحنی پیکهای حاصل با زمان بازداری مربوط و مقایسه آن با منحنی کالیبراسیون غلظت/سطح ترکیبات استاندارد، محاسبه و منحنی کالیبراسیون آن رسم شد (محتوای کوئرستین بر اساس mg/g وزن خشک محاسبه شد)(شکل 3 و 4).
شکل 3:استاندارد کوئرستین در سطح ppm 5
شکل 4 : منحنی کالیبراسیون ترکیب کوئرستین
آنالیز آماری
دادهها بعد از جمعآوری توسط نرمافزارهای SAS 9.1 و Student statistic 9 مورد ارزیابی و مقایسه میانگین صفات ارزیابیشده با استفاده از آزمون چند دامنهای دانکن انجام شد.
نتایج
جوانهزنیبذر
جهت بررسی فرآیند کالوس زایی، قطعات ریزنمونه (ریشه، هیپوکوتیلدون، برگ و کوتیلدون) روی محیط کشت پایه MS جامد حاوی ساکاروز 3 درصد، ویتامین B5 و 16 غلظت مختلف از ترکیب دو تنظیمکننده رشد 2, 4-D و BAP استفاده شد قرار گرفتند. اولین واکنشهای به تشکیل کالوس در قطعات ریزنمونه، بعد از گذشت 7 روز مشاهده و این فرآیند پس از گذشت 65 روز (واکشتهای متوالی) کامل شد (شکل 5 (بخش الف، ب، ج و د))؛ و صفاتی نظیر درصد کالوسزایی، رنگ کالوس، حجم کالوس، وزنتر و خشک کالوس و کیفیت کالوس یادداشت شد. پس از بررسیهای آماری، نتایج نشان داد که هر دو تنظیمکننده رشد 2, 4-D و BAP در بیشتر غلظتها باعث القای فرآیند کالوسزایی در تمام قطعات ریزنمونه شده (
و Error! Reference source not found.) بهطوریکه بیشترین درصد تشکیل کالوس (60 درصد) در قطعات ریزنمونه
هیپوکوتیلدون و کمترین (7 درصد) در قطعات ریزنمونه کوتیلدون مشاهده شد همچنین از لحاظ کالوسزایی اختلاف معنیداری در سطح احتمال یک درصد بین ریزنمونه ها، سطوح مختلف تنظیمکننده رشد BAP و سطوح مختلف تنظیمکننده رشد 2, 4-D وجود داشت.
تنظیمکننده رشد BAP بهتنهایی در غلظت 25/0 میلیگرم در میلیلیتر بیشترین تأثیر را در کالوسزایی هیپوکوتیلدون داشته و کمترین نقش را در غلظت یک میلیگرم در لیتر در ریزنمونه ریشه و کوتیلدون داشته است و مشاهده شد که با افزایش غلظت BAP درصد کالوس زایی کمتر شده است. همچنین تنظیمکننده رشد 2, 4-D در غلظت 4 میلیگرم در لیتر بیشترین تولید کالوس در قطعه ریزنمونه هیپوکوتیلدون داشته و کمترین نقش را در غلظت 1 میلیگرم در لیتر و در ریزنمونه ریشه داشته است ضمناً با افزایش غلظت تنظیمکننده رشد 2, 4-D تأثیر آن بر میزان کالوس دهی بیشتر شده بهطوریکه بیشترین درصد کالوس دهی در غلظت 4 میلیگرم در لیتر و کمترین میزان در غلظت 1 میلیگرم در لیتر بهدستآمده است اما کالوسزایی در سطوح بالاتر 2, 4-D سیر نزولی داشته است.
ضمنا در برهمکنش تنظیمکنندههای رشدی؛ BAP (25/0 میلیگرم در لیتر) با 2, 4-D (4 میلیگرم در لیتر) توانستهاند بیشترین کالوس را در ریزنمونه هیپوکوتیلدون تولید کنند (شکل )، یعنی در اثر برهمکنش، تنظیمکننده رشد BAP باعث شده تأثیر تنظیمکننده رشد 2, 4-D در القای کالوس بیشتر شود لذا پیشنهاد میگردد اولا برای به دست آوردن بهترین و بیشترین کالوس در گیاه دارویی سیاهدانه از ترکیب BAP (25/0 میلیگرم در لیتر) با 2, 4-D (4 میلیگرم در لیتر) و ریزنمونه هیپوکوتیلدون استفاده شود. دوما از سایر ترکیبات تنظیمکننده رشدی دیگر 2, 4-D با انواع تنظیمکنندههای رشدی دیگر مثل NAA، IAA و غیره استفاده شود تا نتیجه دقیقتری به لحاظ مؤثرترین تنظیمکننده رشد یا ترکیب تنظیمکننده رشدی مختلف در القای کالوس گیاه دارویی سیاهدانه به دست بیایید.
شکل 5 : جوانهزنی در محیط MS 2/1 (ه) و القای کالوس از نواحی ریزنمونه ریشه (الف)، هیپوکوتیلدون (ب)، برگ (ج) و کوتیلدون (د) سیاه دانه
جدول 1: تجزیه واریانس کالوس زایی با استفاده از آزمون دانکن
|
میانگین مربعات |
منابع تغییرات |
||||
|
وزن خشک |
وزنتر |
حجم |
درصد کالوس زایی |
درجه آزادی |
|
|
**174/8 |
**68988/0 |
**41/1706 |
**010/15 |
3 |
ریزنمونه |
|
818/5 |
06657/0 |
84/110 |
**879/6 |
3 |
2, 4-D |
|
371/3 |
00577/0 |
84/41 |
**797/7 |
2 |
BAP |
|
393/3 |
04755/0 |
**59/75 |
**613/2 |
9 |
ریزنمونه * 2, 4-D |
|
365/1 |
04896/0 |
**72/122 |
**791/0 |
6 |
ریزنمونه * BAP |
|
442/1 |
11937/0 |
**59/233 |
**843/1 |
6 |
2, 4-D * BAP |
|
**360/8 |
**65280/0 |
**57/86 |
**091/2 |
18 |
ریزنمونه * BAP * 2, 4-D |
|
309/5 |
02760/0 |
52/18 |
043/0 |
96 |
خطا |
** معنیدار در سطح احتمال 1 درصد * معنیدار در سطح احتمال 5 درصد
*حجم کالوس بر اساس مقیاس مهرابی و همکاران (24) اندازهگیری شد.
شکل 6 : مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف تنظیمکننده رشد BAP و 2,4-D و ریزنمونه بر درصد کالوس زایی سیاه دانه
حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است
اختلاف معنیداری در سطح احتمال یک درصد بین ریزنمونهها، تنظیمکنندههای رشد BAP و 2, 4-D بهتنهایی و اثرات متقابل تنظیمکننده رشد در حجم کالوسهای بهدستآمده از ریزنمونهها وجود داشت (جدول 1). ضمناً نتایج LSD نشان داد که بین ریزنمونهها (ریشه، هیپوکوتیلدون، برگ و کوتیلدون) بر اساس حجم کالوس اختلاف معنیداری وجود داشته و بهترین ریزنمونه، ریزنمونه کوتیلدون بود (Error! Reference source not found.). ضمناً مؤثرترین سطح تنظیمکننده رشدی BAP و 2, 4-D بر وزن کالوس به ترتیب سطح 25/0 و 4 میلیگرم در لیتر بود (Error! Reference source not found.) اما بیشترین حجم کالوس در ریزنمونه کوتیلدون و تیمار تنظیمکننده رشدی 2mg.l 2, 4-D و 0.05mg/l BAP به دست آمد.
شکل 7: مقایسه میانگین اثر تیمارهای مختلف تنظیمکننده رشد BAP و 2,4-D و ریزنمونه بر حجم کالوس سیاه دانه
حروف مشترک نشان دهنده عدم اخلاف معنیدار است
اختلاف معنیداری در سطح احتمال یک درصد بین ریزنمونهها، تنظیمکنندههای رشد BAP و 2, 4-D بهتنهایی و اثرات متقابل تنظیمکننده رشد در وزن کالوسهای بهدستآمده از ریزنمونهها وجود داشت (
1 و
). ضمناً نتایج LSD نشان داد که بین ریزنمونهها (ریشه، هیپوکوتیلدون، برگ و کوتیلدون) بر اساس وزن کالوس اختلاف معنیداری وجود داشته و بهترین ریزنمونه، ریزنمونه کوتیلدون بود. ضمناً مؤثرترین سطح تنظیمکننده رشدی BAP و 2, 4-D بر وزن کالوس به ترتیب سطح 5/0 و 4 میلیگرم در لیتر بود.
آزمون کای اسکور نشان داد که ریزنمونهها از لحاظ رنگ و کیفیت کالوس اختلاف معنیداری در سطح 1 درصد داشته اما تنظیمکننده رشد 2, 4-D و BAP تأثیری بر رنگ و کیفیت کالوس نداشتهاند. کالوسهای حاصل از ریزنمونه هیپوکوتیلدون سبز روشنتر نسبت به سایر ریزنمونهها و ریزنمونه کوتیلدون، برگ و سپس ریشه در رتبههای بعدی بودند. ضمناً کالوسهای حاصل از ریزنمونه کوتیلدون آبدارتر نسبت به سایر ریزنمونهها بوده و ریزنمونههای هیپوکوتیلدون، برگ و سپس ریشه در رتبههای بعدی بودند.
شکل 8: مقایسه میانگین وزنتر و خشک کالوس ریزنمونههای مختلف سیاه دانه حروف مشترک نشان دهنده عدم اخلاف معنی دار است
بیشترین باززایی مستقیم در ریزنمونه ریشه و در تیمارهای تنظیمکننده رشدی mg/l 1 24D و mg/l 5/0 BAP صورت گرفت و (بدون تشکیل فاز حد واسط کالوس) به هیپوکوتیلدون و برگ تبدیل شد (
شکل ).
شکل 9: مقایسه میانگین تاثیر ترکیبات تنظیمکننده رشد مختلف بر میزان باززایی مستقیم ریشه سیاه دانه
حروف مشترک نشان دهنده عدم اخلاف معنیدار است
سنجش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی
نتایج حاصل از تجزیه دادهها نشان داد که اثرات تکی نانو ذرات نقره و عصاره مخمر در زمانهای مختلف و همچنین اثرات متقابل بر میزان فنل در سطح یک درصد معنیدار (
جدول ) و آزمون تعقیبی LSD نیز نشان داد که نانو ذرات نقره بر میزان فنل تأثیر مثبت داشته و با افزایش غلظت نانو ذرات نقره میزان فنل کل نیز زیاد شده بهطوریکه بیشترین میزان فنل (06/263 میلیگرم) حاصل از 90 میلیگرم در لیتر نانو ذرات نقره و کمترین میران (269/195 میلیگرم) در شاهد بهدست آمد (شکل ). عصاره مخمر نیز بر میزان فنل تاثیر مثبت داشته و با افزایش عصاره مخمر میزان فنل کل نیز زیاد شده اما این افزایش فقط تا سطح 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر بوده و از این میزان بیشتر نهتنها تاثیر مثبت نداشته بلکه تاثیر منفی داشته است (شکل ) بهطوریکه بیشترین میزان فنل (801/323) در سطح 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر و کمترین میزان فنل (907/147) در شاهد به دست آمد. از طرفی میانگین مجموع تمامی اثرات ساده و متقابل تیمارها، با گذشت زمان، میزان فنل زیاد شده اما میزان فلاونوئید کمتر شده است. لازم به ذکر است که عصاره مخمر و نانو ذرات نقره با گذشت زمان تاثیر مثبتی بر میزان فنل داشتهاند (شکل 12) همچنین عصاره مخمر نسبت به نانو ذرات نقره تأثیر بیشتری بر میزان فنل و فلاونوئید داشته است (شکل و شکل ) ضمنا بیشترین میزان فنل کل در اثر متقابل نانو ذرات نقره (صفر یا همان شاهد) و عصاره مخمر (250 میلیگرم در لیتر) بهدست آمده است (شکل 12).
جدول 2: تجزیه واریانس اثر نانو ذرات نقره، عصاره مخمر و زمان بر میزان فنل کل و فلاونوئید
|
منابع تغییرات |
درجه آزادی |
|
میانگین مربعات |
|
|
|
فلاونوئید |
فنل |
||||
|
نانو نقره |
3 |
**47/2365 |
**19765 |
||
|
عصاره مخمر |
3 |
**45/8712 |
**130114 |
||
|
زمان |
1 |
**9/30690 |
**270076 |
||
|
نانو نقره و عصاره مخمر |
9 |
**01/7887 |
**43523 |
||
|
نانو نقره و زمان |
3 |
**90/2349 |
**22453 |
||
|
عصاره مخمر و زمان |
3 |
**86/2138 |
**15842 |
||
|
نانو نقره، عصاره مخمر و زمان |
9 |
**75/3896 |
**49342 |
||
|
خطا |
64 |
010/3 |
61/7 |
||
|
کل |
95 |
|
|
||
*علامت اختصاری (M: عصاره مخمر، N: نانونقره و T: زمان)
شکل 10: مقایسه میانگین تاثیر نانو ذرات نقره بر میزان فنل کل و فلاونوئید سیاه دانه در سطح کالوس در محیط پایه MS
شکل 11: مقایسه میانگین تاثیر عصاره مخمر نقره بر میزان فنل کل و فلاونوئید سیاه دانه در سطح کالوس در محیط پایه MS
حروف مشترک نشان دهنده عدم اختلاف معنیدار است
شکل 12: مقایسه میانگین تاثیر الیسیتور نانو نقره، عصاره مخمر و زمان بر میزان فلاونوئید سیاه دانه در سطح کالوس در محیط پایه MS
(YE= Yeast Extract; SNP= Silver nano-Particle; T= Time)
شکل 13: مقایسه میانگین تاثیر الیسیتور نانو نقره، عصاره مخمر و زمان بر میزان فنل سیاه دانه در سطح کالوس در محیط پایه MS
(YE= Yeast Extract; SNP= Silver nano-Particle; T= Time)
اثر الیسیتور بر میزان فلاونوئید سیاه دانه
در میزان فلاونوئید نیز نتایج حاصل از تجزیه دادهها نشان داد که اثرات تکی نانو ذرات نقره و عصاره مخمر در زمانهای مختلف و همچنین اثرات متقابل بر میزان فلاونوئید در سطح یک درصد معنیدار (
جدول ) و آزمون تعقیبی LSD نیز نشان داد که نانو ذرات نقره بر میزان فنل تأثیر مثبت داشته و اما این تاثیر بیشتر از 30 نانوگرم در لیتر بیشتر نبوده و با افزایش غلظت نانو ذرات نقره میزان فلاونوئید کل نیز کمتر شده اما نسبت شاهد بیشتر شده است و در کل بیشترین میزان فلاونوئید (117 میلیگرم) حاصل از 30 میلیگرم در لیتر نانو ذرات نقره و کمترین میران (4/94 میلیگرم) در شاهد بهدست آمد (شکل ). عصاره مخمر نیز بر میزان فلاونوئید تأثیر مثبت داشته و با افزایش عصاره مخمر میزان فلاونوئید کل نیز زیاد شده اما این افزایش فقط تا سطح 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر بوده و از این میزان بیشتر نهتنها تأثیر مثبت نداشته بلکه تأثیر منفی داشته است (شکل ) بهطوریکه بیشترین میزان فلاونوئید (124 میلیگرم) در تیمار سطح 250 میلیگرم در لیتر عصاره مخمر و کمترین میزان فلاونوئید (79) در شاهد به دست آمد. از طرفی میانگین مجموع تمامی اثرات ساده و متقابل تیمارها با گذشت زمان نشان داده که میزان فلاونوئید کمتر شده است. همچنین عصاره مخمر و نانو ذرات نقره با گذشت زمان تاثیر منفی بر میزان فلاونوئید داشتهاند (شکل 12) و در مجموع مشخص شد که جهت افزایش و به دست آوردن بیشترین میزان فلاونوئید در سیاهدانه بهتر است از تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه استفاده کرد (شکل 12). همچنین نتیجه HPLC برای کوئرستین (یکی از اجزای فلاونوئید)(9/4 میلیگرم در گرم ماده خشک) نشان داده که مؤثرترین تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه بوده است (شکل 14
شکل 14:کروماتوگرام نمونه شاهد (راست)، اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه (چپ)
بحث
در جوانه زنی بذرهای سیاهدانه، محیط کشت ½MS نسبت به محیط MS مناسبتر تشخیص داده شده زیرا بهنظر میرسد مقادیر بالای نمک در محیط کشت، جوانهزنی بذرهای گیاهان مختلف را میتواند محدود کند (25)، ضمنا گزارششده سیاهدانه مقاوم به شوری نبوده چون محیطهای شور تا 70 میلیگرم در لیتر شوری را
تحمل کرده و حتی در حضور کینتین نتوانسته سطح تحمل را افزایش دهد (26) در نتیجه میتوان گفت که جهت جوانهزنی سیاهدانه بهتر است از محیط ½MS به لحاظ میزان مناسب ویتامین و نمک کمتر استفاده شود.
بنا بر نتایج حاصله از این تحقیق نوع جداکشت، تفاوت معنیداری در تولید کالوس داشت بهطوریکه بیشترین درصد تشکیل کالوس (36 درصد) در قطعات ریزنمونه هیپوکوتیلدون و کمترین (3 درصد) در قطعات ریزنمونه کوتیلدون مشاهده شد ضمنا اثر نوع جداکشت در تولید کالوس توسط محققین دیگر به اثبات رسیده است(27)، بهطوریکه بهترین قطعات ریزنمونه برای تشکیل کالوس طبق تحقیقات مالیک و ساکسنا (28) برگ، امیری و فهیمی (29) هیپوکوتیل، احمد و همکاران (30) گرهک لپهای، الشمی و همکاران (31) اپی کوتیل، ولتچوا و همکاران (32) برگ، استفانیاک و همکاران (33) ساقه، گزارش شده از طرفی انتخاب یک ریزنمونه نقش اساسی در موفقیتآمیز بودن کشت بافت در شرایط درون شیشهای بازی میکند. پیچیدگی مورفولوژیکی یک ریزنمونه به همراه انتخاب تنظیمکنندههای رشد گیاهی مناسب تاثیر چشمگیری بر القا کالوس دارد (34) هرچند که سن گیاهچه و نحوه قرار گرفتن آنها روی محیط کشت نیز در برخی از گیاهان حائز اهمیت است (35) ضمنا با توجه به اینکه القای کالوس از نواحی برش خورده آغاز میشود (36) بنابراین پیشنهاد میشود که سطوح ریزنمونهها قبل از تلقیح نیز زخمی شود.
سطوح مختلف تنظیمکننده رشد BAP بر میزان کالوسزایی تاثیر معنیداری داشته بهطوریکه بیشترین میزان کالوس زایی (3/24 درصد) در غلظت 25/0 میلیگرم در لیتر و کمترین میزان کالوس زایی (8/11 درصد) در غلظت 1 میلیگرم در لیتر داشته و از طرفی اثر متقابل تنظیمکننده رشد BAP بر کالوس زایی ریزنمونهها نیز معنیدار که BAP بهتنهایی در غلظت 5/0 میلیگرم در میلیلیتر بیشترین میزان کالوس زایی در ریزنمونه هیپوکوتیلدون و کمترین نقش را در غلظت یک میلیگرم در لیتر در ریزنمونه ریشه و کوتیلدون داشته است ضمنا مشاهده شد که با افزایش غلظت BAP درصد کالوس زایی کمتر شده است. در بین سطوح مختلف تنظیمکننده رشد 2, 4-D بیشترین میزان تولید کالوس (22/22) در غلظت 4 میلیگرم در لیتر بهدستآمده است. در اثر متقابل تنظیمکننده رشد 2, 4-D و ریزنمونهها بیشترین میزان تولید کالوس در غلظت 8 میلیگرم در لیتر در ریزنمونه هیپوکوتیلدون بهدستآمده است ضمنا با افزایش غلظت 2, 4-D کالوس زایی نیز زیاد شده است. لازم به ذکر است هر کدام از تنظیمکنندههای رشد به تنهایی کالوس زایی کمتری تولید کردهاند اما اثر متقابل تنظیمکننده رشدی 2, 4-D (در سطح 4 میلیگرم در لیتر) و BAP (سطح 25/0 میلیگرم در لیتر) توانسته کالوس زایی را تا سطح 66/41 درصد افزایش دهد.
بیشترین تولید کالوس هم در پژوهش احمد و همکاران (30) و هم در پژوه کرمی و همکاران (37) حاصل برهمکنش دو تنظیمکننده رشد اکسینی و سیتوکینینی بوده و در نتایجی (37) گزارش شده که هیچ کالوسی در ریزنمونه، برگی لوبیا تشکیل نشده و بیشترین تاثیر تنظیمکننده رشد BAP (در mg/l 4) جهت القای کالوس لوبیا حدود 11 درصد بوده ولی بهصورت ترکیبی با تنظیمکننده رشد NAA توانسته کالوس زایی را تا 42 درصد افزایش دهد در تحقیق حاضر نیز اثر متقابل دو تنظیمکننده رشد تاثیر بیشتری نسبت به اثر تکی آنها بر کالوس زایی داشته است، اما نکته مشترک این است که ترکیب تنظیمکننده رشد BAP با 2, 4-D (در سیاهدانه) و BAP با NAA (در لوبیا) بهطور یکسان 42 درصد کالوس دهی را تولید کردهاند. با توجه به اینکه گزارششده که نمکهای موجود در محیط کشت تا حدودی بر میزان رشد و کالوس دهی تاثیر منفی دارند (25) در نتیجه میزان متوسط کالوس دهی در سیاهدانه میتواند به این دلیل باشد که این گیاه مقاوم به شوری نبوده (26) ولی توانسته در حضور تنظیمکنندههای رشد کالوس دهی بهتری را تولید کند.
در نتایجی دیگر (30) بهترین کالوسها را در محیط کشت MS حاوی تنظیمکننده رشد BA با غلظت یک میلیگرم در لیتر و NA با غلظت 1/0 میلیگرم در لیتر بهدست آوردند. در نتایجی غیرمشابه دیگر امیری و فهیمی (29) بهترین کالوسها را در قطعات ریزنمونه هیپوکوتیل رقم ناز در غلظت 5 میلیگرم در لیتر تنظیمکننده رشد 2, 4-D و 5/2 میلیگرم در لیتر تنظیمکننده رشد Kin بهدست آوردند. قابلتامل اینکه تنظیمکنندههای رشد NAA و Kin تنظیمکنندههای رشدی ضعیفتری محسوب میشوند و در بیشتر مطالعات 2, 4-D و BAP مناسبتر بودهاند. معمولا 2, 4-D بهعنوان قویترین اکسین مطرح و مقادیر بالای اکسین بزرگ شدن طولی سلول و افزایش تقسیم سلول را سبب میشود (38) در این تحقیق ملاحظه شد که افزایش در غلظت تنظیمکننده رشد 2, 4-D افزایش تولید کالوس را بههمراه داشت که این نتایج مشابه نتایج کومار و روپاواتی (39) ولی مخالف نتیجه سلطانی پور و همکاران (40) بود.
از لحاظ اهمیت تنظیمکنندههای رشد در تولید کالوس، امینی و همکاران (41) نشان دادند که جهت تولید کالوس وجود تنظیمکننده رشد ضروری است و در محیط کشت فاقد تنظیمکننده رشد و فاقد اکسین کالوس تولید نگردید. نتایج مشابهی نیز در این رابطه توسط دانشمندان دیگر در چندگونه گیاهی ثبت شده است (42-44). برخی تحقیقات نشان دادهاند که در محیط کشت دارای اکسین و فاقد سیتوکینین، کالوس تولید میگردد اما بدون حضور اکسین کالوس تولید نمیشود (45). لزوم وجود تنظیمکنندههای اکسینی مانند 2, 4-D برای شروع کالوس زایی در سایر گونههای علفی نیز مشاهده شده است (27, 46) بهخاطر اینکه اکسینها اثر مستقیمی بر رشد سلولی دارند (47) و دراینبین ترکیبات حاوی 2, 4-D بالاترین سطوح تولید کالوس را بهخود اختصاص دادهاند (48). گزارششده که کالوس زایی در ریزنمونه ها با افزایش میزان اکسین و بالا رفتن نسبت اکسین به سیتوکینین نسبت مستقیم دارد (49 و 50). در لپههای گیاه گردو نیز گزارششده (51) که بدون وجود اکسین در محیط کشت، کالوس تولید نمیگردد؛ اما در کل گونههای گیاهی مختلف، نیازهای متفاوتی به اکسینها دارند جهت کالوس زایی دارند (52). بنابراین میزان تولید کالوس بستگی به ترکیب تنظیمکننده رشد به کار رفته در محیط کشت دارد و تعادل بین تنظیمکنندههای رشد اکسین و سیتوکینین یک فاکتور مورفوژنتیکی تعیینکننده و مهم بهشمار میرود (42, 53). در این رابطه موراشیگ (54) اظهار داشته است که نسبت اکسین/ سیتوکینین نزدیک به 10 برای رشد سریع کالوسهای تمایز نیافته، نسبتهای نزدیک به 100 برای نمو ریشه و نسبتهای نزدیک به 4 برای رشد نو ساقهها مناسب هستند. در تحقیق حاضر نیز بهترین کالوس در حضور سیتوکینین (25/0 میلیگرم) و اکسین (4 میلیگرم) تولیدشده است که بهترین درصد کالوس زایی در همان نسبت 1 به 10 بهدستآمده و مشابه تحقیقات قبلی است.
در تحقیق حاضر بیشترین وزنتر و خشک کالوس مربوط به ریزنمونه کوتیلدون بود که با نتایج ارائهشده توسط کریمی و همکاران (55) که بیشترین وزنتر کالوس را در ریزنمونه کوتیلدون برای گل انگشتانه به دست آورده بودند مشابه داشت ضمنا بالا بودن وزنتر در کالوسهای حاصل از کوتیلدون را احتمالا میتوان به محتوای تنظیمکننده رشدی درون آوندها نسبت داد چرا که پدیده کالوس زایی در قطعات ریزنمونه، به مجموع سطوح تنظیمکننده رشدی درونزاد و برونزاد تنظیمکنندههای رشد اضافهشده به محیط کشت بستگی دارد.
در تحقیق حاضر بهترین باززای مستقیم در ریزنمونه ریشه در ترکیب تنظیمکننده رشدی 1 میلیگرم در لیتر 2, 4-D و 5/0 میلیگرم در لیتر BAP بهدست آمد که مشابه نتایج قبلی (56) بود. ضمنا ریشه به جهت دارا بودن سلولهای مریستمی در انتها میتواند در غلظتهای تنظیمکننده رشدی مناسب بهطور مستقیم و بدون واسطه کالوس، تولید برگ نمایند از طرفی اکسینها بهخصوص 2, 4-D تشکیل جنینهای سوماتیکی را القا کرده و تقسیم سلولی را باعث میشوند، این تنظیمکنندههای رشد در تشکیل کالوس نیز نقش داشته و از رشد جوانههای جانبی و ریشه جلوگیری میکنند. سیتوکینینها نیز در غلظتهای بالا تشکیل جوانه را موجب شده و از تشکیل ریشه جلوگیری میکنند (57). مجموع این عوامل باعث شده که در تحقیق حاضر نیز ریزنمونه ریشه و در ترکیب تنظیمکننده رشدی ذکر شده باززایی مستقیم و مناسبی را داشته باشیم.
در این مطالعه نانو ذرات در ابتدا باعث افزایش ترکیبات فلاونوئیدی شده و سپس با گذشت زمان باعث کاهش شد که مشابه نتایج خوشبخت و همکاران (58) که با استفاده از الیسیتور نانو نقره میزان آلوئین را در کشت سلولی گیاه آلوئه ورا افزایش دادد و تا 48 ساعت پس از القای الیسیتور نیز ادامه یافته اما پسازآن روند کاهشی داشته مشابهت داشت. از طرفی با افزایش غلظت الیسیتور نانو نقره در محیط کشت، میزان ترکیبات فنلی بیشتر شده که مشابه تحقیقات یوسفی و همکاران (59) بود. چون مکانیسم کاهش اثرات تنش توسط فلاونوئید و فنل رامی توان به اتصال ترکیبات فنولیک با یونهای فلزات سنگین مرتبط دانست (60) در نتیجه افزایش محتوای فلاونوئید و فنل کل که در یک مسیر آبشاری و توسط تعداد زیادی آنزیم کاتالیز میشوند میتوانند با افزایش تولید آنزیمهای این مسیر مرتبط باشد (59, 61, 62) اثرات مهاری اتیلن در غلظتهای بالا، بر مهار سنتز متابولیتهای ثانویه و از طرف دیگر اثرات تحریکی آن بر افزایش متابولیتهای ثانویه در غلظتهای کم به اثبات رسیده است (63, 64) بنابراین میتوان اثرات مثبت نقره بر افزایش محتوای فلاونوئید و فنل کل را به اثر بازدارندگی آن بر فعالیت اتیلن نسبت داد (65). هر چند مشخصشده که نانو نقره میتوانند به دیواره سلولی نفوذ و تغییر در نفوذپذیری دیواره ایجاد کنند و با تغییر در جذب و دفع مواد توسط دیواره، روی بسیاری از فرایندهای داخل سلول تاثیرگذار بوده و حتی میتوانند به فسفر و سولفور موجود در دیواره متصل شده و به این صورت به DNA متصل و حتی در ساختار و عملکرد پروتئینها و آنزیمها نیز تغییر ایجاد کند (66).
مکانیسم عمل نانو ذرات بسیار گسترده است و سمیت آنها ممکن است بهدلیل سطح نانو ذرات باشد که در تماس با مولکولهای زیستی موجب انجام واکنشهای احیا میشود (67). این سمیت نانو ذرات نقره میتواند موجب کاهش تجمع متابولیتها در ساعتهای پایانی شود. از طرفی یکی دیگر از دلایل افزایش متابولیتهای ثانوی در زمانهای ابتدایی اعمال تیمار میتواند به این دلیل باشد که حضور نقره در محیط باعث تولید گونههای فعال اکسیژن شده و همین عامل موجب شده که گیاه با افزایش بیان ژنهای درگیر در مسیر بیوسنتز فلاونوئیدها و افزایش محتوای فلاونوئید تنشهای ایجادشده را کاهش دهد (59 و 68) یعنی با وادار کردن گیاه به تولید مواد دفاعی (متابولیتهای ثانوی) موجبات افزایش تولید آنها را فراهم کرد (58) هر چند گیاهان واکنشهای دفاعی متفاوتی در برابر الیسیتورها دارند (69 و 70) لذا بسته به نوع گیاه و واکنش دفاعی آن و همچنین نوع متابولیت ثانوی مورد نیاز باید الیسیتور خاصی انتخاب کرد. حتی گزارششده (12) زمان اضافه نمودن الیسیتور و مدت زمانی که این سلولها در معرض الیسیتورها قرار میگیرند از فاکتورهای موثر در تولید متابولیتها است و این زمان دسترسی به حداکثر میزان متابولیت بسته به غلظت و نوع الیسیتور مختلف است (71). با توجه به اینکه بیشترین میزان فنل کل در اثر متقابل نانو ذرات نقره (صفر یا همان شاهد) و عصاره مخمر (250 میلیگرم در لیتر) بهدست آمده لذا میتوان ذکر کرد که عصاره مخمر مانع از عملکرد نانو ذرات نقره بوده در نتیجه جهت افزایش متابولیتهای ثانوی از جمله فنل نباید از ترکیب عصاره مخمر و نانو ذرات نقره استفاده کرد و چون عصاره مخمر نسبت به نانو ذرات نقره تاثیر بیشتری بر میزان فنل کل داشته است جهت افزایش فنل کل بهتر است صرفا از عصاره مخمر آنهم در بازه زمانی بیشتر (در تحقیق حاضر 7 روزه) استفاده اما جهت افزایش و بهدست آوردن بیشترین میزان فلاونوئید بهتر است از تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه استفاده کرد.
تجمع ترکیبات فلاونوئیدی در ساعتهای ابتدایی بعد از القای الیسیتور و کاهش آنها در ساعتهای پایانی تیمار بود که حاکی از اثر زمان القای الیسیتور در تجمع این متابولیت را در ساعتهای اولیه القای الیسیتوری دارد که با پژوهش دیگر محققین (72-74) نیز مطابق است. البته یکی از دلایل کاهش متابولیتها در ساعتهای پایانی، شروع پاسخ فوق حساسیت و سمی شدن سلولها بهدلیل تماس بیشتر الیسیتورها با آنها در محیط کشت و ایجاد اثر بازخوردی و عدم بیان ژنهای موثر است (72 و 75) در میان الیسیتورهای مورداستفاده، در ساعتهای ابتدایی آزمایش، نانو نقره بیشترین تاثیر را بر میزان تجمع فلاونوئید را داشت؛ ممکن است این مسئله با کوچک بودن ذرات نانو الیسیتور، نسبت بهاندازه سلول و اندازه ذرات سایر الیسیتورها مرتبط باشد که نفوذپذیری آنها را به درون سلول آسانتر نموده و در نهایت توانسته است در حداقل زمان، سلول را وادار به تولید حداکثر متابولیت کند (76) هرچند که به نظر میرسد یکی از موانع ادامه تجمع مواد فلاونوئیدی در زمانهای پایانی، سمیت نانو ذرات مورد استفاده بود (77).
در این مطالعه اثر الیسیتور زیستی عصاره مخمر نیز مورد بررسی قرار گرفت و چون الیسیتورهای زیستی ترکیباتی با منشا زیستی هستند لذا از طریق القای پاسخهای دفاعی باعث بیوسنتز و تجمع متابولیتهای ثانوی میشوند (78). در تحقیق حاضر عصاره مخمر در غلظتهای پایین باعث افزایش ترکیبات فنلی و فلاونوئیدی شد ولی در غلظتهای بالا باعث کاهش شد. گزارش شده که این الیسیتور در گیاهان بر روی کل مسیر سنتز فلاونوئیدها تاثیر میگذارد و کاهش فلاونوئید و ترکیبات فنلی، در غلظت بالای عصاره مخمر این احتمال دارد که عصاره مخمر موجب فعالتر شدن دیگر آنزیمهای غیر موثر این مسیر شده (79) و یا میتواند بهدلیل فعالتر شدن مسیرهای دیگر سیستم آنتیاکسیدان از قبیل مسیر آنزیمی باشد. در هر صورت، یکی از اثرات شناختهشده این الیسیتور ایجاد استرس در گیاهان و تولید گونههای فعال اکسیژن (ROS) است (80).
با توجه به اینکه کوئرستین باعث کاهش قند و افزایش میزان انسولین پلاسما در موشهای صحرایی دیابتی شده با استرپتوزوتوسین، شده (81) و یکی از مهمترین اجزای فلاونوئیدی سیاه دانه است (82) که میزان آن در سیاه دانه توسط برخی عوامل زیستی و غیر زیستی مختلف افزایش یافته (83) و همچنین در تحقیقاتی روی گیاهان مختلف از جمله؛ عطر سنگ (84)، رازیانه (85)، بومادران (86)، گل محمدی (87) و برخی مرکبات (88)، بهعنوان یکی از مهمترین اجزای فلاونوئید بررسی شده است لذا در تحقیق حاضر نیز کوئرستین مورد بررسی قرار گرفت. چون موثرترین تیمار بر میزان فلاونوئید، اثر متقابل نانو نقره (ppm 30) و عصاره مخمر (ppm 250) در بازه زمانی 3 روزه بود لذا جهت تایید میزان فلاونوئید در کالوس های تیمار شده از HPLC جهت اندازه گیری کوئرستین استفاده و نتیجه HPLC نشان داده که بیشترین میزان کوئرستین (9/4 میلیگرم در گرم ماده خشک) از تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه بوده که تاییدی بر نتایج تحقیق حاضر نیز است.
نتایج این تحقیق نشان داد که جهت افزایش فنل کل بهتر است صرفاً از عصاره مخمر آنهم در بازه زمانی بیشتر (در تحقیق حاضر 7 روزه) استفاده اما جهت افزایش و به دست آوردن بیشترین میزان فلاونوئید بهتر است از تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه استفاده کرد. نتایج این تحقیق نیز مشابه تحقیقات، خدایاری و همکاران (77) که با استفاده از الیسیتور زیستی عصاره مخمر، افزایش تجمع مواد فنلی و فلاونوئیدی را به شکل پایدارتر و در زمان طولانیتری نشان دادند و آبراهام و همکاران (89) که گزارش دادند عصاره مخمر بهمنزله الیسیتور زیستی موجب افزایش بیوماس و تولید متابولیتهای ثانوی میشود مشابهت داشت.
نتیجهگیری
نتایج حاصل از تحقیق حاضر نشان داده جهت بهدست آوردن بیشترین میزان کالوس زایی از ریزنمونه هیپوکوتیلدون و اثر متقابل تنظیمکنندههای رشد BAP (mg/l25/0)، 2,4-D (mg/l4) و بهترین باززایی مستقیم از اثر متقابل تنظیمکنندههای رشد BAP (mg/l5/0)، 2,4-D (mg/l1) و ریزنمونه ریشه استفاده کرد. نتایج الیسیتورها بر میزان فنل و فلاونوئید نیز نشان داد که جهت افزایش فنل کل بهتر است صرفا از عصاره مخمر آنهم در بازه زمانی بیشتر (در تحقیق حاضر 7 روزه) استفاده شود اما جهت افزایش و بهدست آوردن بیشترین میزان فلاونوئید بهتر است از تیمار اثر متقابل نانو ذرات نقره (30 میلیگرم) و عصاره مخمر (250 میلیگرم) در بازه زمانی 3 روزه استفاده کرد.
| Article View | 5,470 |
| PDF Download | 2,098 |