Cell and Tissue Journal
Quarterly

Synaptophysin gene expression in neural cells resulted from embryonal carcinoma stem cell differentiation influenced by rat neonate brain extract

Document Type : Research - Scientific

Authors

HR Jalil 1
F Azizi 1
J Moshtaghian 1
F Esmaeili 2

1 Department of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran

2 - Department of Biology, Faculty of Science, University of Isfahan, Isfahan, Iran

10.52547/JCT.7.4.343
Abstract
Aim: In this study, the effect of newborn rat brain extract to induce neuronal differentiation in P19 embryonal carcinoma (EC) stem cells was investigated.
Material and Methods: Newborn rat brain extract was collected in sterile condition and the concentration of its total protein was determined. Then, the amount of cell viability was determined after treatment with brain extract. In order to differentiation, the embryoid bodies resulted from cells suspension culture were exposed to culture medium containing 3% serum that supplemented by the extract, for 7-14 days. Specific staining and real-time PCR methods were applied to evaluate neural differentiation.
Results: Cresyl violet staining confirmed neuronal morphology of the differentiated cells. The gene expression of neural specific was confirmed by real–time PCR. Developing brain extract, which contains numerous neorotrophic factors, could induce expression of synaptophysin (presynaptic membrane protein) and nestin (intermediate filament of stem cells in the neural tube) genes. In addition, the expression of transcription factor Nanog, an important factor for pluripotency and self-renewal of stem cells, decreased under the influence of newborn rat brain extract.
Conclusion: The results of the present study indicated that newborn rat brain extract can induce neuronal phenotype as well as neuronal specific gene expression in P19 stem cells. This study suggests the potential use of combined newborn rat brain extract and stem cell therapy to improvement of deficits in neurodegenerative diseases.

Highlights

-

Keywords

Neuronal differentiation
Embryonal carcinoma cells
Brain extract
Neuron specific markers

مقدمه

آسیب­های سیستم عصبی از علل عمده مرگ و میر در جهان محسوب می­شوند. تاکنون روش­های مختلفی برای درمان چنین بیماری­هایی کشف شده است. برخی از این روش­ها عبارت است ازکاهش سطح پروتئین­های تجمع­یافته با استفاده از روش­های محدودسازی نفوذپذیری سد خونی-مغزی، استفاده از فاکتورهای رشد به­‏منظور حمایت از نورون­های آسیب­دیده و همچنین دارودرمانی (1-3). از جمله روش­های درمانی دیگر استفاده از سلول­های بنیادی است که امیدهای تازه­ای را برای ترمیم بافت‏های عصبی مرکزی آسیب­دیده فراهم آورده است. تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی نیاز به تحقیق و پژوهش فراوان دارد. در سال­های اخیر استفاده از روش های in vitro برای تولید سلول­های عصبی از سلول­های چندتوان در محیط آزمایشگاه توجه محققین را به خود جلب کرده است (4). دودمان­های سلول بنیادی که پایدار، نامیرا و پرتوان هستند کاربردهای درمانی گسترده­ای داشته و منبع نامحدودی از سلول برای استفاده در پیوند و ترمیم بافت فراهم می­کنند (5). P19 رده سلولی سرطانی جنینی (EC: embryonal carcinoma cells) موش است که به‏عنوان مدلی برای مطالعه مراحل ابتدایی تمایز و تکوین مورد استفاده قرار گرفته است. این سلول­ها مشابه سلول­های توده داخلی بلاستوسیست هستند و بسته به شرایط کشت می­توانند به سلول­های سه لایه جنینی تمایز یابند. تیمار تجمعات سلولی P19 با ­رتینوئیک­اسید باعث تمایز آن‏ها به سلول­های عصبی و گلیا می­شود (6). در این پژوهش عصاره مغز نوزاد رت به‏عنوان عامل القاگر جهت تمایز عصبی در این سلول­ها استفاده شد. قابلیت تمایز سلول­های بنیادی P19 به دودمان­های اکتودرمی یا مزودرمی به کمک القاکننده­های تمایز، مانند رتینوئیک­اسید و دی­متیل­سولفوکساید به اثبات رسیده است (7). هنگامی‏که سلول­های P19 با رتینوئیک­اسید تیمار شوند به نورواکتودرم و در نهایت به نورون، آستروگلیا، میکروگلیا و اولیگودندروسیت تمایز می­یابند (8). به‏نظر می­رسد رتینوئیک­اسید زنجیره­ای از وقایع تکوینی را شروع می­کند که مشابه وقایع تکوینی در جنین است. به‏عنوان مثال، مانند تکوین بافتی نورواکتودرم، سلول­های P19 تیمار شده با رتینوئیک­اسید دستخوش تغییرات سریع در تعداد زیادی از پروتوانکوژن­ها مانند Myc، Wnt-1، Rb-1، C-src می­شوند (9). نستین نوعی پروتئین رشته­ای حدواسط و یکی دیگر از شاخص­های نورون­های جنینی است. در حالی‏که این پروتئین در برخی از سلول­هایP19 تمایز نیافته وجود دارد، در حین تمایز این سلول­ها به نورون دستخوش افزایشی گذرا در بیان می­شود (10). این نشانگر به‏طور معمول برای شناسایی سلول­های زاینده عصبی در دستگاه عصبی مرکزی مورد استفاده قرار می­گیرد. نستین در مراحل ابتدایی تکوین دستگاه عصبی بیان می­شود (11). تشکیل سیناپس بین نورون­های مشتق از P19 با استفاده از روش‏های مختلف اثبات شده است. کشت­های نورونی P19 برای ردیابی سیناپتوفیزین با واکنش ایمنی بررسی شدند (12). بیان این پروتئین با شکل­گیری سیناپس مرتبط است. سیناپتوفیزین پروتئین درون­غشایی وزیکول­های پیش­سیناپسی بوده و محل فعالیت آن در سلول عصبی به‏صورت نقاطی قابل تشخیص است (13). بیان سیناپتوفیزین در این سلول­ها نشانگر وجود سیناپس­های کارآمد و همچنین توانایی تولید پتانسیل عمل است (14). در واقع، سیناپتوفیزین از نشانگرهای معتبر مراحل نهایی تمایز عصبی است (15). در مطالعه­ای وجود سلول­های بیان­کننده سیناپتوفیزین تحت اثر القایی رتینوئیک­اسید در حدود ده تا دوازده روز پس از کشت اجسام جنینی حاصل از سلول­های بنیادی جنینی گزارش شده است (16). بر اساس گزارش­های دیگر نورون­های مشتق از سلول­های P19 در شرایط آزمایشگاهی سیناپس­هایی تشکیل دادند که نسبت به سیناپتوفیزین واکنش ایمنی نشان دادند (17). از عوامل بسیار مهم در تنظیم میزان پرتوانی سلول­های بنیادی می­توان به دو عامل Oct3/4 و Nanog اشاره کرد. نانوگ رمزگذار نوعی عامل رونویسی است و نقش مهمی در حفظ خودنوزایی و پرتوانی سلول­های بنیادی جنینی دارد (18). نانوگ در سلول­های بنیادی جنینی و سلول­های کارسینومای جنینی بیان می­شود. بیان این مولکول در مراحل اولیه تمایز سلول­های بنیادی جنینی کاهش می­یابد (19). هدف این پژوهش بررسی القای فنوتیپ عصبی در سلول­های بنیادی P19 تحت تاثیر عصاره مغز نوزاد رت بود. نگه‏داری وضعیت تمایزی و تکثیری سلول­های بنیادی به ریزمحیطی که سلول­های بنیادی در آن قرار دارند بستگی دارد. فراهم کردن محیط مناسبی جهت رشد و تمایز سلول­های بنیادی با استفاده از فاکتور­های رشد، پروتئین­های ماتریکس و عصاره­های بافتی از اهمیت به‏سزایی برخوردار است. پانکراس در حال تکوین، فاکتورهای محلولی تولید می­کند که می­توانند تمایز سلول­های بنیادی جنینی به سلول­های انسولین­ساز را در شرایط in vitro القا کنند (20-22). تیمار سلول­های استرومایی مغز استخوان با استفاده از عصاره­ مغز طبیعی یا مغز آسیب­دیده سبب افزایش میانجی­های حمایت­کننده نورونی و رگ‏زا از قبیل فاکتور نوروتروفیکی مشتق از مغز، فاکتور رشد عصبی و فاکتور رشد اندوتلیال رگی می­شود (23). در پژوهش حاضر از عصاره تهیه شده از مغز در حال تکوین نوزاد رت برای القای تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی استفاده شد. سپس سلول­های مذکور از نظر تمایزی بررسی شده و از جنبه­های مختلف از جمله مورفولوژی ظاهری و توانایی بیان ژن­های اختصاصی عصبی مورد ارزیابی قرار گرفتند.

مواد و روش­ها

کشت و نگه‏داری سلول­های بنیادی P19: رده سلولی P19 (بانک سلولی، انستیتو پاستور، تهران، ایران) در محیط کشت α-MEM 11900-073 α-modified) (Eagle's medium: Gibco, و غلظت ده درصد سرم FBS (fetal bovine serum: Sigma, 10270-106) و مخلوط آنتی­بیوتیکی پنی­سیلین/استرپتومایسین کشت و در شرایط دمای 37 درجه سانتی­گراد و پنج درصد CO2 انکوبه شد. سلول­ها پس از رسیدن به تلاقی مناسب واکشت و یا منجمد شدند. به‏منظور القای فنوتیپ عصبی از سلول­هایی استفاده شده که فقط یک یا دو واکشت متوالی داشتند.

تولید اجسام شبه­جنینی: به‏منظور تولید اجسام شبه­جنینی از سلول­های P19، تعداد 104×5/2 سلول در یک میلی­لیتر در پتری­دیش­هایی با قابلیت چسبندگی پایین در محیط α-MEM همراه با ده درصد سرم کشت داده شد. از آنجایی‏که در این پتری­دیش­ها سلول به بستر کشت نمی­چسبد، تمایل دارند به یکدیگر چسبیده و تجمعات سلولی یا اجسام شبه­جنینی (embryoid bodies) تشکیل دهند.

حیوان آزمایشگاهی و اخلاق پژوهشی: در این پژوهش از نوزاد یک تا دو هفته­ای رت استفاده شد. برای این منظور از لانه حیوانات دانشکده علوم پزشکی دانشگاه اصفهان بیست نوزاد رت یک تا دو هفته­ای نژاد ویستار (Wistar ( تهیه و تحت شرایط استاندارد لانه حیوانات نگه‏داری شد. تمامی مراحل پژوهش بر اساس دستورالعمل اخلاقی ویژه ملی پژوهش­های زیست­پزشکی وزارت بهداشت و آموزش پزشکی انجام گرفت.

تهیه عصاره مغز نوزاد رت و تعیین غلظت پروتئین به‏روش بردفورد: به‏منظور تهیه عصاره مغز نوزاد رت برای القای عصبی در سلول­های P19، مغز بیست نوزاد رت در شرایط استریل استخراج و سپس عصاره­گیری شد. ابتدا بافت مغز در حضور ممانعت­کننده پروتئاز (protease inhibitor, PMSF: Roche, 10 837 091 001) توسط هموژنایزر خرد و همگن شد. محلول به‏دست آمده به‏مدت ده دقیقه در دور ۳۰۰۰rpm و بیست دقیقه در دور۱۲۰۰۰rpm در دمای چهار درجه سانتی‏گراد سانتریفوژ شد. مایع رویی که محتوی مجموع پروتئین­هاست از چندین عصاره­گیری جمع­آوری و مخلوط شد. سرانجام غلظت پروتئینی عصاره با استفاده از تکنیک بردفورد (Bradford reagent: Sigma, B6916) تعیین و عصاره تا زمان استفاده در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد.

تمایز عصبی سلول­هایP19 با استفاده از عصاره مغز نوزاد رت: جهت القای تمایز عصبی در سلول­های کارسینومای جنینی رده P19، سلول‏های حاصل از کشت چسبنده اجسام شبه­جنینی با غلظت­های مختلف عصاره مغز تیمار و روی لامل‏های ژلاتینه در میکروپلیت­های 12 خانه­ای کشت شدند. یک گروه به‏عنوان کنترل منفی در نظر گرفته شد؛ به‏طوری‏که هیچ‏گونه ماده القاکننده­ای به سلول­ها افزوده نشد. برای هر گروه در هر میکروپلیت حداقل سه تکرار در نظر گرفته شد. سلول‏ها به‏مدت هفت تا چهارده روز در محیط القا قرار گرفتند. محیط­های القا شامل : 1) محیط القای محتوی غلظت 50 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز، 2) محیط القای محتوی غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز، 3) محیط القای محتوی غلظت 200 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز، 4) محیط القای محتوی غلظت 300 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز و 5) محیط القای محتوی غلظت 400 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز. در طی زمان القای عصبی از غلظت سه درصد FBS استفاده شد.

تعیین میزان زنده­مانی سلولی به روش تریپان­بلو: جهت بررسی میزان زنده­مانی سلولی از روش تریپان­بلو استفاده شد. در ابتدا شمارش سلولی به‏کمک لام نئوبار انجام و تعداد 1000 سلول در هر چاهک ظرف 24 چاهکی کشت داده شد. رنگ­آمیزی سلول با حجم مساوی رنگ تریپان­بلو (بیست میکرولیتر سوسپانسیون سلولی+ بیست میکرولیتر رنگ تریپان­بلو) انجام شد. سپس با استفاده از لام نئوبار و در زیر میکروسکوپ نوری سلول­های رنگ نشده (سلول­های زنده) و رنگ شده (سلول­های مرده) شمارش شدند. در این روش سلول­های مرده به‏رنگ آبی در آمده و سلول­های زنده بدون رنگ باقی می­مانند.

رنگ­آمیزی کرزیل­ویوله: به‏‌منظور بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی در محیط کشت از رنگ‌آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله که اجسام نیسل را رنگ­آمیزی می­کند استفاده شد. سلول­ها با PBS شستشو و با استفاده از اتانول 70 درصد به‏مدت ده دقیقه در دمای اتاق تثبیت شدند. آنگاه در ترکیبی از اتانول و اسید استیک 5 درصد به‏مدت بیست دقیقه در 20- درجه سانتی­گراد آبگیری و پس از شستشو به‏مدت سه تا ده دقیقه در محلول محتوی رنگ کرزیل­ویوله (کرزیل­ویوله 25/0 درصد، اسیداستیک گلاسیال8/0 درصد، استات سدیم6/0 میلی مولار، آب مقطر100 سانتی­مترمکعب) انکوبه شدند. سلول­های رنگ­شده با استفاده از میکروسکوپ نوری در پنج میدان دید که به‏طور تصادفی انتخاب شدند، مشاهده و شمارش شدند.

تعیین دوز مناسب عصاره مغز به‏منظور القای فنوتیپ عصبی در سلول­های :P19 در این پژوهش پس از تجزیه و تحلیل نتایج حاصل از آزمایش­­های مختلف (تریپان­بلو و رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله) بهترین غلظت عصاره مغز نوزاد رت جهت القای تمایز عصبی در سلول­های P19 تعیین و برای ادامه کار مورد استفاده قرار گرفت.

Real-time PCR

طراحی پرایمر: پرایمرها با استفاده از نرم­افزار geneious طراحی و در Primer-BLAST سایت NCBI مورد بررسی و آنالیز قرار گرفتند. پرایمر­های مورد استفاده در این پروژه برای ژن­های Nanog، نستین و سیناپتوفیزین و همچنین ژن خانگی بتامیکروگلوبین (β2-microglobin ) طراحی شد. اطلاعات مربوط به پرایمرها در جدول 1 ارائه شده است.

استخراج RNA و تکثیر cDNA: هدف کلی از این مرحله استخراج RNA کل سلول به‏صورت خالص و دست نخورده است. RNA حاصله سپس خود به‏عنوان سوبسترایی برای اهداف بعدی تحقیق به‏کار برده می­شود. پس از استخراج RNA، مراحل کار برای تبدیل RNA به cDNA با استفاده از کیت سنتز cDNA (PrimeScript™ RT reagent Kit: RR037A) انجام شد. به‏منظور تکثیر cDNA حاصل و تعیین میزان بیان ژن از دستگاه StepOnePlus™ ویژه real-time PCR استفاده شد.

آزمون­های آماری

آزمایش­ها در قالب طرح کامل تصادفی (CRD) انجام و داده­ها براساس آزمون دانکنDuncan’s MultipleRange Test (DMRT) با حداقل سه تکرار و هر تکرار خود شامل سه نمونه مقایسه شد. تجزیه و تحلیل آماری به‏کمک نرم­افزار (ver.8.02) SAS و MSTATC در سطح 05/0p< صورت گرفت. نمودارها با نرم افزار اکسل رسم شد.

نتایج

کشت و تکثیر سلول­های بنیادی P19

شکل 1 الف سلول­های P19 را در حالت معلق نشان می­دهد. این سلول­ها در ظروف کشت چسبنده ساختار چندوجهی به‏خود گرفته (شکل 1 ب) و در فاصله زمانی دوازده تا چهارده ساعت به سرعت تکثیر نمودند. در حدود 24 ساعت بعد از ذوب یا واکشت در ظرف کشت حاوی α-MEM همراه با ده درصد سرم تشکیل کلونی­های سلولی را آغاز کردند (شکل1 ج). وقتی این کلونی­ها به نقطه تلاقی با هم رسیدند واکشت شدند.

 

 

 

 

 

 

شکل 1: تصویر میکروسکوپ نوری از کشت و تکثیر سلول­های بنیادیP19 در محیط کشت α-MEM محتوی ده درصد سرم در حالت معلق (الف) و چسبیده به بستر کشت (ب و ج). الف و ج (100X)، ب (400X)

 

 

تولید اجسام شبه­جنینی

ویژگی مهم سلول­های چنداستعدادی P19 که باعث شده از آن­ها به‏عنوان مدل مناسبی در تحقیقات آزمایشگاهی استفاده شود، توانایی تشکیل اجسام شبه­جنینی در کشت معلق است. سلول­های P19 در کشت معلق در ابتدا تجمعات ساده سلولی را به‏وجود می­آورند. این تجمعات ساده بعد از مدتی بزرگ­تر شده و سلول­های تمایزنیافته به‏وسیله لایه آندودرمی مفروش می‏شوند بدین ترتیب اجسام شبه­جنینی ساده به‏وجود می­آیند. کشت سلول­های سرطانی جنینیP19 در پتری‏دیش‏های باکتریولوژی منجر به تشکیل اجسام شبه­جنینی می­شود. سلول­های P19 در محیط کشت α-MEM همراه با ده درصد سرم اجسام شبه­جنینی تشکیل دادند (شکل 2).

 

 

شکل 2: تصویر میکروسکوپ نوری از تجمعات سلولی یا اجسام شبه­جنینی تشکیل شده از سلول­هایP19 در بزرگنمایی­های مختلف. فلش نشان­دهنده اجسام جنینی و ستاره نشان­دهنده سلول­هایی که در اطراف جسم جنینی قرار دارد. الف ((40X و ب ((400X

 

 

تعیین میزان زنده­مانی سلولی به روش تریپان بلو

در این پژوهش جهت بررسی میزان زنده­مانی سلولی از روش تریپان­بلو استفاده شد. سلول­های مرده در این روش به رنگ آبی و سلول­های زنده بدون رنگ هستند. پس از تجزیه و تحلیل آماری داده­های حاصل از شمارش سلولی مشخص شد که تیمار سلول­های P19 با غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره مغز نوزاد رت از نظر میزان زنده­مانی سلولی اختلاف معنی­داری با گروه کنترل منفی (بدون عامل القاگر) نشان نمی­دهد.

 

 

شکل3: بررسی میزان زنده­مانی سلول­های کشت شده در غلظت­های مختلف عصاره با استفاده از روش رنگ­آمیزی تریپان­بلو (3=n و 05/0>p). اختلاف در حروف الفبا نشان دهنده اختلاف معنی­دار میان گروه­ها است.

 

 

بررسی شکل ظاهری سلول­های عصبی با استفاده از رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله: جهت شناسایی سلول­های عصبی حاصل از تمایز از روش­های مختلف استفاده می­شود، از جمله این روش­ها رنگ­آمیزی اختصاصی کرزیل­ویوله است که اجسام نیسل موجود در سلول­های عصبی را رنگ­آمیزی می­کند (شکل 4). جسم سلولی سلول­های عصبی به‏دلیل وجود اجسام نیسل در این روش به‏رنگ بنفش در می­آیند.

 

 

شکل 4: تصویر میکروسکوپ نوری از رنگ­آمیزی کرزیل­ویوله، سلول­های شبه­عصبی با این رنگ­آمیزی رنگ بنفش به‏خود گرفتند. ستاره نشان­دهنده سلول­های تمایز نیافته و پیکان نشان­دهنده زوائد سلولی است. الف: گروه کنترل منفی ب: گروه تیمار شده با عصاره مغز. بزرگنمایی ((400X

 

 

مقادیر بیان نسبی فاکتور رونویسی Nanog در سلول­های عصبی حاصل از تمایز سلول­هایP19 تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت

بررسی بیان نسبی فاکتور رونویسی Nanog نشان داد که بیان این ژن در سلول­های P19 تیمار شده با گروه کنترل منفی تفاوت معنی­داری نشان می­دهد. در صورتی‏که این تفاوت با گروه کنترل مثبت معنی­داری نیست (شکل 5).

 

 

شکل 5: ارزیابی بیان ژن Nanog در سلول­های عصبی مشتق از سلول­های بنیادی تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت کاهش این ژن را در گروه تیمار نشان می­دهد. P19: سلول­های P19 تیمار نشده (کنترل منفی)، Brain: بافت مغز (کنترل مثبت)

 

 

مقادیر نسبی بیان ژن­های نستین و سیناپتوفیزین در سلول­های عصبی حاصل از تمایز سلول­هایP19 تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت

بررسی کمی بیان ژن نستین در سلول­های P19 در ابتدا نشان داد که بیان این ژن در این سلول­ها القا شده و در ثانی میزان بیان آن در سلول­های تیمار شده بیشتر از گروه­های کنترل است (شکل 6 الف). به‏عبارت دیگر بیان نستین در گروه تیمار شده با عصاره مغز نوزاد رت نسبت به گروه کنترل منفی و گروه کنترل مثبت (بافت مغز) افزایش معنی­داری را نشان داد. به‏علاوه، بررسی کمی بیان ژن اختصاصی سیناپتوفیزین در سلول­های P19 تیمار شده با عصاره مغز نوزاد رت نشان داد که میزان بیان ژن در این سلول­ها نسبت به گروه کنترل منفی تفاوت معنی­داری دارد (شکل6 ب).

 

 

شکل 6: الف: ارزیابی بیان ژن نستین در سلول­های عصبی مشتق از سلول­های بنیادی تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت، سلول­های P19 تیمار نشده (کنترل منفی) و بافت مغز (کنترل مثبت). ب: ارزیابی بیان ژن سیناپتوفیزین در سلول­های عصبی مشتق از سلول­های بنیادی تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت، سلول­های P19 تیمار نشده به عنوان کنترل منفی و بافت مغز به‏عنوان کنترل مثبت.

 

 

بحث

پدیده تمایز و تکوین سیستم عصبی در گرو عوامل متعددی است که هر کدام می­تواند در روند شکل­گیری این سیستم نقشی کلیدی از خود نشان دهد. در این رابطه علاوه بر عوامل مختلف، از جمله مسایل وراثتی و میانکنش­های سلولی و امثال آن ‏که به شکل­گیری این سیستم کمک می­کند، نقش عوامل تروفیک نیز انکارناپذیر است. این عوامل که از آن‏ها با نام عمومی نروتروفین نیز یاد می­شود دارای حوزه عملکردی وسیعی هستند. تا آنجا‏که بعضی از آن­ها از جمله عامل رشد عصب (Nerve growth factor)، نروتروفین (Neurotrophin)، عامل نروتروفیک سیلیاری (Ciliary neurotrophic factor: CNTF) و عامل نروتروفیک تمایز مغز (Brain-derived neurotrophic factor) نه تنها به تمایز و تکوین سیستم عصبی نابالغ کمک می‏کنند؛ بلکه وجودشان برای حفظ و بقای نورون­های ضایعه­دیده ضروری به‏نظر می­رسد. مطالعات به‏عمل آمده در این زمینه نشان می­دهد که وجود این‏گونه عوامل در بافت عصبی الزامی است؛ زیرا نروتروفین­ها علاوه بر آن که می­توانند بر سلول­های عصبی و گلیال اثرات تمایزی داشته باشند، برای حفظ و بقای جمعیت­های نورونی بالغ نیز حیاتی هستند (24). بنابراین با علم به این‏که در هنگام بروز ضایعات عصبی سنتز این گونه عوامل در این سیستم افزایش نشان می­دهد، می­توان اذعان داشت که نقش آن‏ها در حفظ و بقای نورون­های ضایعه دیده و در جلوگیری از مرگ نورونی واقعیتی انکارناپذیر است (25). بهره­گیری از مواد تروفیک در ارتباط با ترمیم ضایعات عصبی موضوعی است که در دهه­های اخیر بیشتر از هر چیزی توجه محققین را به‏خود جلب کرده است. بر اساس یک نظریه رایج، چنانچه عوامل تروفیک مغز نابالغ، جایگزین آن دسته از نوروتروفین­هایی شود که نورون­های ضایعه دیده به‏علت قطع عصب از آن محروم مانده­اند، زمینه حفظ و بقای این گونه نورون­های از دست رفته در آنان فراهم می‏شود (26). فاکتورهای نوروتروفیک علاوه بر دخالت در تکوین عصبی در بهبود آسیب­ها و درمان ضایعات عصبی نیز نقش دارند. نقش این فاکتورها در نورون­زایی­، تمایز عصبی، رشد آکسون و دندریت به اثبات رسیده است (27). از سوی دیگر شواهد موجود نشان می­دهد که این عوامل علاوه بر این‏که به مقدار قابل توجهی در سیستم عصبی نابالغ وجود دارند، برخی از آن­ها در مناطقی از سیستم بالغ مثل سلول­های شوان یا اندام هدف پایانه­های اعصاب محیطی نیز همواره در حال ساخته شدن هستند (28). از آنجا‏که دستگاه عصبی نوزاد رت در حال تکوین است و عصاره گرفته شده از این بافت حاوی فاکتورها و پروتئین­های فراوان جهت تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی است، در این پژوهش تحت حمایت عوامل تروفیک موجود در عصاره مغز نوزاد رت، سلول­های P19 از این عوامل بهره جسته و به سلول­های شبه­عصبی تمایز یافتند. در این مطالعه برای اولین بار القای تمایز عصبی در سلول­های بنیادی تراتوکارسینومای جنینی P19 تحت تأثیر عامل القاگر عصاره مغز نوزاد رت انجام شد. نتایج نشان داد که عصاره­ مغز نوزاد رت توانست به‏طور مؤثری باعث القای تمایز سلول­های بنیادی به سلول­های عصبی شود. استخراج عصاره مغز نوزاد رت در شرایط آزمایشگاهی انجام شد سپس این عصاره به‏عنوان عامل القاکننده برای تمایز سلول­های P19 به سلول­های عصبی به‏کار گرفته شد. برای شروع کار ابتدا لازم بود میزان زنده­مانی سلول‏ها پس از تاثیر عصاره مغز به‏دست آید. نتایج نشان داد که در غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره درصد بیشتری از سلول­ها زنده ماندند. در مرحله بعد جهت بررسی القای فنوتیپ عصبی، سلول­های P19 به‏مدت 24 ساعت در معرض محیط کشت القا قرار داده شدند. سپس رنگ­آمیزی کرزیل­ویوله و شمارش سلول­های عصبی صورت گرفت. سلول­های تمایزیافته تحت اثر القایی عصاره مغز فنوتیپ سلو­های عصبی را نشان دادند. مورفولوژی توصیف شده در سلول­های شبه­عصبی حاصل از این پژوهش پیش از این توسط محققین دیگر گزارش شده است (29). برای تعیین دوز مناسب عصاره برای القای فنوتیپ عصبی نتایج تریپان­بلو و کرزیل­ویوله مورد بررسی قرار گرفت. نتایج نشان داد که بهترین غلظت برای تیمار سلول­های بنیادی P19، غلظت 100 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره است. سرانجام به‏منظور تأیید هویت سلول­های عصبی بیان نشانگرهای عصبی نستین و سیناپتوفیزین و فاکتور رونویسی نانوگ با روش real-time PCR مورد ارزیابی قرار گرفت. بررسی میزان بیان نسبی فاکتور رونویسی نانوگ در سلول­های بنیادی P19 تمایزیافته تحت اثر القایی عصاره مغز نوزاد رت نشان داد که بیان این فاکتور در این سلول­ها تحت تأثیر عامل القاکننده کاهش می­یابد. هم‏سو با این پژوهش در مطالعه­ای نشان داده شده است که ژن نانوگ به‏طور خاصی در سلول­های بنیادی جنینی و کارسینومای جنینی بیان می­شود؛ اما در سلول­های بنیادی هماتوپوئیتیک بافت‏های بالغین و سلول­های تمایز یافته بیان نمی‏شود. نانوگ رمزگذار نوعی عامل رونویسی است و نقش مهمی در حفظ خودنوزایی و پرتوانی سلول­های بنیادی جنینی دارد (18). بیان این مولکول در مراحل اولیه تمایز سلول­های بنیادی جنینی کاهش می­یابد (19). سلول­های بنیادی که در معرض عامل القاگر طبیعی عصاره پانکراس قرار گرفتند در مسیر تمایزی خود به سلول­های انسولین­ساز، کاهش بیان این ژن را نشان دادند (20-22). بررسی میزان بیان mRNA نستین در دو گروه کنترل و تیمار در این پژوهش نشان داد که میزان بیان این ژن در این دو گروه تفاوت معنی­داری دارد. ارزیابی بیان نستین گزینه مناسبی برای پیش­بینی تمایز دودمان سلولی P19 به‏سمت سلول­های عصبی است. این پروتئین در برخی از سلول­های P19 تمایز نیافته وجود دارد و در حین تمایز این سلول­ها به نورون دستخوش افزایشی گذرا در بیان می­شود (10). این پژوهش هم‏راستا با سایر پژوهش­های انجام شده نشان داد که سلول­های بنیادی P19 در حین تمایز به‏سمت دودمان عصبی بیان ژن نستین را افزایش دادند. نستین فیلامنت حدواسط سلول­های نورواپیتلیال و پیش­ساز عصبی است که در مراحل ابتدایی تکوین دستگاه عصبی بیان می­شود (11). بنابراین در پژوهش حاضر بیان بالای ژن نستین در این سلول­ها نشانگر تمایز این سلول­ها به‏سمت رده سلول­های پیش­ساز عصبی است. به علاوه، نتایج این مطالعه نشان داد که عصاره مغز نوزاد رت می­تواند پروتئین‏های نشانگر عصبی مانند سیناپتوفیزین را در سلول­های تمایز یافته بیان کند. بر اساس گزارش­های قبلی نورون­های مشتق شده از سلول­های کارسینومای جنینی در شرایط آزمایشگاهی تشکیل سیناپس داده و نسبت به سیناپتوفیزین واکنش ایمنی نشان می­دهند (30). پروتئین سیناپتوفیزین نشانگر مولکولی برای غشای وزیکول سیناپسی و اگزوسیتوز (31) بوده و همچنین در تنظیم رهاسازی نوروترنسمیترها و شکل­پذیری سیناپسی نقش دارد (32). مطالعات پیشین نشان داد کاهش فعالیت سیناپسی اثرات مخربی روی سیناپس­ها و حافظه دارد. روش درمانی که در آن ارتباطات سیناپسی بین نورون­ها بازیابی ­شود می­تواند کاربرد بالقوه مناسبی در درمان بیماری آلزایمر داشته باشد (33). در پژوهش حاضر افزایش میزان بیان نسبی سه برابری سیناپتوفیزین نسبت به گروه کنترل منفی خود حاکی از این امر است که سلول­های تمایز یافته نورون­هایی بالغ بوده و قادر به تشکیل سیناپس با یکدیگر هستند. این پروتئین یکی از مهم­ترین پروتئین­های سیناپسی است که مطالعات فراوانی در مورد آن انجام شده است. سیناپتوفیزین از نشان‏گرهای معتبر مراحل نهایی تمایز عصبی است (15). در مطالعه­ای وجود سلول‏های بیان کننده سیناپتوفیزین تحت اثر القایی رتینوئیک­اسید در حدود ده یا دوازده روز پس از کشت اجسام جنینی حاصل از سلول­های بنیادی جنینی گزارش شده است (16). براساس گزارش­های دیگر نورون­های مشتق از سلول­های P19 در شرایط آزمایشگاهی سیناپس­هایی تشکیل و نسبت به سیناپتوفیزین واکنش ایمنی نشان دادند (34).

نتیجه گیری

نتایج این مطالعه نشان داد که سلول­های P19 تحت شرایط القایی با عصاره مغز نوزاد رت قابلیت تمایز به سلول­های شبه­عصبی دارند. ارزیابی بیان ژن نستین به‏کمک ریل­تایم نشان داد که سلول­ها­ی تیمار شده در ابتدا دارای فنوتیپ سلول­های بنیادی عصبی هستند. همچنین بیان نشانگر سیناپتوفیزین قابلیت تمایز به نورون­های کارآمد و عملکردی را در این سلول­ها تأیید نمود. مزیت استفاده از این روش، ساده و کم هزینه بودن آن است؛ به‏طوری‏که سلول­های P19 بدون افزودن فاکتورهای رشد گران­قیمت به سمت سلول­های عصبی متمایز شدند.

تشکر و قدردانی

این پژوهش در دانشکده علوم دانشگاه اصفهان انجام شده است. بدین­وسیله از تمام کسانی که ما را در انجام این طرح یاری نمودند به‏ویژه سرکار خانم قربانی کارشناس محترم آزمایشگاه قدردانی می­شود.

منابع:

  1. Vickers JC, King AE, Woodhouse A, Kirkcaldie MT, et al. Axonopathy and cytoskeletal disruption in degenerative diseases of the central nervous system. Brain Res Bull. 2009; 80(4): 217-23.
  2. Brandt R. Cytoskeletal mechanisms of neuronal degeneration. Cell Tissue Res. 2001; 305(2): 255-65.
  3. Skovronsky DM, Lee VMY, Trojanowski JQ. Neurodegenerative diseases: new concepts of pathogenesis and their therapeutic implications. Annu Rev Pathol Mech Dis. 2006; 1:151-70.
  4. Mansergh FC, Wride MA, Rancourt DE. Neurons from stem cells: Implications for understanding nervous system development and repair, . Biochem Cell Biol, 2000; 78: 613-28.
  5. D’Amour K, Gage FH. New tools for human developmental biology. Nature Biotechnol. 2000; 18: 381-82.

 

  1. Rudnicki MA. Cell culture methods and induction of differentiation of embryonal carcinoma cell lines. Teratocarcinomas and embryonic stem cells: A practical approach. 1987; 19-49.
  2. Choi SC CJ, Shim WJ, et al. P19 embryonal carcinoma cells: a new model for the study of endothelial cell differentiation. Biotechnol Lett. 2008; 30(7): 1169-75.
  3. Aizawa T, Seiichi H, Kazuaki Y. Neural differentiation-associated generation of microglia-like phagocytes in murine embryonal carcinoma cell line. Dev Brain Res. 1991; 59(1): 89-97.
  4. Slack RS, Hamel PA, Bladon, TS, Gill, RM, et al. Regulated expression of the retinoblastoma gene in differentiating embryonal carcinoma cells. Oncogene. 1993; 8(6): 1585-91.
  5. Lendahl U, Zimmerman LB, McKay RD. CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein. Cell. 1990; 60(4): 585-95
  6. Radtke C SB, Spies M, Kocsis JD, Vogt PM. Peripheral glial cell differentiation from neurospheres derived from adipose mesenchymal stem cells. Int J Dev Neurosci. 2009; 27(8): 817–23.
  7. McBurney M, Reuhl KR, Ally AI, Nasipuri S, et al. Differentiation and maturation of embryonal carcinoma-derived neurons in cell culture. J Neurosci. 1988; 8(3): 1063-73.
  8. McBurney M. Clonal lines of teratocarcinoma cells in vitro: differentiation and cytogenetic characteristics. J Cell Physiol. 1976; 89(3): 441-55.
  9. Vannucchi MG F-PM. Synapse formation during neuron differentiation:an in situ study of the myenteric plexus during murine embryonic life. J Comp Neurol. 2000; 425(3): 369-81.
  10. Sortwell CE ea. Pattern of synaptophysin immunoreactivity within mesencephalic grafts following transplantation in a parkinsonian primate model. Brain Res. 1998; 791(1): 117-24.
  11. Okabe S, Forsberg-Nilsson K, Spiro AC, Segal M, et al. Development of neuronal precursor cells and functional postmitotic neurons from embryonic stem cells in vitro. Mech Dev. 1996; 59(1): 89-102.
  12. MacPherson PA, Jones S, Pawson PA, Marshall KC, et al. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 1997; 80(2): 487-99.
  13. Wang SH TM, Chiang MF, et al. A novel NK type homeobox gene, ENK early embryo specific NK, preferentially expressed in embryonic stem cells. Gene Expr Patterns 2003; 3: 99–103.
  14. Boer B CJ, Claassen D, et al. Regulation of the Nanog gene by both positive and negative cis regulatory elements in embryonal carcinoma cells and embryonic stem cells. Mol Reprod Dev. 2009; 76(2): 173-82.
  15. Ebrahimie M, Esmaeili F, Cheraghi S, Houshmand F, et al. Efficient and Simple Production of Insulin-Producing Cells from Embryonal Carcinoma Stem Cells Using Mouse Neonate Pancreas Extract, As a Natural Inducer. PloS one. 2014; 9(3): e90885, Doi:10.1371/journal.pone.0090885.
  16. Mansouri A, Esmaeili F, Nejatpour A, Houshmand F, et al. Differentiation of P19 embryonal carcinoma stem cells into insulin-producing cells promoted by pancreas-conditioned medium. J Tissue Eng Regen Med. 2016; 8, DOI: 10.1002/term.1927: 600-12.
  17. Mehrfarjam Z, Esmaeili F, Shabani L, Ebrahimie E. Induction of pancreatic β cell gene expression in mesenchymal stem cells. Cell Biol Int. 2015; 40: 486-500.
  18. Chen X, Katakowski M, Li Y, Lu D, et al. Human bone marrow stromal cell cultures conditioned by traumatic brain tissue extracts: growth factor production. J Neurosci Res. 2002; 69(5): 687-91.
  19. Maisonpierre PC, Belluscio L, Friedman B, Alderson RF, et al. NT-3, BDNF and NGF in the developing rat nervous system: parallel as well as resiprocal patterns of expression. Neuron. 1990; 5(4): 501-9.
  20. Gouin AC, Bloch GE, Mettling C, Henderson CE. Growth and survival factors of spinal motoneurons. Sciences. 1993; 187: 47-61.
  21. Cruoch MF HK, Garnaut SM, Milburn PJ, Hendry IA. Retrograde axonal transport of the alpha-subunit of the GTP-binding protein GZ in mouse sciatic nerve: a potential pathway for signal transduction in neurons. Neuroscience. 1994; 6: 626-31.
  22. Tapp H, Patt JC, Gruber HE. Adipose-derived stem cells: characterization and current application in orthopaedic tissue repair. Biol Med (Maywood) 2009; 234(1): 1-9.
  23. Rodreguez PAB, GonzalezM.RequejoF. Expression of neurotrophins and their receptors in sciatic nerve of exprimentally diabetic rat. Neurosci Lett. 1995; 200(1): 37-40.
  24. Bain G, Kitchens D, Yao M, Huettner JE, et al. Embryonic stem cells express neuronal properties in vitro. Dev Biol. 1995; 168(2): 342-57.
  25. Esmaeili F, Tiraihi T, Movahedin M, Mowla SJ. Selegiline induces neuronal phenotype and neurotrophins expression in embryonic stem cells. Rejuv Res. 2006; 9(4): 475-84.
  26. Redecker P GD. Synaptophysin in the nervous system and endocrine cells. Acta Histochem Suppl 1992; 42: 33-8.
  27. Shen YC TH, Ruan JW, Liao YC, Chen SF, et al. Genetic and functional analyses of the gene encoding synaptophysin in schizophrenia. Schizophr Res. 2012; 137(1): 14-9.
  28. Tampellini D, Capetillo-Zarate E, Dumont M, Huang Z, et al. Effects of synaptic modulation on β-amyloid, synaptophysin, and memory performance in Alzheimer's disease transgenic mice. J Neurosci. 2010; 30(43): 14299-304.

MacPherson PA Jones S, Pawson PA, Marshall KC, McBurney MW. P19 cells differentiate into glutamatergic and glutamate-responsive neurons in vitro. Neuroscience. 1997; 80(2): 487-99.

-
Cell and Tissue Journal
Volume 7, Issue 4
Spring 2017
Pages 343-353

  • Receive Date 22 December 2017
  • Revise Date 24 July 2017
  • Accept Date 24 July 2017

Home

Guide for Authors

Submit Manuscript

Plagiarism Policy

Contact Us