Cell and Tissue Journal
Quarterly

Evaluation of siRNA Effects on Expression Levels of snail and miR143 in Metastatic Breast Cancer Cells

Document Type : Research - Scientific

Authors

M Sattarivand 1
R Mohammadzadeh 2

1 Department of Biology, Faculty of Basic Sciences, Ahar Branch, Islamic Azad University, Ahar. Iran

2 Department of Biology, Maragheh University, Maragheh, Iran

10.52547/JCT/13.2.151
Abstract
Aim: In the past decades, many efforts have been made with the aim of searching for new tools to treat cancer. In this regard, the discovery, investigation and application of techniques related to small interfering RNAs (siRNA) has been one of the most significant advances in the field of cancer detection and treatment. Small interfering RNA, sometimes known as short interfering RNA or silencing RNA, is usually 21 bp long and interferes with the expression of specific genes with complementary nucleotide sequences and prevents translation by degrading mRNA after transcription. Many studies have shown that siRNAs affect the regulation of the expression of some genes that play a role in cancers. siRNAs are effective on Snail transcription factors, which play an important role in the invasion and metastasis of cancer cells, and miR-143, which plays an important role in the pathogenesis of cancers. miRNAs together with transcription factors can disrupt the biological pathways involved in carcinogenesis. However, the exact effect of siRNA on the expression of snail1 and miRNA-143 genes in breast cancer cells is not completely clear. Based on this, the present study investigated the effects of siRNA on snail1 and miRNA-143 on breast cancer cells.Material and Methods were purchased from Pasteur Institute of Iran. The cells were cultured in RPMI-1640 medium containing 10% FBS. Snail1 gene kit (Santacruz biotechnology, California, USA) was used to treat cancer cells with specific siRNA. The cells were divided into two groups: control (no treatment) and treated cells (transfected with siRNA). In order to determine the effective time, the cells were exposed to a dose of 60 picomoles of siRNA for 24, 48 and 72 hours. Beta actin gene was used as internal control gene. Morphology of MDA-MB-468 metastatic cells were examined using light microscopy before and after specific gene transfection. Cell proliferation was checked by trypan blue staining. Snail1 and miR-143 gene expression levels were evaluated by qRT-PCR. Data were analyzed using t-test. Results: In this study, in MDA-MB-468 breast cancer cells, the relative level of Snail1 gene expression was significantly decreased in the effective time of 48 hours and when exposed to the effective dose of 60 pmol (P < 0.0001). However, the knockdown of Snail1 gene by specific siRNA in MDA-MB-468 cancer cells when exposed to an effective dose of 60 pmol and an effective time of 48 hours caused an increase in the relative expression level of miR-143 gene compared to the control group (P < 0.0001). Also, the growth rate of MDA-MB-468 cancer cells decreased with Snail1 gene knockdown. Conclusion: The results of this research showed that the transfection of MDA-MB-468 breast cancer cells by specific siRNA can successfully reduce the expression level of Snail1 gene and miR-143 gene. Proliferation and invasion of breast cancer cells.

Highlights

-

dor -

مقدمه
   سرطان پستان رایج‫ترین سرطان در میان زنان است  که دارای نرخ مرگ و میر قابل توجهی می‫باشد (1). این سرطان اساسا در اثر تاثیر متقابل وراثت و محیط ایجاد می شود و علائم ظاهری آن شامل برآمدگی و تغییر شکل درسرطان پستان است. این سرطان دارای قدرت متاستازی بالایی بوده و می‌تواند در صورت عدم تشخیص و درمان به‮موقع به بافت‫های دیگر بدن متاستاز یابد و عوارض جبران ناپذیری را برجای گذارد (5-2). بررسی سلولی و مولکولی اتیولوژی سرطان پستان نشانگر آن است که سرطان پستان با فعالیت  RNA های مداخله‌گر کوچک (siRNA) در ارتباط می‫باشد. در واقع siRNA می‌تواند با تنظیم بیان ژن در اتیولوژی سرطان پستان موثر بوده و به‫عنوان ابزاری برای درمان سرطان‫ها به‫ویژه سرطان پستان مورد توجه قرار گیرد )6).  siRNA قادر است بر فاکتورهای رونویسی از جمله فاکتور رونویسی Snail اثر گذارد. خانواده Snail از جمله فاکتورهای رونویسی وابسته به روی می‌باشند که دارای انواع متعددی از جمله Snail1، Snail2 و Snail3 می باشد که در تشکیل لایه مزودرم نقش موثری دارند و از این‫رو در شکل‌گیری ساختار غده پستان نیز تاثیرگذار می‌باشند. نقش Snail در متاستاز سلول‫های متاستاتیک سرطانی با اثر کاهشی آن بر کادهرینE  که از مهم‫ترین عنصر اتصالات سلولی است، ثابت شده است )7). از سوی دیگر امروزه مشخص شده است که انواع میکروRNA ها miRNA)) نیز در تکوین سرطان‫ها به‫ویژه سرطان سینه نقش به‫سزایی دارند. از میان miRNAها، miR-143 می‌تواند با هدف قرار دادن مستقیم چندین mRNA در پاتوژنز سرطان‫ها از جمله سرطان پستان نقش مهمی ایفا نماید (8). همچنین مطالعات نشان داده اند که فاکتور رونویسی Snail  قادر است  بیان برخی ژن‫های miRNA را  تنظیم کند. این نتایج اثبات می‌کنند که فاکتور رونویسی Snail  در تهاجم و متاستاز بسیاری از تومورها به‫ویژه در سرطان‫های اپی‫تلیالی از جمله سرطان پستان نقش قابل توجهی دارد (9،10). در واقع miRNA‌ ها  همراه با عوامل رونویسی در سلول‫های یوکاریوتی بر بیان mRNAها تاثیر گذاشته و مسیرهای بیولوژیکی دخیل در سرطان‫زایی را مختل می‌کنند (11، 12). برخی از مطالعات اخیر نشان داده‌اند که miRNA ها  بیان تعداد زیادی از ژن‫هایی را که در پیشرفت سرطان نقش دارند تنظیم می‌نمایند (13، 14). تحقیقات آزمایشگاهی نشان می‌دهند که Snail ها می‌توانند  به‫طور قابل توجهی تعاملات mRNA/miRNA را در مراحل اولیه متاستاز تغییر و دهند و بر این اساس بر فرآیند متاستاز و مهاری بر بیان ژن تاثیر قابل توجهی داشته باشند (17- 15). و بدین ترتیب به‫کارگیری از RNAهای مختلف می‌تواند به‫عنوان یک ابزار درمانی جهت مهار متاستاز به‫ویژه در سرطان پستان مورد توجه قرار گیرد (20-18).  از طرفی نتایج پژوهش‫ها حاکی از آن است که ارتباط قابل توجهی بین siRNA و miRNA ها وجود دارد (21). مطالعات اخیر نشانگر آنند که siRNA ها می‌توانند باعث افزایش بیان ژن miR-143 گردند و افزایش بیان miR-143 می‌تواند از رشد سلول‫های سرطانی به‫ویژه سلول‫های سرطانی پستان جلوگیری کند (22).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
با توجه به شیوع گسترده سرطان پستان در زنان و قابلیت متاستاز این سرطان به بافت‫های مختلف بدن که آن‫را به‫عنوان یکی از سرطان‫های خطرناک مطرح می‫نماید (1) و نیز با توجه به عوارض گسترده بالینی و اقتصادی حاصل از ابتلا به سرطان پستان در بیماران (2) و همچنین نظر به اینکه مطالعات قبلی در خصوص تداخلات میان siRNA ها و ژن‫های خانواده  Snail و  miR-143 به‫ویژه در سلول‫های سرطانی پستان بسیار محدود می‌باشد، بر این اساس پژوهش حاضر به بررسی ارزیابی اثرات siRNA بر سطح بیان ژن Snail1  و miR-143 در سلول‫های متاستاتیک سرطان پستان می‫پردازد و نتایج حاصل از این پژوهش در حوزه اتیولوژی و مبانی سلولی و مولکولی بوده و می‫تواند به‫عنوان مارکرهای تشخیصی در مدیریت پیشگیری و درمانی سرطان پستان کاربرد داشته باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
مواد و روش‌ها
   در این تحقیق تجربی-آزمایشگاهی رده سلولی سرطانی متاستاتیک سینه (MDA-MB-468) از انستیتو پاستور ایران خریداری شد و در کلیه مراحل اصول اخلاق در پژوهش با توجه به استانداردهای جهانی رعایت شد.
کشت و شمارش سلول‫های سرطانی: جهت کشت سلول‫ها، از محیط کشت RPMI-1640+10% FBS استفاده شد. سلول‫های دفریز شده به فالکون حاوی 10 میلی لیتر محیط RPMI-1640 منتقل شده و به مدت 5 دقیقه در rpm1300 سانتریفیوژ شدند. رسوب سلولی ته فالکون به فلاسک 25 میلی‫متر مربع حاوی 7 تا 10 میلی‫لیتر محیط کشت کامل (RPMI1640 حاوی 10 درصد FBS) منتقل شد و به انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد حاوی 5 رصد دی اکسید کربن انتقال یافت. پس از کشت، شمارش سلولی با لام نئوبار انجام گرفت.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تیمار سلولی: در این تحقیق جهت تیمار سلول‫های سرطانی با siRNA اختصاصی، کیت ژن   Snail1(Santacruz biotechnology California, USA) مورد استفاده قرار گرفت. پس از دریافت کیت، محلول‫های موجود در 80- درجه سانتی‫گراد ذخیره شدند. مطابق دستورالعمل کیت، از آب بدون RNase برای رقیق کردن استوک اصلی استفاده شد. سلول‫ها به دو گروه کنترل (عدم تیمار) و سلول‫های تیمار شده (ترانسفکت شده با siRNA) تقسیم‌بندی شدند. جهت تعیین زمان و دوز موثرsiRNA، ابتدا سه پلیت 6 خانه ای، یکی برای زمان 24 ساعت دیگری برای تایم 48 ساعت و سومی برای زمان 72 ساعت انتخاب شد. در هر پلیت یک چاهک برای ژن snail1 و سه چاهک هم برای کنترل در نظر گرفته شد. دوز در نظرگرفته شده برای این مرحله دوز مشخص و ثابت 60 میکروگرم بر میکرولیتر برای هر ول بود.  از دوز متوسط (PM60 ) استفاده شد. برای این منظور سلول‫های کنترل و تیمار شده در ابتدا تحت تاثیر دوز 60 siRNA در سه زمان 24، 48 و 72 قرار گرفتند و بعد از بررسی بیان ژن، زمان موثر به‮دست آمد و در نهایت در زمان موثر سلول‫ها تحت تاثیر سه دوز 04، 06 و 08 را قرار گرفتند تا دوز موثر نیز به‫دست بیاید. جهت کنترل داخلی از ژن بتا اکتین استفاده شد. در زمان و دوز موثر به‫دست آمده، سلول‫های متاستاتیک MDA-MB-468 قبل و بعد از ترانسفکت ژن اختصاصی مورد نظر، از نظر  مورفولوژی مورد بررسی قرار گرفتند. با استفاده از میکروسکوپ نوری به بررسی تغییرات مورفولوژی حاصل از تیمار در سلول های سرطانی پرداخته شد. برای سنجش قابلیت حیات و رشد سلول‮ها از رنگ آمیزی تریپان بلو و مشاهده با لام نئوبار استفاده شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
استخراج RNA: سلول های MDA-MB-468 در ابتدا در فلاسک‫های کوچک کشت داده شدند. پس از رسیدن به فراوانی مورد نظرسلول‫ها از کف فلاسک جدا شده و بعد از شستشوی سلول ها، مایع رویی را خارج نموده و رسوب سلولی باز شد سپس با استفاده از لام نئوبار تعداد سلول‮ها شمارش شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
از هر رده سلولی 105 × 6 سلول در پلیت‮های 6 خانه‮ای پخش شد. ‬‬‬‬‬‬‬‬
سلول‫ها در مرحله بعد توسط siRNA اختصاصی تیمار شدند. بعد از گذشت زمان انکوباسیون و دوبار شستشو با PBS، در نهایت توسط 100 میکرولیتر محلول  25/0درصد Trypsin/EDTA از کف پلیت جدا شدند و به فالکون منتقل گشته پس از سانتریفیوژ دور rpm 1300 به‫مدت 10 دقیقه، بعد از باز کردن رسوب سلولی، یک میلی لیتر 〖RNX〗^TM-PLUS به رسوب سلولی اضافه شد و بعد از ورتکس کردن به‫مدت 5 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد.در مرحله بعد 200 میکرولیتر کلروفورم اضافه نموده وتیوب حاوی نمونه به‫مدت 5 دقیقه بر روی یخ انکوبه شد. سپس در دور rpm12000 به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ شد. فاز آبی به تیوپ‫های RNase free 5/1 میلی لیتری منتقل نموده و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه شد. سپس به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد انکوباسیون انجام گرفت. بعد از سانتریفیوز در دور rpm12000 به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد به رسوب یک میلی لیتر اتانول 75 درصد سرد اضافه شد و در rpm7500 به‫مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفیوژ انجام شد. رسوب با 50 میکرولیتر آب مقطر حل گشته، سپس خلوص و میزان RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ تعیین شد. فاز آبی به تیوپ های RNase free 5/1 میلی لیتری منتقل نموده و هم حجم آن ایزوپروپانول اضافه شد. سپس به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد انکوباسیون انجام گرفت. بعد از سانتریفیوژ در دور rpm12000 به‫مدت 15 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‫گراد به رسوب یک میلی لیتر اتانول 75 درصد سرد اضافه شد و در rpm7500 به‫مدت 10 دقیقه در 4 درجه سانتی‫گراد سانتریفوژ انجام شد. رسوب با 50 میکرولیتر آب مقطر حل گشته، سپس خلوص و میزان RNA استخراج شده توسط دستگاه نانودراپ تعیین شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
استخراج میکروRNA و سنتز cDNA: برای تهیه اولین رشته cDNA از روی RNA کل استخراج شده در مرحله قبل، از کیت با نام تجاری (First Strand cDNA Synthesis Kit)RevertAid™ محصول کمپانیFermantase استفاده شد. این کیت بر اساس آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ویروس سرطان MoloneyMurine که دارای خاصیتRNase  خفیفی می‫باشد تهیه شده است. با استفاده از این کیت می‫توان سنتز cDNA از روی الگوهای بزرگ حتی kb 13 را نیز انجام داد. سنتز رشته cDNA  به‫کمک پرایمرهگزامر انجام شد که به‫صورت غیر اختصاصی در نقاط مختلفی از رشته RNA اتصال می‫یابد و در نتیجه تمامی رشته‫های RNA (اعم از mRNA,tRNA و rRNA) به‫عنوان الگوی سنتز مورد استفاده قرار می‫گیرند. بدین منظور جهت سنتز cDNA ابتدا از محیط کشت سلولی Total RNA استخراج شد. برای این منظور  از کیتmiRCURY RNA Isolation kit (Exiqon, Vedbaek, Denmark)   استفاده شد. مطابق دستورالعمل جهت کنترل کیفی و خلوص Total RNA استخراج شده از Unisp RNA استفاده شد. پس از استخراجTotal RNA ، سنتز cDNA انجام گرفت. بدین‫منظور از کیت(Thermofisher scientific &USA) cDNA synthesis kit استفاده شد. ابتدا Total RNA رقیق شده و سپس محلول‌های واکنش شامل بافر واکنش آنزیمی و آب بدون نوکلئاز به آن اضافه شده و 60 دقیقه در دمای 45 درجه سانتی‫گراد و 5 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‫گراد انکوبه شد و سپس سریعا در 4 درجه سانتی‮گراد خنک شد.  ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
ارزبابی بیان ژنی: پس از سنتز cDNA بیان ژنی با استفاده از qRT PCR  ارزیابی شد. جهت انجام qRT-PCR از PCR panels مخصوص miRNA استفاده شده جهت کنترل داخلی و کالیبراتور داخل پلیت از Unisp6 RNA استفاده شد. برای انجام RT- PCR ابتدا PCR SYBER Green master mix را با آب بدون نوکلئاز ترکیب کرده و سپس cDNA را به آن اضافه شد. پرایمرهای طراحی شده برای miRNAs از نوع Stem loop می باشند. لازم به ذکر می‫باشد که تمام مواد در حین انجام کار و قبل آن باید روی یخ باشد. در مراحل عمل برای ارزیابی بیان نسبی هر ژن ابتدا مخلوطی از مواد مندرج در جدول 1 تهیه و پس از توزیع 19 میکرولیتر از مخلوط در لوله‌های مخصوص دستگاه، به‫هر کدام 1 میکرولیتر از  cDNAاضافه شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 

جدول 1: مقادیر مورد استفاده در واکنش PCR
مقدار    اجزای واکنش
10µL    Syber Green PCR Master Mix 2X
3/0µL    Forward Primer (5pmol/ 1µl)
3/0µL    Reverse Primer (5pmol/ 1µl)
1µL    cDNA(20ng)
4/8µL    DEPC Treated Water

به‫عنوان بلانک تیوبی که حاوی تمام مواد موجود در واکنش به جز cDNA بود مورد استفاده قرار گرفت و به‫جای cDNA، به تیوب مربوطه DEPC Water اضافه شد. همه مراحل بر روی یخ انجام شده و جهت جلوگیری از آلودگی در زیر هود لامینار انجام گرفت. سیکل‌هایPCR  برای تمام ژن‌ها بر اساس پروتکل جدول 2 انجام شدند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

جدول 1: پروتکل سیکل‌های به کار برده شده برای انجام Real-Time PCR
Cycle Point    Cycle
95 °C, 10 min     Hold  step
Step 1 at  95°C, hold 20 secs    Cycling (45 repeats)
Step 2 at 59°C, hold 50 secs
Step 3 at 72°C, hold 20 secs    
پرایمرهای مورد استفاده توسط نرم افزار پرایمر تری(Primer3) طراحی شد و به صورت آنلاین در سایت NCBI تایید شد (جدول3).


جدول 2: توالی پرایمرهای مورد استفاده
ترادف    FW/RV    Gene
5’-GGTTCTTCTGCGCTACTGCTG-3’    FW    Snail1
5’-GTCGTAGGGCTGCTGGAAGG-3’    RV    
5’-TCCCTGGAGAAGAGCTACG-3’    FW    β-actin
5’-GTAGTTTCGTGGATGCCACA-3’    RV    

در جدول فوق  FWو RV به‌ترتیب بیانگر Forward و Reverse می‌باشند. 
مقادیر و مواد مورد استفاده برای سنتز cDNA میکروRNA در جدول 4 نشان داده شده است.

جدول 4 : مقادیر و مواد مورد استفاده برای سنتز cDNA میکروRNA
مقدار    اجزای واکنش    
lµ4    5x Reaction buffer    
lµ9    Nuclease-free water    
lµ1    Enzyme mix    
lµ2    Synthetic RNA spike ins, optional
replace with H2O if omitted    
lµ4    Template total RNA    
جدول 5 میزان مواد به‫کار برده شده برای انجام Real-Time PCR میکروRNA را نشان می‭‮دهد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬

جدول5: مواد به‫کار برده شده برای انجام Real-Time PCR میکروRNA‬‬‬‬‬
مقدار    اجزای واکنش
lµ5    PCR Master mix
lµ1    PCR primer mix
lµ4    Diluted cDNA template

جدول 6 بیانگر پروتکل سیکل های به کار برده شده برای انجام Real-Time PCR میکروRNA است.

جدول6: پروتکل سیکل های به کار برده شده برای انجام Real-Time PCR میکروRNA
Cycle Point    Cycle
95° C, 10 min 0 secs    Hold  step
95° C, hold 10 secs    Cycling (45 repeats)
60° C, hold 60 secs
1.6 ̊C/s    
ramp-rate
جهت محاسبه بیان ژن از فرمول زیر استفاده شد:
 
 در پایان قبل از آنالیز داده ها، منحنی‌های ذوب به‫دست آمده از هر واکنش PCR جهت تایید صحت پیک مربوط به‫هر ژن مورد نظر و همچنین فقدان پرایمر دایمر بررسی شد. پرایمرهای طراحی شده برای miRNAs از نوع Stem loop بود. جهت محاسبه بیان ژنی از فرمول 2-ΔΔCt استفاده شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
3-آنالیز آماری
آنالیز آماری با استفاده از نرم افزار GraphPad Prism 6 صورت گرفت، شاخص‌های مرکزی شامل میانگین و انحراف معیار توسط آمار توصیفی به‫دست آمد. برای مقایسه گروه‌ها از آنالیز آماری t تست استفاده شد. سطح معنی‫داری 05/0p< در نظر گرفته شد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
    نتایج
جهت تعیین زمان و دوز موثر منحنی آمپلی فیکاسیون و ذوب ژن بتا اکتین و ژن Snaill به‫دست آمد (شکل  1و2).‬‬‬‬‬

 

الف

 


ب          
شکل 1: منحنی آمپلی فیکاسیون و ذوب  ژن بتا اکتین. الف) منحنی آمپلی فیکاسیون ژن بتا اکتین در سلول‫های تیمارشده و تیمارنشده با siRNA اختصاصی ژن Snail1 در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت و غلظت‌های 40، 60 و 80 پیکومول ب) منحنی ذوب ژن بتا اکتین در سلول‫های تیمار شده و تیمار نشده با siRNA اختصاصی ژن  Snail1در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت و غلظت‌های 40، 60 و 80 پیکومول در دستگاه Rotor-Gene 6000 . ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
الف                                                                          ب                      
شکل2:  منحنی آمپلی فیکاسیون و ذوب ژن Snail1 . الف) منحنی آمپلی فیکاسیون ژن snail1 در سلول‫های تیمار شده و تیمار نشده با siRNA اختصاصی ژن Snail1 در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت و غلظت‌های 40، 60 و 80 پیکومول ب) منحنی ذوب ژن Snail1 در سلول‫های تیمار شده و تیمار نشده با siRNA اختصاصی ژن Snail1 در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت و غلظت‌های 40، 60 و 80 پیکومول در دستگاه Rotor-Gene 6000‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نتایج حاصل از بررسی siRNA اختصاصی بر بیان ژن Snail1 نشان داد که سطح نسبی بیان ژن Snail1 در سلول‫های آدنوکارسینومای سینه در زمان موثر 48 ساعت و دوز موثر با غلظت 60 پیکومول دچار کاهش معنی‫داری شد (05/0p<). درصد نسبی بیان ژن Snail1 در زمان‌های 24، 48 و 72 ساعت به‮ترتیب 29، 32 و 113 درصد بود. همچنین درصد بیان نسبی mRNA در ژن Snail1 در غلظت‌های 04، 06 و 08  پیکومول به‫ترتیب 58 ، 42 و 16 درصد بود. از سویی، سطح بیان ژن بتا اکتین جهت آنالیز کردن داده‫ها به‫کار برده شد (نمودار1 و 2).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 

نمودار 1: زمان موثر سرکوب ژن Snail1 توسط siRNA در رده سلولیMDA-MB-468. سلول‫ها با غلظت 60 پیکومول از siRNA ترانسفکت شده و بعد از 24، 48 و 72 ساعت، کل RNA سلول استخراج شده و سطح بیان نسبی mRNA در مقایسه با بتا اکتین ارزیابی شده است. داده‌ها به‫صورت mean  ±  SD  نشان داده شده‮اند. 1000/0< p در مقایسه با  کنترل می‌باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
نمودار 2: دوز موثر سرکوب ژن Snail1 توسط siRNA در رده سلولیMDA-MB-468  . سلول‫ها با غلظت‌های 40، 60 و 80 پیکومول siRNA ترانسفکت شده و بعد از 48 ساعت کل RNA سلول استخراج شده و سطح بیان نسبی mRNA در مقایسه با بتا اکتین (کنترل داخلی) بارزیابی شده است. داده‌ها به‫صورت mean  ±  SD  نشان داده شده اند. 0001/<0 p در مقایسه با کنترل می‌باشد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 
نتایج حاصل از بررسی تاثیر  siRNAاختصاصی ژن Snail1 بر مورفولوژی سلول‫های MDA-MB-468 نشان دادند که میزان رشد سلول‫های سرطانی با ناک داون ژن Snail1 کاهش پیدا می‌کند.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 

 

 

 

شکل 3: تاثیر siRNA ژن Snail1 بر شکل ظاهری سلول‫ها در رده سلولی MDA-MB-468 سرطان سینه. A. تصویر میکروسکوپی سلول‫های تیمار نشده با siRNA با عدسی 40. B. تصویر میکروسکوپی سلول‫های تیمار شده با siRNA اختصاصی ژن snail1 با عدسی 40.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نتایج حاصل از ارزیابی ناک داون ژن Snail1 توسط siRNAی اختصاصی نشان دادند که ناک داون این ژن در سلول‫های متاستاتیک سرطان سبب افزایش بیان نسبی miR-143  در دوز و زمان موثر در مقایسه با سلول‫های تیمار نشده می‫شود (شکل 4 و نمودار 3). ‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

 
شکل 4: منحنی آمپلی فیکاسیون و ذوب  miR-143. الف) منحنی ذوب miR-143 در سلول‫های تیمار شده و تیمار نشده با siRNA اختصاصی ژن snail1 ب) منحنی آمپلی فیکاسیون miR-143 در سلول‫های تریت شده و تریت نشده با siRNA اختصاصی ژن snail1 در دستگاه Rotor-Gene 6000 .‬‬‬‬‬‬‬‬

 

 

 

 

 


نمودار3: تاثیر siRNA ژن Snail1 بر بیان miR-143 در سلول‫های MDA-MB-468. سطح بیان نسبی miR-143 در سلول‫های تیمار شده با غلظت 60 پیکومول siRNA در مقایسه با سلول‫های تیمار نشده مطرح شده و داده‌ها به‫صورت mean  ±  SD  نشان داده شده‮اند. ‮0001/0


    بحث 
   نتایج این تحقیق نشان دادند که ژن snail1 در رده سلولی متاستاتیک سرطان سینه بیان می‌شود و در اثر ناک داون این ژن با siRNA اختصاصی، سطح بیان آن کاهش یافته و در مقابل سطح بیان miR-143 دچار افزایش می‮شود و بدین‫ترتیب این امر به‫طور موفقیت آمیزی سبب کاهش تکثیر و تهاجم سلول‫های سرطان سینه می‫شود. نتایج این پژوهش نشان می‮دهند که اثرات عملکرد میکروRNAها در درمان و کنترل سلول‫های سرطانی به‫ویژه سلول‫های سرطانی سینه اهمیت خاصی دارد.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
 در واقع سرطان پستان، دومین علت رایج مرگ ناشی از سرطان است و بر اساس آمارهای سازمان جهانی بهداشت از هر8 تا 10 زن یک نفر دچار سرطان پستان می‫شوند و مارکرهای تشخیصی این سرطان می‫تواند سهم به‫سزایی در تشخیص و پیشگیری از آن ایفا نماید (4-1). همچنین عود موضعی و ویژگی متاستاتیک این سرطان از بارزترین ویژگی‫های آن می‫باشد که بر این اساس در مطالعه حاضر از رده سلولی متاستاتیک استفاده شده تا اثرات میکروRNA و ژن snail1 بر این ویژگی مورد بررسی قرار گیرد. در حقیقت روشن ساختن نقش مارکرهای اختصاصی سرطان سینه از موضوعات مهم برای تشخیص و پیشگیری و درمان سرطان سینه است و در همین راستا  میکروRNA‌ها به‫عنوان مهم‫ترین ژن‌های محافظت شده تنظیم کننده مرتبط با فرایندهای فیزیولوژیک و پاتولوژیک مطرح می باشند که نقش اساسی در تمایز، تکثیر و رگ‫زایی و نیز در فرآیند متابولیسم سرطان بازی می‌کند) 24-22). بر همین مبنا در مطالعه حاضر miRNA-143 مورد تحقیق قرار گرفته است. تحقیقات نشان داده اند که siRNA اثرات مهمی بر فاکتور رونویسی دارد. در واقع و موافق با یافته‫های پژوهشی تحقیق حاضر، نتایج پژوهشی نشان داده‫اند که siRNA در رده‫ی سلولی سرطان سینه انسان (MDA-MB-231) و نیز سلول‫های سرطانی دهانه رحم (HeLa) به‫ترتیب از طریق سرکوب بیان mRNA PLK1  و HSF1 مانع از رشد سلول سرطانی می‌شود (25). مطالعات قبلی نشان داده‫اند که snail1 نقش اساسی در پیشرفت انواع سرطان‌ها از نظر ایجاد متاستازی، مهار آپوپتوزیس و چرخه سلولی در  کارسینومای سینه (26) و تخمدان (27) ، ملانوما (28)، کارسینومای سنگفرشی دهان (29) دارد. در بیشتر سرطان‌ها افزایش بیان snail همراه با کاهش بیان  کادهرین E بوده )30( و بنابراین snail به‫عنوان رده های سلولی معده، کبد، کولون، تخمدان و پستان موجب مهار کادهرین E و القای تهاجم در سلول می‫شود (33-31). نتایج یک تحقیق نشان می‫دهند که در سرطان پستان بیان زیاد snail موجب سرکوب بیان کلودین -1  (Claudin-1)  که یک پروتئین اینتگرال غشایی است، می‫شود و در نتیجه موجب پیشرفت تومور می‫شود (34) و بالطبع کاهش بیان آن در پیش‫گیری از تکوین تومور نقش مهمی بازی می‫کند. مطالعه‫ی دیگری نشان داده که با ترانسفکت کردن سلول‫های سرطانی پستان با siRNA موجب سرکوب بیان ژن snail1 و توقف چرخه‫ی سلولی و مهار سرطان می‫شود (17). در تحقیقی در خصوص  بررسی مکانیسم اثر siRNA بر سلول‫های سرطانی، در آزمایشی چهار توالی اختصاصی STAT6 مخصوص siRNA در محیط in vitro و با استفاده از رده‫های سلولی ادنوکارسینومای کولون انسان و رده سلولی سرطان سینه مورد بررسی قرار گرفته و نتایج نشان دادند که خاموشی  STAT6 توسط siRNA به‫طور قابل توجهی رویدادهای آپوپتوتیک را القا و تعداد سلول‫های سرطانی را در مدت زمان کوتاهی کاهش می‫دهد (35). بنابراین هدف استفاده از siRNA در مطالعه‫ی حاضر مهار و خاموش کردن بیان ژن snail بوده است. از طرفی مطالعات مختلف در مورد میکروRNAها  نشان داده‫اند که miR-143 از پیشرفت سرطان همانند سرطان معده و پروستات جلوگیری می‌کند و سطح بیان miR-143 در بسیاری از تومورها پایین می باشد بود که نشانگر  نقش مهاری این میکروRNA در پیشرفت تومور است (38-36). همچنین یافته های پژوهشی نشان داده اند که  miR-143با تنظیم بالادست، بیان p-ERK5 ، ERK5 (extracellular signal-regulated kinase 5 )، p-MAP3K7، MAP3K7  (mitogen-activated protein 3 kinase 7) و cyclin D1 و همچنین قابلیت زنده ماندن سلول را در سلول‫های MCF-7 کاهش می‫دهد  در حالی‫که اثر miR-143 با تنظیم پایین دست سبب افزایش زنده مانی می‫شود. بدین‫ترتیب به‫نظر می آید کهERK5  و MAP3K7  ممکن است ژن های هدف     miR-143 باشند (39)  Snailنقش کلیدی در تنظیم انتقال اپی‫تلیال به مزانشیمی ایفا می‫کند، که مکانیسم اصلی مسئول پیشرفت و متاستاز تومورهای اپی‫تلیال است. با این وجود، فرآیندهای مختلفی را که مسئول رشد تومور هستند، مانند فعالیت سلول‫های بنیادی سرطانی، کنترل متابولیسم سلولی و تنظیم تمایز، تنظیم می‫کند. پروتئین‫ها و microRNA های مختلف ممکن است سطح SNAIL را تنظیم کنند و SNAIL ممکن است تنظیم کننده مهم بیان microRNA نیز باشد. تعامل بین SNAIL، microRNA ها، RNA های طولانی غیر کد کننده و RNA های حلقوی یک رویداد کلیدی در تنظیم رشد و متاستاز تومور است (40) .همچنین درباره مکانیسم اثر میکروRNAها، تحقیقات ثابت کرده‫اند که ترکیبات siRNA/miRNA با سایرعوامل ضد سرطان می‮توانند برای درمان مورد استفاده قرار گیرند (14) درمان‫های ترکیبی متشکل از ANRis دارای پتانسیل عظیمی در درمان سرطان هستند  زیرا می‫توانند مجموعه خاصی از آنکوژن‫ها را دقیقا خاموش کرده و مسیرهای متعدد بیماری مرتبط را هدف قرار می‌دهد (42).‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
  نتیجه‌گیری
   در مجموع نتایج حاصل از این پژوهش نشان دادند که ترانسفکت سلول‫های سرطان سینه توسط siRNA اختصاصی با کاهش سطح نسبی بیان ژن snail1 و افزایش سطح نسبی بیان miR-143 می‫تواند به‫طور موفقیت آمیزی سبب کاهش تکثیر و تهاجم سلول‫های سرطان سینه شود و این امر می‫تواند در به‫کارگیری از روش‫های سلولی و مولکولی در درمان سرطان سینه نقش مهمی ایفا نماید.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬
تشکر و قدردانی
   این پژوهش با پشتیبانی معاونت محترم پژوهشی دانشگاه آزاد اسلامی واحد اهر انجام گرفته و بدین‫وسیله از زحمات این معاونت تقدیر و تشکر به‫عمل می‮آید.‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

-

  1. Malthaner RA, Wong RK, Rumble RB, Zuraw L, Gastrointestinal Cancer Disease Site Group of Cancer Care Ontario's Program in Evidence-based Care. Neoadjuvant or adjuvant therapy for resectable esophageal cancer: a systematic review and meta-analysis. BMC medicine. 2004; 2(1):35.
  2. Jin L, Han B, Siegel E, Cui Y, Giuliano A, Cui X. Breast cancer lung metastasis: Molecular biology and therapeutic implications. Cancer Biol Ther. 2018;19(10): 858-868.
  3. Gray JM, Rasanayagam S, Engel C, Rizzo J. State of the evidence 2017: an update on the connection between breast cancer and the environment. Environ Health. 2017;16(1): 94.
  4. Antoniou A, Easton D. Models of genetic susceptibility to breast cancer. Oncogene. 2006; 25(43): 5898-905.
  5. Mustafa M, Nornazirah A, Salih F, Illzam E, Suleiman M, Sharifa A. Breast cancer: detection markers, prognosis, and prevention. IOSR Journal of Dental and Medical Sciences. 2016; 15(08): 73-80
  6. Yu R, Jih G, Iglesias N, Moazed D. Determinants of heterochromatic siRNA biogenesis and function. Molecular cell. 2014; 53(2): 262-76.
  7. Thuault S, Tan E-J, Peinado H, Cano A, Heldin C-H, Moustakas A. HMGA2 and Smads co-regulate SNAIL1 expression during induction of epithelial-to-mesenchymal transition. Journal of Biological Chemistry. 2008; 283(48): 33437-46.
  8. Karimi L, Mansoori B, Mohammadi A, Aghapour M, Baradaran B. Function of microRNA-143 in different signal pathways in cancer: New insights into cancer therapy. Biomedicine & Pharmacotherapy. 2017; 91:121-31.
  9. Musavi Shenas SM, Mansoori B, Mohammadi A, Salehi S, Kaffash B, Talebi B, Babaloo Z, Shanehbandi D, Baradaran B. SiRNA-mediated silencing of Snail-1 induces apoptosis and alters micro RNA expression in human urinary bladder cancer cell line. Artificial cells, nanomedicine, and biotechnology. 2017; 45(5): 969-74.
  10. Fu M, Blackshear PJ. RNA-binding proteins in immune regulation: a focus on CCCH zinc finger proteins. Nat Rev Immunol. 2017; 17(2): 130-143.
  11. Lila E. Mullany, Jennifer S. Herrick, Roger K. Wolff, John R. Stevens, Wade Samowitz, Martha L. Slattery: Transcription factor microRNA associations and their impact on colorectal cancer survival. 2017: 56(11): 2512–2526.
  12. Li F, Zhao H, Su M, Xie W, Fang Y, Du Y, Yu Z, Hou L, Tan W. HnRNP-F regulates EMT in bladder cancer by mediating the stabilization of Snail1 mRNA by binding to its 3' UTR. EBioMedicine. 2019; 45:208-219.
  13. Huang S, Wu S, Ding J, Lin J, Wei L, Gu J, He X. MicroRNA-181a modulates gene expression of zinc finger family members by directly targeting their coding regions. Nucleic Acids Res. 2010; 38(20): 7211-8.
  14. Huang M, Chen Y, Han D, Lei Z, Chu X. Role of the zinc finger and SCAN domain-containing transcription factors in cancer. Am J Cancer Res. 2019; 9(5): 816-836.
  15. Przygodzka P, Papiewska-Pająk I, Bogusz-Koziarska H, Sochacka E, Boncela J, Kowalska MA. Regulation of miRNAs by Snail during epithelial-to-mesenchymal transition in HT29 colon cancer cells. Scientific reports. 2019; 9(1): 1-1.
  16. Barbu EA, Zhang J, Berenstein EH, Groves JR, Parks LM, Siraganian RP. The transcription factor Zeb2 regulates signaling in mast cells. J Immunol. 2012 15; 188(12): 6278-86.
  17. Aletaha M, Mansoori B, Mohammadi A, Fazeli M, Baradaran B. The Effect of Snail1 Gene Silencing by siRNA in Metastatic Breast Cancer Cell Lines. Iran J Public Health. 2017; 46(5): 659-670.
  18. Zhao W, Hou X, Vick OG, Dong Y. RNA delivery biomaterials for the treatment of genetic and rare diseases. Biomaterials. 2019; 217: 119291.
  19. Mirna M, Paar V, Rezar R, Topf A, Eber M, Hoppe UC, Lichtenauer M, Jung C. MicroRNAs in Inflammatory Heart Diseases and Sepsis-Induced Cardiac Dysfunction: A Potential Scope for the Future? Cells. 2019; 8(11): 1352.
  20. Leng Q, Chen L, Lv Y. RNA-based scaffolds for bone regeneration: application and mechanisms of mRNA, miRNA and siRNA. Theranostics. 2020; 10(7): 3190-3205.
  21. Zhou LL, Dong JL, Huang G, Sun ZL, Wu J. MicroRNA-143 inhibits cell growth by targeting ERK5 and MAP3K7 in breast cancer. Braz J Med Biol Res. 2017 20; 50(8): e5891.
  22. Ng EK, Li R, Shin VY, Siu JM, Ma ES, Kwong A. MicroRNA-143 is downregulated in breast cancer and regulates DNA methyltransferases 3A in breast cancer cells. Tumor Biology. 2014; 35(3): 2591-8.
  23. Karami H, Baradaran B, Esfahani A, Sakhinia M, Sakhinia E. Therapeutic Effects of Myeloid Cell Leukemia-1 siRNA on Human Acute Myeloid Leukemia Cells. Advanced pharmaceutical bulletin. 2014; 4(3): 243-8.
  24. Zaffaroni N, Daidone MG. Survivin expression and resistance to anticancer treatments: perspectives for new therapeutic interventions. Drug resistance updates : reviews and commentaries in antimicrobial and anticancer chemotherapy. 002; 5(2): 65-72.
  25. Hattori Y, Kikuchi T, Ozaki KI, Onishi H. Evaluation of in vitro and in vivo therapeutic antitumor efficacy of transduction of polo-like kinase 1 and heat shock transcription factor1small interfering RNA. Exp Ther Med. 2017; 14(5): 4300-4306.
  26. Martínez-Estrada OM, Cullerés A, Soriano FX, Peinado H, Bolós V, Martínez FO, et al. The transcription factors Slug and Snail act as repressors of Claudin-1 expression in epithelial cells1. Biochemical Journal. 2006; 394(2): 449-57
  27. Kalluri R, Weinberg RA. The basics of epithelial-mesenchymal transition. The Journal of clinical investigation. 2009; 119(6): 1420-8.
  28. Vila-Coro AJ, Rodriguez-Frade JM, Martin De Ana A, Moreno-Ortiz MC, Martinez AC, Mellado M. The chemokine SDF-1alpha triggers CXCR4 receptor dimerization and activates the JAK/STAT pathway. FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology. 1999; 13(13): 1699-7-10.
  29. Müller A, Homey B, Soto H, Ge N, Catron D, Buchanan ME, et al. Involvement of chemokine receptors in breast cancer metastasis. nature. 2001; 410(6824): 50-6.
  30. Yagi H, Tan W, Dillenburg-Pilla P, Armando S, Amornphimoltham P, Simaan M, et al. A synthetic biology approach reveals a CXCR4-G13-Rho signaling axis driving transendothelial migration of metastatic breast cancer cells. Science signaling. 2011; 4(191): ra60.
  31. Liu J-P, Jessell TM. A role for rhoB in the delamination of neural crest cells from the dorsal neural tube. Development. 1998; 125(24): 5055-67.
  32. Barrallo-Gimeno A, Nieto MA. The Snail genes as inducers of cell movement and survival: implications in development and cancer. Development. 005; 132(14): 3151-61.
  33. Peinado H, Portillo F, Cano A. Transcriptional regulation of cadherins during development and carcinogenesis. International Journal of Developmental Biology. 2004; 48(5-6): 365-75.
  34. Martínez-Estrada OM, Cullerés A, Soriano FX, Peinado H, Bolós V, Martínez FO, Reina M, Cano A, Fabre M, Vilaró S. The transcription factors Slug and Snail act as repressors of Claudin-1 expression in epithelial cells. Biochemical Journal. 2006; 394(2): 449-57.
  35. Salguero-Aranda C, Sancho-Mensat D, Canals-Lorente B, Sultan S, Reginald A, Chapman L. STAT6 knockdown using multiple siRNA sequences inhibits proliferation and induces apoptosis of human colorectal and breast cancer cell lines. PLoS One. 2019; 14(5): e0207558.
  36. Wu X-L, Cheng B, Li P-Y, Huang H-J, Zhao Q, Dan Z-L, et al. MicroRNA-143 suppresses gastric cancer cell growth and induces apoptosis by targeting COX-2. World J Gastroenterol. 2013; 19(43): 7758-65.
  37. Wu D, Huang P, Wang L, Zhou Y, Pan H, Qu P. MicroRNA-143 inhibits cell migration and invasion by targeting matrix metalloproteinase 13 in prostate cancer. Molecular medicine reports. 2013; 8(2): 626-30.
  38. Gregersen LH, Jacobsen A, Frankel LB, Wen J, Krogh A, Lund AH. MicroRNA-143 down-regulates Hexokinase 2 in colon cancer cells. BMC cancer. 2012; 12(1): 1-0.
  39. Zhou LL, Dong JL, Huang G, Sun ZL, Wu J. MicroRNA-143 inhibits cell growth by targeting ERK5 and MAP3K7 in breast cancer. Braz J Med Biol Res. 2017; 50(8): e5891.
  40. Skrzypek K, Majka M. Interplay among SNAIL Transcription Factor, MicroRNAs, Long Non-Coding RNAs, and Circular RNAs in the Regulation of Tumor Growth and Metastasis. Cancers (Basel). 2020; 12(1): 209 PMID: 31947678; PMCID: PMC7017348.

41.Gandhi NS, Tekade RK, Chougule MB. Nanocarrier mediated delivery of siRNA/miRNA in combination with chemotherapeutic agents for cancer therapy: current progress and advances. J Control Release. 2014; 194: 238-56.

  1. Wang Y, Xie Y, Kilchrist KV, Li J, Duvall CL, Oupický D. Endosomolytic and Tumor-Penetrating Mesoporous Silica Nanoparticles for siRNA/miRNA Combination Cancer Therapy. ACS Appl Mater Interfaces. 2020; 12(4): 4308-4322.
Cell and Tissue Journal
Volume 13, Issue 2
Summer 2022
Pages 151-166

  • Receive Date 05 September 2022

Home

Guide for Authors

Submit Manuscript

Plagiarism Policy

Contact Us