• مقدمه

باوجود تلاش دانشمندان و پیشرفت علم و تکنولوژی، سرطان هنوز از مهلک‏ترین بیماری‏های بشر است و بنابراین تحقیق برروی این بیماری و راه‏های درمان آن بسیار مورد توجه می‏باشد. لذا شناسایی مکانیسم اثر داروهای ضدسرطانی برای به‏کار بردن موثرتر آن‏ها در درمان انواع سرطان می‏تواند مهم باشد. هسته مهم‏ترین ارگانلی است که در سلول‏های یوکاریوتی وجود دارد و هدف بسیاری از ترکیبات جدید و هم‏چنین داروهای ضدسرطان، هسته سلول می‏باشد.DNA  در داخل هسته سلو‏ل‏های یوکاریوتی در هنگام همانندسازی یا رونویسی برهنه استولی در به‏طور معمول، همراه با پروتئین‏های هیستونی و غیرهیستونی است که باهم ساختارهایی به‏نام نوکلئوزوم را می‏سازند که کروماتین نامیده می‏شوند. ازاین‏رو داروهای ضدتوموری برای انجام عمل خود می‏توانند  DNA را چه به‏صورت تک رشته‏ای یا دو رشته‏ای مورد هدف قرار دهند (3-1).

کومارین‏ها به‏طور گسترده در زمینه زیست‏شناسی، پزشکی و علوم پلی‏مری یافت می‏شوند. شناخته‏شده‏ترین و مهم‏ترین کومارین "وارفارین" است که در دوزهای پایین به‏عنوان رقیق‏کننده خون تجویز می‏شود. کومارین‏های متعددی به‏عنوان دارو در پزشکی معاصر و اخیر استفاده می‏شود. کومارین و مشتقات آن هم‏چنین طیف گسترده‏ای از فعالیت‏های فیزیولوژیکی مختلف ازجمله فعالیت‏های ضدالتهابی، ضدباکتریایی، ضدسرطانی، ضدانعقاد و ضدHIV را نشان می‏دهند.کومارین و مشتقات آن هم‏چنین طیف گسترده‏ای از فعالیت‏های فیزیولوژیکی مختلف ازجمله ضدالتهابی ، ضدباکتریایی ، ضدسرطانی ، ضدلخته شدن، فعالیت‏های ضدHIV، ضدویروسی، ضد ویروسی را نشان می‏دهند (2، 3). آن‏ها هم‏چنین به‏عنوان مواد تشکیل دهنده در عطر، لوازم آرایشی، افزودنی در مواد غذایی، دارویی، در تهیه حشره‏کش‏ها، روشن کننده‏های نوری، و رنگ‏های فلورسنت پراکنده و لیزری استفاده می‏شوند. کومارین‏ها به‏دلیل سمیت و سرطان‏زایی مورد توجه قرار گرفته‏اند. علاوه‏براین، آن‏ها اثرات فتودینامیک را نشان می‌دهند و واسطه‌های مفیدی برای سنتز فوروکومارین‌ها، کرومن‌ها، کومارون‌ها و 2-آسیلرسورسینول‌ها هستند(4، 5).

تترازول‏ها در فارماکوکینتیک و متابولیسم دارورسانی شرکت می‏کنند. بنابراین، آن‏ها همیشه کاندید خوبی برای اتصال و اثر بخشی برروی پروتئین و DNA می‏باشند. 3 -(تترازول-5-ایل) کومارین به‏عنوان ایمیدازوکومارین یک مشتق کومارین است که با موفقیت از طریق دومینو Knoevenagel سنتز می‏شود. این مشتق کومارین در تشکیل رادیکال‏های آزاد در سلول‏های پوستی شرکت می‏کند و باعث آسیب در ساختار DNA و پروتئین در سلول می‏شود که به‏دنبال آن سبب ایجاد سرطان در انسان می‏شود (9-6). بادرنظر گرفتن مطالب گفته شده، هدف از انجام این آزمایش بررسی اثر این مشتق کومارین بر  DNA تک رشته غده تیموس گوساله می‏باشد. استفاده از غده تیموس گوساله به‏علت دارا بودن میزان بالای DNA نسبت به پروتئین این امکان را برای ما فراهم کرد تا اثر 3-(تترازول-5-ایل) کومارین را برروی DNA خالص بررسی کنیم.

• مواد و روش‌ها

3-(تترازول-5-ایل) کومارین به‏عنوان ایمیدازوکومارین یک مشتق کومارین است که از طریق واکنش ترکیب‏های کربونیل‏دار فعالی مانند مشتق‏های ایزاتین، آلدئیدهای آروماتیک با مالونیتریل، سنتز فرآورده را از طریق یک واکنش دومینو چند جزیی (تراکم ناووناگل/حلقه افزایی 1و3-دوقطبی) بدون استفاده از هیچ‏گونه کاتالیزوزی در حلال آب در دمای 50 درجه سانتی‏گراد انجام می‏شود (10). 2 میلی‏گرم از مشتق کومارین با 1 میلی‏لیتر محلول بافر تریس خریداره شده از شرکت مرک آلمان ترکیب نموده و محلول در یخچال نگه‏داری شد. DNA تک رشته غده تیموس از شرکت SIGMA خریداری شد. جهت آماده‏سازی محلول DNA به‏مقدار 2 میلی‏گرم از پودر DNA با 1 میلی‏لیتر بافر تریس 01/0 مولار با 4/7 pH ترکیب و محلول در یخچال نگه‏داری شد.

اسپکتروسکوپی UV/Vis: میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته با استفاده از بافر تریس اسیدی 10 میلی‏مولار (2/7 (pH، در دمای اتاق و به‏دور از نور انجام گرفت. بدین منظور غلظت ثابتی ازDNA تک رشته تهیه و با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین به‏مدت یک ساعت انکوبه و پس از اتمام زمان مورد نظر، به‏منظور مطالعات اسپکتروسکوپی UV-Vis مورد استفاده قرار گرفت.

میزان جذب محلول حاصل از میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته و نیز میزان جذب غلظت‏های مختلف دارو در بافر تریس اسیدی در 210 و 260 نانومتر بااستفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر Carry 100 مدل Bio-Varian ساخت کشور استرالیا خوانده شد و پس از انجام محاسبات لازم منحنی‏های مربوطه رسم شد.

اسپکتروسکوپی فلورسانس: به‏منظور انجام مطالعات اسپکتروسکوپی فلورسانس، ابتدا غلظت ثابتی DNA تک رشته با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در دمای اتاق و به‏دور از نور به‏مدت یک ساعت انکوبه شدند. پس از سپری شدن مدت زمان معین، محلول حاصل از میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته در طول موج 258 نانومتر تهییج و طیف نشر آن‏ها در محدوده 200 تا 700 نانومتر بااستفاده از دستگاه اسپکتروفلوئوریمتر Carry Eclipse مدل Bio-Varian و ساخت کشور استرالیا رسم شد. محلول حاصل از میان‏کنش DNA تک رشته با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین نیز در طول موج 258 نانومتر تهییج و طیف نشر فلورسانس آن در محدوده 550-500 نانومتر رسم شد. هم‏چنین طیف نشر نمونه‏های استاندارد 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در محدوده ذکر شده رسم و سپس از میزان نشر نمونه‏های تیمار شده کسر شد. در طول انجام آزمایشات Slitهای تهییجی و نشری به‏ترتیب 10 و 5 نانومتر در نظر گرفته شد و از کووت کوارتز با عرض یک سانتی‏متر استفاده شد. پس از رسم منحنی‏های حاصل از میان‏کنش ، باتوجه به اطلاعات به‏دست آمده منحنی I_o-I/I_o×100 در برابر غلظت‏های مختلف دارو رسم شد. I_o در این فرمول شدت نشر فلورسانس در غیاب دارو و I شدت نشر فلورسانس در حضور غلظت‏های مختلف دارو می‏باشد. هم‏چنین ثابت معادله اشترن–ولمر (Ksv) برای تخمین میزان خاموشی فلورسانس محاسبه شد (10). در معادله اشترن–ولمر I_o /I = 1+ Ksv [Q] ، I_o  و I به‏ترتیب مقدار نشر ذاتی در غیاب و حضور خاموش‏کننده )3-(تترازول-5-ایل) کومارین(، [Q] غلظت خاموش‏کننده، Ksv ثابت خاموشی اشترن–ولمر فلوئورهای در معرض خاموش‏کننده می‏باشد (12، 13). بر‏این‏اساس Ksv برای 3-(تترازول-5-ایل) کومارین به‏عنوان شیب نمودار I_o /I بر غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین به‏دست آمد.

اسپکتروسکوپی CD: به‏منظور مطالعه تغییر ساختار دوم، پس از میان‏کنش DNA تک رشته با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین،  از اسپکتروسکوپی CD استفاده شد. مطالعه CD در ناحیه Near-UV و به‏ترتیب در محدوده طول موج‏های 200- 320 نانومتر و بااستفاده از دستگاه اسپکتروپلاریمتر AVIV مدل 215 با کووت کوارتز با عرض 1 سانتی‏متر برای ناحیه نزدیک و کووت با عرض 1 میلی‏متر برای ناحیه دور و تحت جریان مداوم گاز ازت و در دمای 23 درجه سانتی‏گراد انجام شد. طیف نمونه‏های میان‏کنش از طیف نمونه‏های استاندارد داروی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین که در همین شرایط رسم شده بودند، کسر و داده‏ها تحت عنوان (Molar Elipticity) و به‏صورت [Ɵ]: deg×cm²×dmol^-1 گزارش شدند (14).

• نتایج

مطالعه میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته با استفاده از روش‏های اسپکتروسکوپی

اسپکتروسکوپی جذبی یکی از روش‏های مناسب برای مطالعه ساختار ماکرومولکول‏ها است. به‏منظور بررسی خصوصیات اسپکتروسکوپی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین، ابتدا طیف جذبی این ترکیب بین طول موج های 200 تا 700 نانومتر رسم شد (شکل1). همان‏طورکه مشاهده می‏شود طیف جذبی این دارو دارای یک قله جذبی بلند در 210 نانومتر و چند قله جذبی کوتاه در 208، 280، 320 و 439 نانومتر می‏باشد. لذا باتوجه به‏طیف جذبی، طول موج 210 نانومتر به‏عنوان جذب شاخص 3-(تترازول-5-ایل) کومارین  انتخاب شد.

مطالعه میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته با استفاده از روش‏های اسپکتروسکوپی

اسپکتروسکوپی جذبی یکی از روش‏های مناسب برای مطالعه ساختار ماکرومولکول‏ها است. به‏منظور بررسی خصوصیات اسپکتروسکوپی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین، ابتدا طیف جذبی این ترکیب بین طول موج های 200 تا 700 نانومتر رسم شد (شکل1). همان‏طورکه مشاهده می‏شود طیف جذبی این دارو دارای یک قله جذبی بلند در 210 نانومتر و چند قله جذبی کوتاه در 208، 280، 320 و 439 نانومتر می‏باشد. لذا باتوجه به‏طیف جذبی، طول موج 210 نانومتر به‏عنوان جذب شاخص 3-(تترازول-5-ایل) کومارین  انتخاب شد.

شکل1. طیف جذبی داروی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در غلظت 50 میکروگرم در میلی‏لیتر.

به‏منظور بررسی تغییرات جذب نمونه‏های انکوبه شده با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین از روش طیف‏سنجی جذبی UV/vis استفاده شد. طیف‏سنجی جذبی روشی مفید برای مطالعه ساختار ماکرومولکول‏های مختلف است و ازطرفی‏دیگر این روش یکی از ساده‏ترین و رایج‏ترین روش‏ها برای مطالعه میان‏کنش لیگاند-ماکرومولکول است.

ابتدا میزان جذب نمونه‏های استاندارد 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در هر غلظت از مقدار جذب نمونه‏های تیمار شده باغلظت مشابه 3-(تترازول-5-ایل) کومارین کسر و نمودار تغییرات جذب DNA تک رشته برحسب غلظت دارو رسم شد.

شکل 2 تغییرات میزان جذب محلول‏های حاصل از میان‏کنش داروی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته در طول موج‏های 260 نانومتر A)) و 210 نانومتر(B) را نشان می‏دهد و همان‏طور که مشاهده می‏شود تغییرات جذب DNA تک رشته یک روند مشابه را طی می‏کنند. شکل A-2 به‏صورت مقایسه‏ای روند تغییرات میزان جذب DNA تک رشته پس از انکوباسیون با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در طول موج 260 نانومتر را نشان می‏دهد. در غلظت‏های مختلف میزان جذب DNA تک رشته افزایش می‏یابد و در غلظت‏های بالاتر نیز هم‏چنین جذب افزایش می‏یابد. درحالی‏که کاهش جذب در اثر میان‏کنش دارو با DNA در هیچ طول موج مشاهده نشد.

همان‏طور که در شکل B-2 مشاهده می‏شود در اثر میان‏کنش داروی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته در طول موج 210 نانومتر در حضور همه غلظت‏های دارو جذب روند افزایشی را نشان می‏دهد. مشاهده دقیق‏تر نشان می‏دهد در غلظت پایین و بالای 3-(تترازول-5-ایل) کومارین میزان جذب در غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین افزایش می‏یابد.

شکل2. مقایسه تغییرات میزان جذب DNA تک رشته پس از انکوباسیون با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در طول موج‏های 260 نانومتر (A) و 210 نانومتر (B).

در ادامه به‏منظور بررسی میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته از روش طیف نشری فلوئورسانس استفاده شد. بدین منظور غلظت معینی از DNA تک رشته به‏طور جداگانه با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در تاریکی و در دمای 23 درجه سانتی‏گراد به‏مدت یک ساعت انکوبه و پس از اتمام زمان، نمونه‏های کنترل و تیمار شده در طول موج 258 نانومتر تهییج و طیف جذبی آن‏ها رسم شد. سپس میزان جذب فلورسانس نمونه‏های استاندارد دارو در هر غلظت از میزان جذب نمونه‏های تیمار شده با دارو در همان غلظت کسر و نمودار مربوط به DNA تک رشته در محدوده 550-500 نانومتر رسم شد (شکل 3).

شکل 3. نمودار تغییرات طیف جذبی (A) DNA تیمار شده با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین و پس از برانگیخته شدن در طول موج 258 نانومتر. شماره‏های 1 تا 6 به‏ترتیب غلظت‏های 0، 25/6، 50/12 ، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی‏لیتر 3-(تترازول-5-ایل) کومارین می‏باشند. (B) تغییرات- I / I_o × 100  I_o DNA تک رشته بر حسب غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین (D) نمودار اشترن-ولمر DNA تک رشته.

همان‏طورکه در شکل 3 مشاهده می‏شود، در طول موج تهییج 258 نانومتر و در غیاب 3-(تترازول-5-ایل) کومارین، DNA تک رشته دارای یک قله جذبی در 520 نانومتر هستند که مربوط به کروموفورهای DNA (بازهای DNA) است و باافزایش غلظت 3-(تترازول-5-ایل) کومارین، میزان جذب کروموفورهای DNA تک رشته افزایش می‏یابد بدون این‏که در طیف DNA تک رشته جابه‏جایی صورت گیرد.

باتوجه به نتایج حاصل از فلورسانس، منحنی- I / I_o × 100  I_o مربوط به DNA تک رشته در مقابل غلظت‏های مختلف دارو نیز رسم شد. همان‏طورکه در شکل B-3 نشان داده شده است،I_o  شدت نشر فلورسانس نمونه DNA تک رشته در غیاب 3-(تترازول-5-ایل) کومارین و I شدت نشر فلورسانس نمونه DNA تک رشته در حضور غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین است. مشاهده می‏شود که در غلظت پایین 3-(تترازول-5-ایل) کومارین (50/12 میکروگرم در میلی‏لیتر)، تمایل دارو برای DNA تک رشته تقریبا کم است و در غلظت‏های بالاتر (100-50 میکروگرم در میلی‏لیتر) DNA تک رشته تمایل بیش‏تری را به 3-(تترازول-5-ایل) کومارین نشان می‏دهد. شکل C-3 نمودار اشترن-ولمر را نشان می‏دهد که نشان‏دهنده اثر خاموش‏کنندگی (Quenching) داروی 3-(تترازول-5-ایل) کومارین است. شیب این نمودار همان ثابت اشترن-ولمر است که به‏صورت مولار بیان می‏شود و مقادیر آن برای DNA تک رشته برابر M^-1 10³×42/1 می‏باشد (شکل 3) که نشان‏دهنده این است که دارو تمایل زیادی به DNA تک رشته دارد. شکل 4 ثابت اتصال 3-(1H-Tetrazol-5-yl) کومارین به DNA تک رشته‏ایM^-1 10³×35/68Ka= و تعداد جایگاه اتصال 72/n=  را نشان می‏دهد (شکل 4).

شکل4. ثابت اتصال Ka و تعداد محل اتصال n در دمای 25 درجه سانتی‏گراد.

به‌منظور مطالعه تاثیر 3-(تترازول-5-ایل) کومارین بر ساختار دوم مولکول DNA تک رشته از روش دورنگ‌نمایی حلقوی (CD) در محدوده فرابنفش نزدیک استفاده شد. بدین منظور DNA تک رشته با غلظت‌های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در دمای اتاق و به‌دور از نوربه مدت یک ساعت انکوبه شدند. پس از گذشت زمان معین، طیف CD نمونه‌ها در غیاب DNA تک رشته رسم شد. سپس طیف CD غلظت‌های مختلف دارو در هر غلظت از طیف نمونه‌های تیمار شده با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در همان غلظت کسر شد و منحنی مربوطه رسم شد (شکل5). همان‌طورکه در شکل مشاهده می‌شود، طیف DNA تک رشته در غیاب 3-(تترازول-5-ایل) کومارین دارای دو ناحیه مثبت یکی در 220 نانومتر و دیگری در 275 نانومتر و یک ناحیه منفی در 245 نانومتر می‌باشد. افزایش غلظت 3-(تترازول-5-ایل) کومارین، elipticity مولکول DNA تک‌رشته در همه نواحی ازجمله در 275، 245 و 220 نانومتر را تحت تاثیر قرار می‌دهد. در 275 نانومتر و در حضور دارو  elipticityافزایش یافته و به‌سمت طول موج‌های کوتاه‌تر جابه‌جا می‌شود. در 245 نانومتر با افزودن بر میزان 3-(تترازول-5-ایل) کومارین elipticity مثبت‌تر شده و نمودار بدون تغییر در طول موج می‌باشد و بالاخره در 220 نانومتر علاوه‌بر افزایش elipticity، مقداری جابه‌جایی به‌سمت طول موج‌های کوتاه‌تر وجود دارد.

شکل5. طیف CD مولکول DNA تک‌رشته در حضور و غیاب غلظت‌های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین  شماره‌های 1 تا 6 به‌ترتیب غلظت‌های 0، 25/6، 50/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی‌لیتر 3-(تترازول-5-ایل) کومارین.

• بحث

فعالیت ضدتوموری مشتقات کومارین طبیعی و مصنوعی به‏طور گسترده مورد بررسی قرار گرفته است و ثابت شده است که کومارین‏ها، بسته به ساختارشان، می‏توانند برروی سلول‏های تومور مختلف توسط مکانیسم عمل مختلف مانند مهار آنزیم تلومراز، مهار فعالیت پروتئین کیناز و کاهش بیان انکوژن عمل می‏کنند هم‏چنین آپوپتوز باواسطه کاسپاز 9 را القا می‏کنند، و با متوقف کردن چرخه سلولی در فاز G0/G1، فاز G2/M، تکثیر سلول‏های سرطانی را سرکوب می‏کنند (15و16).

DNA در هسته سلول‏های یوکاریوت در هنگام همانندسازی برهنه است و ممکن است مورد هدف بسیاری از ترکیبات یا آنزیم‏های مختلف قرار گیرد ولی در حالت معمول برهنه نیست و در اتصال با پروتئین‏های هیستونی و غیرهیستونی است که مجموعا ترکیب نوکلئوپروتئینی به‏نام کروماتین را ایجاد می کند. ازطرفی در ساختار کروماتین، DNA حول اکتامر هیستونی پیچیده و نوکلئوزوم را تشکیل می‏دهد. ترکیبات DNA موجود در هسته سلول از مهم‏ترین اهداف بسیاری از داروهای ضدسرطان پس از ورود آن‏ها به‏درون هسته سلول است و تاکنون مطالعات زیادی در زمینه نحوه اثر داروهای ضدتومور برروی ساختار کروماتین و DNA صورت گرفته است. درمورد اثر 3-(تترازول-5-ایل) کومارین برروی DNA تک رشته اطلاعاتی در دست نیست و داده‏های موجود درخصوص ترکیب نام‏برده برروی ساختار DNA نیز وجود ندارد. به‏همین‏دلیل تصمیم بر آن شد که اثر این دارو بر DNA تک رشته محلول بررسی و نتایج حاصل از میان‏کنش آن با DNA تک رشته مورد بررسی قرار شد. بدین منظور غلظت ثابتی از DNA تک رشته با غلظت‏های مختلف 3-(تترازول-5-ایل) کومارین در دمای اتاق و به‏دور از نور انکوبه و پس از گذشت مدت زمان مورد نظر، مطالعات مختلف اسپکتروسکوپی برروی آن‏ها صورت گرفت.

نتایج به‌دست آمده از افزایش جذب DNA تک رشته در 210 و 260 نانومتر به‏صورت وابسته به غلظت بوده و نشان‏دهنده مشارکت گروه‏های فسفات و بازهای DNA در میان‏کنش با دارو می‏باشد. در غلظت‏های بالا 3-(تترازول-5-ایل) کومارین ساختار DNA تک رشته باز شده و در نتیجه میزان جذب افزایش می‏یابد. شدت افزایش جذب در مورد DNA تک رشته نشان‏دهنده تمایل بیش‏تر دارو برای اتصال به DNA تک رشته است.

اسپکتروسکوپی فلوئورسانس نسبت به طیف سنجی جذبی کارآمدتر، حساس‏تر و از پیچیدگی بیش‏تری برخوردار است. با استفاده از روش اسپکتروسکوپی فلوئورسانس می‏توان اطلاعات مهمی درباره ساختار ماکرومولکول به‏دست آورد (17-19). افزایش شدت نشر فلورسانس DNA تک رشته نشان‏دهنده بازشدن کروموفورهای DNA در حضور 3-(تترازول-5-ایل) کومارین است و نیز خطی بودن منحنی اشترن-ولمر نیز تاییدی براین‏حالت است. منحنی Iₒ-I/Iₒ×100 از DNA تک رشته هم‏چنان نشان‏دهنده تمایل زیاد 3-(تترازول-5-ایل) کومارین به DNA تک رشته است. از طرفی باز شدن کروموفورهای DNA تک رشته می‏تواند به اینترکاله شدن 3-(تترازول-5-ایل) کومارین به‏درون این ساختارها نسبت داده شود. در مطالعه‏ای که مشتقات کومارینی مانند کومارین 35 (Ksv=25.61 ×10³ M^-1) برروی آلبومین سرم گاوی (BSA) انجام شد و هم‏چنین در مطالعه دیگری که به بررسی مشتق دیگر کومارین به‏نام 4-متیل-7-هیدروکسی کومارین در حضور BSA و HSA پرداخته شد، Ksv به‏ترتیب برابر M^-1 10³×80/1 و M^-1 10³×97/4 می‏باشد که به‏این ترتیب 3-(تترازول-5-ایل) کومارین (M^-1 10³×42/1Ksv=) ثابت معادله اشترن – ولمر کم‏تری نسبت به‏این مشتقات کومارینی دارد (20، 21). در مطالعه دیگری که تاثیر کومارین در حضور اتیدیوم برماید و اکریدین اورنج انجام شد Ksv به‏ترتیب برابر M^-1 10³×21/0 و M^-1 10³×56/0 می‏باشد که از Ksv مربوط به 3-(تترازول-5-ایل) کومارین کم‏تر می‏باشد (22) .

طیف سنجی  CDروشی قوی در مطالعه خصوصیات کنفورماسیونی ملکول  DNAتک رشته است و در مطالعه میان‏کنش اسیدهای نوکلئیک با پروتئین‏ها و لیگاندها مورد استفاده قرار می‏گیرد (23-25). تغییر elipticity مولکول DNA در ناحیه 245 نانومتر بیان‏گر تغییر حالت راست‏گردی B-DNA می‏باشد. به‏علاوه میان‏کنش دارو در 220 و 275 نانومتر سبب افزایش elipticity می‏شود. به‏طورکلی تغییرات در 220، 245 و 275 نانومتر نشان‏دهنده تاثیر دارو بر stacking بازها است که سبب تغییر کانفورماسیون B در ساختار DNA و کاهش ساختارهای دوم مولکول DNA و احتمالا تغییر B-DNA به A و یا C-DNA می‏شود.

• نتیجه­گیری

باتوجه به نتایج حاصل از میان‏کنش 3-(تترازول-5-ایل) کومارین با DNA تک رشته که حاکی از تمایل زیاد دارو برای اتصال به DNA تک رشته می‏باشد، احتمالا درگیر شدن DNA تک رشته به‏عنوان یکی از مهم‏ترین و اصلی‏ترین هدف‏های موجود در ساختار کروماتین با 3-(تترازول-5-ایل) کومارین می‏باشد.