مقدمه

توسعه فناوری نانو باعث انتشار قابل‌توجه نانوذرات تولید شده به محیط‌ زیست ازجمله محیط­های آبی و خاکی شده است. به‌منظور حفاظت از سلامت انسان‌ها و محیط‌زیست از تاثیرات طیف وسیعی از نانو ذرات، مطالعات زیادی بر روی ارزیابی سمیت نانوذرات متمرکز شده است (1). نانو ذرات بسته به ترکیب شیمیایی، اندازه و یا شکل ذرات عمل می‏کنند. در حال حاضر بحث گسترده­ای در مورد خطرات و منافع بسیاری از نانوذرات در محیط‌ زیست وجود دارد (2).تیتانیوم (Ti)، نهمین عنصر فراوان است که در پوسته­ی زمین به‌طور وسیعی پراکنده‌شده است. غلظت متوسط تیتانیوم در پوسته زمین 4400 میلی‏گرم بر کیلوگرم می­باشد. تیتانیوم فلزی، اکسید تیتانیوم و تیتانیوم کلرید ترکیباتی هستند که گسترده­ترین مصرف جهانی را در صنایع دارند. نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم به‏علت پایداری بالا ویژگی­های ضدباکتریایی و ویژگی­های فتوکاتالیتیکی، کاربردهای وسیعی دارند (3). کاربردهای درمانی این نانوذرات شامل کشت دندان، شناسایی زیستی برای داروهای ضدسرطان، (4) استفاده در ابزار جراحی (5)، استفاده در لوسین­های پوست بیش‌ازحد رنگ دانه‌دار شده، درمان بیماری­های پوستی مثل آکنه ولگاری 2، کوندیلومای 3 عودکننده، آماس پوست اتوپیک و دیگر بیماری­های غیرپوستی است (3).گل­نازیخی بانام علمی Aptenia cordifolia L  به‏خانواده­ی آیزوآسه  (Aizoaceae)و راسته کاریوفیلالس (Caryophyllales) تعلق دارد. این گیاه دارویی و زینتی به‏شکل گوشتی، بوته­ای شکل با برگ­های سبز قلب مانند، گل­های کوچک و زیبا به‏رنگ قرمز، بنفش و ارغوانی می­باشد که رشد سریعی دارد و دارای متابولیسم اسید کراسولاسه­ای (CAM) است. گل‏ناز یخی به‏خاطر ویژگی‌های دارویی، به‌عنوان ضدالتهاب، ضدمیکروبی و ضدعرق استفاده می­شود.

نانو ذرات در واکنش با گیاهان باعث تغییرات فیزیولوژیکی و ریخت­شناسی متنوعی می‌شوند که بسته به نوع نانوذره و نوع گیاه بسیار متفاوت است (6). اثر نانو ذرات بر گیاهان به انواع گیاهان، مرحله رشد آن‌ها و ویژگی­های طبیعی نانوذرات بستگی دارد. جذب اتمسفری نانو­ فلزات ذرات توسط برگ‌ها به‏اثبات رسیده و توسط فاکتورهای ریخت­شناسی همانند کرک‌ها، وجود و یا عدم وجود هیپودرم و تعداد و وضعیت روزنه­ها تحت تاثیر قرار می­گیرد (7) هم‏چنین تارهای کشنده نقش خود را در جذب ذرات از محیط­های خاکی و آبی ایفا می­کند (8). اخیرا مطالعات زیادی در رابطه با سمیت شدید نانوذرات و اثرات منفی و مثبت آن‌ها گزارش ‌شده است (9). در مطالعه‌ای نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم، جوانه‌زنی بذر و رشد پیاز را در غلظت‌های کم افزایش داد در حالی در غلطت‏های زیاد باعث کاهش جوانه‌زنی و رشد شد، هم‏چنین میزان آنزیم‌های کاتالاز و پراکسیداز در غلظت‌های زیاد افزایش یافت (10). در مطالعه‌ای دیگر نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم در غلظت 100 میلی‌گرم بر لیتر صفات زراعی و فعالیت آنتی‌اکسیدانتی را در گیاه تحت تنش شوری باد رشبو (Dracocephalum moldavica L.) افزایش داد (11). اثرات فیزیولوژیکی محلول‌پاشی مگنیت در گیاه ذرت در نسل اول باعث افزایش بهبود فتوسنتز و مهار H₂O₂ شد درحالی‌که نسل دوم دارای میزان کم پروتئین و کلروفیل و آهن کل زیادی در مقایسه با گیاه کنترل و نسل اول بودند (12). تاثیر محلول‌پاشی نانو کود آهن و روی و همچنین نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم برروی گیاه جو باعث افزایش طول سنبله و تعداد و عم‏لکرد دانه و هم‏چنین افزایش کلروفیل شده است (13). نانوذرات روی در گیاه گوجه‌فرنگی باعث کاهش رشد گیاه و خصوصیات فتوسنتزی و محتوای کلروفیل a و b به‏روشی وابسته به غلظت شد (14).

گل‏ناز یخی به‌عنوان یکی از پرکاربردترین گیاهان در فضای سبز ایران است. با توجه به اهمیت نانو ذرات در دنیای امروز و تاثیر آن‌ها بر گیاهان، این تحقیق به‏مطالعه اثر نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم به‌عنوان نانوذره­ای که گسترده­ترین مصرف جهانی را در صنایع دارد، بر روی ویژگی­های فیزیولوژیکی و تشریحی در گیاه گل­ناز یخی در شرایط محلول‌پاشی می­پردازد. در این پژوهش، توانایی رشد این گیاه زینتی با کشت گسترده و پتانسیل رشد در اقلیم‌های متفاوت در محیط‌های آلوده به دی‌اکسید تیتانیوم مورد بررسی قرار می‌گیرد.

مواد و روش‌ها

روش تهیه نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (TiO2): میزان 25 گرم نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم از شرکت بازرگانی نوترینو تهیه شد. به‏منظور بررسی مکانیسم واکنش، آنالیز FTIR در آزمایشگاه خدماتی دانشکده شیمی تبریز با استفاده از دستگاه FT-IR مدل TENSOR 27 ساخت کشور آلمان، (کمپانی Bruker) مورد استفاده قرار گرفت، همچنین مشخصات نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم تعیین شد که در جدول 1 آمده است (شکل 1).

شکل 1: الگوی FTIR تهیه‌شده از نانو ذرات TiO2

جدول1: مشخصات نانو ذرات TiO2 مورد استفاده.

کشت گیاهان و شیوه محلول‌پاشی: دانه رست‌های گیاه گل‏ناز یخی به‏گلدان‌ها پلاستیکی (در حالت استریل) با قطر دهانه 9 سانتی‌متری و ارتفاع 10 سانتی‌متر منتقل شدند. خاک گلدان‌ها مخلوطی از خاک زراعی، ماسه و خاک‌برگ بود. بعد از رسیدن گیاهان به‏مرحله 4 برگی اعمال تیمار نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در یک طرح کاملا تصادفی در سه تکرار و در چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) به‌صورت دومرتبه در هفته بر روی سطح زیرین و رویی برگ اسپری شد. به‌منظور حفظ رطوبت خاک، آبیاری در حد ظرفیت مزرعه‌ای هرروز یک‌بار انجام می‌شد.

مطالعات فیزیولوژیکی: در بررسی پارامترهای رشدی مولفه‌‌هایی از قبیل وزن‌تر و خشک‌ ریشه و اندام هوایی، ارتفاع گیاهان و سطح برگ اندازه‌گیری شد که از هر تیمار سه تکرار از برگ‌های سوم (دومین برگ از مریستم) و چهارم (اولین برگ از مریستم) انجام گرفت. طول ریشه از ناحیه‌‌ی یقه تا نوک ریشه و طول ساقه از ناحیه‌ی یقه تا نوک جوانه ‌‌انتهایی اندازه‌‌گیری شد. هم‏چنین طول میان گره‌های سوم و چهارم مورد سنجش قرار گرفت. برای اندازه‌‌گیری سطح برگ، از روش ترسیم برگ‌ بر روی کاغذ میلی‌‌متری و شمارش تعداد خانه‌‌ها استفاده شد.در این تحقیق رنگیزه‏های فتوسنتزی (کلروفیل a، b) و متابولیت­های ثانویه از قبیل فنل کل و فلاونوئید کل تحت تاثیر تیمار نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم موردسنجش قرار گرفت.

اندازه­گیری محتوای کلروفیل :‌اندازه‏گیری محتوای کلروفیل به‏روش (15) انجام شد. جذب محلول در طول ‌موج‌های، 653 و 666 نانومتر نسبت به شاهد توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (METASH مدل UV-5100) اندازه­گیری شد. غلظت کلروفیل طبق فرمول­های زیر محاسبه ‌شده و براساس میکروگرم بر گرم وزن‌ تر گزارش شد.

Ca=15.65 A664 - 7.340 A653

Cb=27.05 A653 - 11.21 A666

که در آن‌ها Ca: میزان کلروفیل a          Cb: میزان کلروفیل b       A666: جذب در طول‌موج 666 نانومتر                A653: جذب در طول‌موج 653 نانومتر می­باشد.

اندازه‌گیری فنل و فلاونوئید کل:مقدار 1/0 گرم از نمونه گیاهی در 2 میلی‌‌لیتر متانول 80 درصد در یک هاون چینی سابیده شد. برای سنجش فنل کل جذب محلول‌‌ها در طول‌موج 720 نانومتر اندازه‌‌گیری شد. از گالیک‏اسید با عنوان استاندارد فنل کل استفاده شد و درنهایت، داده‌‌ها بر اساس معادل میکرو‌‌گرم گالیک‌‌‌‌اسید بر گرم وزن‌تر گیاه بیان شد (16). برای سنجش فلاونوئید کل از آلومینیم کلراید 10 درصد و استات پتاسیم 1 مولار استفاده شد. سپس، جذب محلول‌‌ها در طول‌موج 415 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر (METASH مدل UV-5100) اندازه‌‌گیری شد. از کوئرستین به­عنوان استاندارد فلاونوئید کل استفاده شد؛ و درنهایت، داده‌‌ها بر اساس معادل میکرو‌‌گرم بر گرم وزن‌تر گیاه بیان شد (17).

بررسی­های تشریحی گیاه گل‏ناز یخی: برش عرضی نمونه‌ها برای بررسی ساختار تشریحی اندام‌های رویشی نظیر ساقه و ریشه انجام شد. در این روش از بافت‌های تازه و زنده برای برش‏گیری استفاده شد که این کار شامل مراحل برش‏گیری دستی (ساقه از میان گره سوم و ریشه از فاصله یک سانتی‌متری از یقه)، رنگ‌آمیزی مرکب با کارمن زاجی و سبز متیل و تثبیت نمونه‌ها بر روی لام انجام شد و نمونه­ها زیر میکروسکوپ بررسی و اندازه‏گیری قطر دستجات آوندی با سیستم عکس‏برداری و اسکنر لام میکروسکوپ True Chrome Metrics انجام شد. به‌منظور بررسی برگ‌ها شمارش روزنه‌های زیرین و رویین برگ با استفاده از لاک بی‏رنگ و شمارش روزنه‌ها زیر میکروسکوپ انجام گرفت (18).

آنالیز آماری

آنالیز داده‌های آماری براساس طرح کاملا تصادفی با استفاده از نرم‌افزار SPSS و آزمون دانکن در سطح احتمال آماری 05/0p< انجام گرفت. نمودارها نیز با استفاده از نرم‌افزار EXCEL رسم شدند. از هر تیمار سه تکرار مورد بررسی قرار گرفت.

نتایج

نتایج تاثیر نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر پارامترهای رشد در گیاه گل ناز یخی

نتایج آزمون اختلاف معنی‌داری را در میان گیاهان مورد بررسی، از لحاظ طول ریشه نشان داد به‌گونه‌ای که بیش‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم با 11 سانتی‌متر و کم‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد با 9/7 سانتی‌متر مربوط بود؛ اما درمولفه طول اندام هوایی، تغییرات معنی‌دار نبود و در این مولفه بیش‏ترین میانگین از گیاه شاهد با 03/13 سانتی‏متر و کم‏ترین میانگین از تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم با میانگین 33/9 سانتی‌متر حاصل شد. در مورد وزن‌ تر و خشک‌ ریشه و هم‏چنین وزن‌ تر و خشک اندام هوایی بیش‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد و کم‏ترین مقدار نیز به‏گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم تعلق داشت اما تغییرات طبق نتایج آزمون دانکن در سطح احتمال 05/0 معنی‌دار نبود. مقایسه میانگین سطح برگ نیز، در گیاهان مورد بررسی اختلاف معنی‌داری نشان نداد. هم در برگ سوم و هم در برگ چهارم بیش ترین مقدار به‏گیاه شاهد و کم‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار غلظت 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم تعلق داشت و گیاهان تحت تیمار غلظت 01/0 و 03/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بین این گیاهان قرار داشتند. در مورد تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر میان گره‌ها، در میان گره سوم بیش‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد متعلق بود و سایر گیاهان متاثر از غلظت نانوذرات، میانگین خیلی نزدیک به‏هم داشتند و همه گیاهان دارای سطح معنی‌داری a طبق آزمون دانکن بودند، در میان گره چهارم نیز با این‏که تغییرات بین گیاهان معنی‌دار نبود بیش‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد و گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم مربوط بود و گیاهان تحت تیمار 01/0 و 03/0 کوچک‌ترین میان گره را داشتند (شکل 2 و جدول 2، 05/0>p).

شکل 2: تغییرات ویژگی‌های رشدی و ریخت‌شناسی گیاه گل‏ناز یخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم

جدول 2: پارامترهای رشدی گیاه گل‏ناز یخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم 05/0>p

تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر محتوای کلروفیل در گیاه گلناز یخی

نتایج مطالعه پارامترهای فیزیولوژیکی نشان داد تاثیر غلظت نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر محتوای کلروفیل در سطح احتمال 05/0 معنی‌دار بود. در مورد کلروفیل a برگ سوم، بیش‏ترین مقدار از گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (48/40 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) و کم‏ترین مقدار از گیاه تحت تیمار 03/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (62/17 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) به‏دست آمد. در مورد کلروفیل b برگ سوم نیز، بیش‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار 05/0 نانوذره و کم‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد و گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم مربوط بود (شکل 3 الف، 05/0>p). در مورد کلروفیل a برگ چهارم، بیش‏ترین مقدار کلروفیل را گیاه تحت تیمار 03/0 درصد نانوذره (94/76 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) و کم‏ترین مقدار را گیاه شاهد (62/43 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) و گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (01/40 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) داشتند که تفاوت این دو گیاه نسبت به‏هم معنی‌داری نبود. در مورد کلروفیل b نیز در برگ چهارم، بیش‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذره اختصاص داشت (شکل 3 ب، 05/0 >p).

شکل 3: تغییرات مقدار کلروفیل در الف (برگ سوم و ب) برگ چهارم گیاه گل‏ناز یخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم. مقادیر ذکرشده میانگین دوبار تکرار±خطای استاندارد می‌باشد. حروف مشابه در بالای ستون‌ها معرف عدم‏تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد.

تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر محتوای فنل و فلاونوئید در گیاه گل‏ناز یخی

محتوای فنل و فلاونوئید مطابق با آزمون دانکن اختلاف معنی‌داری را در میان گیاهان مورد بررسی نشان داد. بیش‏ترین مقدار فنل در برگ سوم به‏گیاه شاهد (14/401 میکروگرم بر گرم وزن ‌تر) و کم‏ترین مقدار به‏گیاهان تحت تیمار نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم مربوط بود و اما در برگ چهارم بیش‏ترین مقدار فنل از تیمار 05/0 درصد نانوذره (36/401 میکروگرم بر گرم وزن ‌تر) و کم‏ترین مقدار از گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذره (65/371 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) به‏دست آمد (شکل 4 الف، 05/0p<). در مورد محتوی فلاونوئید در برگ سوم، بیش‏ترین مقدار به‏گیاه شاهد و کم‏ترین مقدار به‏گیاهان تحت تیمار نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم تعلق داشت و در مورد محتوای فلاونوئید برگ چهارم نیز، بیش‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذره (58/80 میکروگرم بر گرم وزن‌ تر) و کم‏ترین مقدار به‏گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذره (21/74 میکروگرم برگرم وزن ‌تر) اختصاص داشت (شکل 4 ب 05/0 >p).

شکل 4: الف) تغییرات محتوای فنل و ب) فلاونوئید برگ سوم و چهارم گیاه گل‏ناز یخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم. مقادیر ذکرشده میانگین دو بار تکرار±خطای استاندارد می‌باشد. حروف مشابه در بالای ستون‌ها معرف عدم‏تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد.

تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر ساختار تشریحی گیاه گل‏ناز یخی

اپیدرم برگ گیاه گل‏ناز یخی از سلول‌های سنگ‏فرشی اپیدرمی، روزنه و سلول‌های ذخیره‏کننده­ آب به‌صورت ایدوبلاست تشکیل‌شده است، روزنه­های گیاه گل‏ناز یخی از نوع آنیزوساتیک )citycosinA( بوده و تعداد روزنه­ها در سطح زیرین برگ بیش‏تر است. در برگ سوم گیاهان مورد بررسی در این پژوهش، تعداد روزنه‏های سطح‌ رویی با افزایش تیمار نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم افزایش قابل‌ توجهی نشان نداد اما روزنه‏های سطح زیرین برگ روند روبه‏افزایشی داشت و بیش‏ترین مقدار نیز مربوط به‏تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم با متوسط تعداد 60 و کم‏ترین میانگین به‏گیاه شاهد با تعداد میانگین 35 عدد مربوط بود (شکل 5 الف 05/0>p). در برگ چهارم نیز تعداد روزنه‌ها در تیمارهای مختلف مورد بررسی افزایش یا کاهش چندانی نداشت اما روزنه‌های سطح زیرین با این‏که تفاوت طبق آزمون دانکن معنی‌دار نبود اما یک‌ روند افزایشی نسبت به‏هم نشان دادند (شکل 5 ب 05/0>p). تغییر در تعداد سلول‌های ذخیره‏‏کننده آب در بین گیاهان شاهد و گیاهان تحت ‏تیمار معنی­دار نبود. سلول‌های ذخیره‏کننده آب برگ سوم در سطح روی برگ در همه گیاهان مورد بررسی، چندان نسبت به‏هم تفاوت نداشتند و این سلول‌ها در سطح زیرین برگ بیش‏ترین مقدار را در گیاهان شاهد و گیاهان 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم داشتند (شکل 6 الف 05/0>p). در برگ چهارم، تعداد سلول‌های ذخیره‏کننده آب درگیاهان تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم نسبت به‏سایر گیاهان مورد بررسی هم در سطح روی و هم ‌سطح زیرین برگ افزایش داشت (شکل 6 ب 05/0>p).

   شکل 5: تغییرات تعداد روزنه‌های الف) برگ سوم و ب) برگ چهارم گیاه گل نازیخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم. مقادیر ذکرشده میانگین دوبار تکرار± خطای استاندارد می‌باشد. حروف مشابه در بالای ستون‌ها معرف عدم‏تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد.

شکل 6: تغییرات تعداد سلول‌های ذخیره کننده­ آب الف) برگ سوم و ب) برگ چهارم گیاه گل نازیخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم. مقادیر ذکرشده میانگین دو بار تکرار± خطای استاندارد می‌باشد. حروف مشابه در بالای ستون‌ها معرف عدم تفاوت معنی‌دار بین میانگین‌ها می‌باشد.

در بررسی­های تشریحی برش عرضی ریشه، مطابق (شکل 7 (A-C سلول­های ناحیه­ی پوست در گیاهان شاهد و تحت تنش دارای سلول­های نامنظم است که به‏سمت مرکز بزرگ‌تر شده است. قطر دهانه آوندی در ریشه­ی گیاهان تحت تیمار 05/0 نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم نسبت به‏گیاهان شاهد بیش‏تر بود (شکل 7 O و جدول 3). در برش عرضی ریشه­ی گیاه گل‏ناز یخی وجود کامبیوم­های متوالی مشاهده شد. نتایج حاصل از بررسی­های تشریحی ساقه، نشان‌دهنده‌ی تغییرات تشریحی گیاه گل‏ناز یخی در گیاه شاهد و تحت تیمار نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم می­باشد. در گیاه شاهد قطر ناحیه استوانه آوندی نسبت به‏گیاهان تحت تیمار بیش‏تر بود (شکل 7 D-F) و نیز قطر ناحیه استوانه آوندی در تیمار 05/0 میلی­گرم بر لیتر نانوذرات تیتانیوم نسبت به سایر تیمارها کاهش یافت (شکل 7 D-F). تعداد دستجات آوندی هم در گیاه شاهد و هم گیاه تحت تیمار به‏تعداد 8 عدد بود؛ و تعداد دستجات آوندی پراکنده در ناحیه پوست در تیمار 05/0 نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم، 17 و در تیمار 01/0 نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم، 14 و در گیاه شاهد 17 عدد بود. هم‏چنان که در شکل 7 R دیده می‌شود، قطر دهانه آوندی در تیمار 05/0 نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم کاهش پیداکرده است و احتمالا افزایش ضخامت دیواره به‏علت رسوب لیگنین می­باشد ( جدول 3). از لحاظ وجود تغییر در شکل ساقه تقریبا تغییر خاصی مشاهده نشد.

شکل 7: بررسی تغییرات تشریحی گیاه گل‏ناز یخی تحت تاثیر چهار غلظت (0، 01/0، 03/0، 05/0 درصد) نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم. A: برش عرضی ریشه گیاه شاهد B: برش عرضی ریشه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم C: برش عرضی ریشه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم D: برش عرضی ساقه گیاه شاهد E: برش عرضی ساقه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم F: برش عرضی ساقه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (اشکال A تا F با بزرگ‏نمایی 4X هستند) G: دستجات آوندی در ریشه گیاه شاهد H: دستجات آوندی درریشه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم I: دستجات آوندی در ریشه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم J: استوانه آوندی ساقه گیاه شاهد K: استوانه آوندی ساقه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم L: استوانه آوندی ساقه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (اشکال G تا  L با بزرگ‏نمایی  10X هستند) M: گزیلم و فلوئم ریشه گیاه شاهد N: گزیلم و فلوئم ریشه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم O: گزیلم و فلوئم ریشه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بزرگ‏نمایی X40 P: گزیلم و فلوئم در ساقه گیاه شاهد Q: گزیلم و فلوئم در ساقه گیاه تحت تیمار 01/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم R: گزیلم و فلوئم در ساقه گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم (اشکال M تا R با بزرگ‏نمایی 40X هستند) co: کورتکس xl: گزیلم ph: فلوئم رنگ‌آمیزی با کارمن زاجی و سبز متیل. علامت فلش در تصویر M و O نشان دهنده‌ی فلوئم می‌باشد.

جدول 3: تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم بر شاخص‏های تشریحی گیاه گل‏ناز یخی در غلظت‏های (0، 01/0، 05/0 درصد) 05/0>p

بحث

امروزه استفاده وسیع از نانوذرات در تولید محصولات متعدد باعث ورود این مواد به محیط ‌زیست و تجمع آن‌ها در آب، خاک و زمین شده و نگرانی­هایی در این رابطه به‏وجود آورده است (19). گیاهان جز اصلی اکوسیستم­ها هستند و از طریق جذب و تجمع زیستی نقش مهمی در سرنوشت و انتقال نانوذرات در محیط دارند (20). نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم منجر به اثرات مختلفی بر خصوصیات ریخت‌شناسی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی گیاه می‌شود. نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم می‌تواند به‌عنوان محرک گیاهان در نظر گرفته شود که مکانیسم‌های دفاعی مختلفی را در تحمل گیاهان در برابر عوامل مختلف تنش فعال می‌کند. اثرات منفی و سمی دی‌اکسید تیتانیوم بین بافت‌های گیاهی، مراحل رشد و گونه‌های گیاهی متفاوت براساس غلظت و خواص نانوذرات گزارش‌شده است. اثرات سمی نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم در جو، توتون، پیاز، گندم و spinach (21) گیاهان گزارش‌شده است. به‌طورکلی، یافته‌های فعلی نشان می‌دهد بهره‌وری از گیاهان مقاوم به نانوذرات با اثر سمی یک رویکرد نویدبخش بسیار امیدوارکننده است که از پتانسیل بسیار خوبی برای استفاده گیاهان در پالایش آلودگی محیط می‌باشد، این مسئله در مورد گیاهان غیرخوراکی باقابلیت رشد وسیع در محیط‌های شهری بسیار اهمیت دارد که براساس نتایج این تحقیق گیاه گل‏ناز یخی Aptenia cordifolia با توان تحمل رشد در محیط حاوی نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم این امتیازات را دارد.

در محلول­پاشی نانو ذرات بر گل‏ناز یخی بیش‏ترین مقدار طول ریشه مربوط به تیمار 05/0 درصد نانو ذرات دی‌اکسید تیتانیوم بود. پارامترهای ریخت‌شناسی نظیر وزن‌ تر ریشه و اندام هوایی در گیاهان متاثر از نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم نسبت به گیاه شاهد کاهش نشان داد. مهار رشد ریشه در میان نانوذرات و گیاهان بسیار متفاوت است و به‌طور جزئی به غلظت نانوذرات بستگی دارد (22). با تیمار نانوذرات نقره، نیکل، روی و روی-مس برجوانه زنی گیاه یونجه، روند کاهشی طول ریشه­چه با افزایش غلظت در تمامی نانوذرات افزایش یافت، به‌طوری‌که نانوذره روی-مس بیش‏ترین کاهش و نانوذره نقره کم‏ترین کاهش در طول ریشه­چه را نشان داد (23). تاثیر نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم در سه گونه مختلف مورد بررسی قرارگرفته و اثرات مثبت و خنثی این نانوذره در طول ریشه مشاهده‌ شده است، کاهو اثرات مثبت و منفی طول ریشه را پس از قرار گرفتن در معرض نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم نشان داد. (24). نتایج تحقیقی نشان داد که تیتانیوم و نانوتیتانیوم بر روی حجم ریشه، وزن‌ تر و خشک ساقه، قطر ساقه و زمان تا اولین گل‏دهی تغییر معنی‌دار ایجاد نکرد اما در غلظت­های بالاتر نانوتیتانیوم وزن‌ تر و خشک، کاهش یافت و هم‏چنین تیتانیوم و نانوتیتانیوم برریشه موثرتر از ساقه یا قسمت هوایی بودند (25). در آزمایشی مصرف نانوذرات اکسید روی از طریق افزایش سطح ایندول استیک اسید در ریشه نخود موجب افزایش رشد این گیاه شد (26). کاربرد تیتانیوم در محلول غذایی و یا محلول‌پاشی روی برگ‌های گیاه باعث افزایش زیست‌ توده و رشد گونه­های مختلف گیاهی شده است (27). غلظت مناسب نانو ذرات دی­اکسید تیتانیوم احتمالا می­تواند به‌عنوان محرک­های خارجی برای بهبود رشد ساقه و محتوای اسانس در گیاهان استفاده شود (28). مطالعات دیگر در مورد Nicotiana tabacum نشان داد که قرارگرفتن در معرض دی‌اکسید تیتانیوم اثر منفی بر طول ریشه پس از تیمار داشت (29). در پژوهشی دیگر نانوذرات فلزی باعث افزایش نسبت اندام هوایی به ریشه در کاهو می­شود (30). گزارش ‌شده است که طول ریشه گیاه پیاز، در طی تنش با نانوذرات نقره و در ذرت با نانواکسید آلومینیوم کاهش یافت، دلیل این کاهش را می­توان به کاهش جذب آب و اختلال در تقسیم سلولی نسبت داد (31). نانوذرات ZnO اثر سمیت برروی طول ریشه برنج نشان داده است (32). کاهش رشد گندم و لوبیا در تیمار با نانوذرات مس مشاهده‌شده است (33). نانولوله­های کربنی (CNT) جوانه­زنی و طویل شدن ریشه دانه رست‌های گوجه­فرنگی را بهبود می­دهند (34)؛ و نانوذرات آلومینیوم طویل شدن ریشه تربچه و کلزا را تقویت می­کند (35). در بررسی پارامتر سطح برگ، کاهش سطح برگ در مورد برگ سوم و چهارم در تیمار 05/0 درصد نانوذرات مشاهده شد. مهار سریع رشد برگ و ترشح در مورد گیاهان ذرت بعد از این‏که آن‌ها در معرض رسوب بنتونیت طبیعی یا تولید نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم صنعتی قرارگرفتند، شناسایی شد (36). مطالعات اخیر نشان می­دهد که نانوذره دی‌اکسید تیتانیوم، به‌وسیله پرکردن فضای بین میکروفیبریل­های سلولزی در دیواره سلولی اثر منفی بر رشد برگ، فعالیت هیدروکسی ریشه و تعرق در گیاهچه ذرت دارد (37). نتایج تحقیقات روی گیاه سویا نشان داده است که حرکت تیتانیوم کند است و در اندامی که تحت تیمار قرار می­گیرد موثرتر است (38). بی‌نظمی در مسیر انتقال آب و مواد معدنی یکی از راه­های پیشنهادی برای این‌که نانوذرات چگونه موجب آسیب زدن به‏گیاه می­شود را، بیان می­کند (39). تیمار نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم میزان کلروفیل را در گیاهان تحت تیمار نسبت به گیاه شاهد افزایش داد به‌طوری‌که بیش‏ترین میزان کلروفیل به‏گیاه تحت تیمار 05/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم تعلق داشت. تیتانیوم از دو طریق باعث افزایش فتوسنتز می­شود: اول از طریق تغییر در فعالیت پروتئین‌های دخیل در فتوسنتز، ازجمله فروکتوز 6-1 بی‏فسفاتاز که در چرخه کلوین موثر است (40) و آنزیم‌های لکوگونئوژناز و تغییر در چرخه پنتوز فسفات اکسیداز که در متابولیسم کربوهیدرات نقش دارد و دوم از طریق افزایش کلروفیل که باعث تحریک و افزایش فتوسنتز می­شود (41). نانو دی‌اکسید تیتانیوم به‏علت خواص ویژه الکتریکی، نوری و فوتوکاتالیستی خوبی که دارد کاربرد فراوانی در حوزه­های مختلف ازجمله کشاورزی دارد که این قدرت ناشی از شکل و اندازه ذرات این ماده است. تاثیر نانو دی‌اکسید تیتانیوم برروی کلروپلاست اسفناج زیر نور نشان داد که نانو دی­اکسید تیتانیوم می­تواند از پیری کلروپلاست در مدت‌ زمان زیاد نور محافظت کند. همچنین دی‌اکسید تیتانیوم باعث فعال­تر شدن روبیسکو و روبیسکو کربکسیلاز شده که خود باعث افزایش سرعت واکنش کربن فتوسنتزی می­شود (42). پس از کاربرد نانوذرات تیتانیوم، سرعت فتوسنتز، هدایت آب و سرعت تعرق در برگ‌های گوجه­فرنگی افزایش پیدا کرد (43). رشد گیاه فلفل ناشی از افزایش طول بوته­ها بود که تیتانیوم با افزایش جذب نیتروژن منجر به افزایش فتوسنتز و در نتیجه افزایش طول بوته­های فلفل شد (44). با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم محتوای کاروتنوئیدها، فلاونوئیدها و آنتوسیانین­ها در گیاه زیره سبز افزایش می‌یابد، درحالی‌که گیاه کنترل، کم‏ترین مقدار این صفات را داشت (45).

در برگ سوم بیش‏ترین میزان فنل و فلاونوئید مربوط به گیاه شاهد و در برگ چهارم مربوط به تیمار 05/0 و 03/0 نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بود. علت کاهش میزان فنل و فلاونوئید در برگ سوم در گیاهان تحت تیمار نسبت به شاهد می­تواند به‌کارگیری یک مکانیسم دفاعی بهتر در این گیاه باشد. در نتایج تحقیقی نیز آنزیم کاتالاز در گیاهان تحت تیمار نسبت به گیاه شاهد در گیاه لوبیا کاهش داشت. عمل‏کرد فلاونوئیدها در برگ گیاهان به‌عنوان گیرنده رادیکال‌های آزاد منجر به حفاظت گیاهان در برابر تنش­های مختلف ازجمله تنش اکسیداتیو می­شود (46). در نتایج پژوهش رضوی‏زاده و همکاران (47) نیز افزایش فلاونوئید در تیمار بیست میلی­گرم بر لیتر نقره در گیاه کلزا مشاهده شد. در تحقیقی بر روی گیاه سیاه‌دانه افزایش فلاونوئید در گیاهان تحت تیمار نسبت به گیاه شاهد مشاهده شد. در نتایجی تحقیقی تاثیر سوسپانسیون‌های نانو ذرات اکسید روی برروی دانه رست annuum Capsicumباعث مهار رشد دانه رست و تجمع ترکیبات فنولیک با تاثیر فیتوکسیکی در این اندام می­شود (48). در مطالعه­ای دیگر تاثیر نانو ذرات CuO محتوای پلی‏فنولی را در ریشه و ساقه گیاهان Ashwagandha به‌طور چشمگیر افزایش داده است اما محتوای فلاونوئید در ریشه و ساقه گیاهان چشم‏گیر نبوده است (49). در پژوهشی که تاثیر نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم برروی گیاه توتون در حالت طبیعی و ترایخته پاسخ‌های متفاوتی داشتند و محتوای قند و فلاونوئید در عصاره برگ گیاهان ترایخته افزایش داشت که گیاهان با افزایش میزان فلاونوئید آسیب‌های اکسیداتیو را کاهش داده‌اند (50).

بررسی تشریحی ریشه گیاه تحت تنش افزایش قطر دهانه‌ی آوندی ریشه نسبت به قطر دهانه­ی آوندی در گیاه شاهد را نشان داد در ساقه گیاهان نیز بررسی‌های تشریحی کاهش قطر دهانه‌ی آوندی در گیاه تحت تیمار نسبت به شاهد مشاهده شد. باتوجه به‏این‏که محلول‌پاشی برروی برگ‌ها و اندام هوایی گیاه انجام ‌گرفته است. بنابراین این قسمت از گیاه بیش‏تر تحت تنش اکسیداتیو بوده و کاهش قطر دهانه آوندی در ساقه و لیگینینی شدن یکی از مکانیسم‌های سازشی گیاه در برابر استرس اکسیداتیو بوده و برای افزایش هدایت آب می‌باشد و نیز با توجه به نتایج تحقیق Tighe-Neira همکارانش (51) که اثر دی‌اکسید تیتانیوم باعث افزایش گذرای فتوسنتز و راندمان مصرف آب در گیاه ترب sativus L.) (Raphanus شده است چون در گیاه تحت تنش ما نیز میزان کلروفیل افزایش‌ یافته است به‏همین ‏دلیل افزایش قطر دستجات آوندی در ریشه ممکن است به افزایش آب درونی لازم و انتقال راحت‌تر آب از ریشه به‏اندام هوایی کمک کند. به‏نظر می­رسد اثر متقابل نانوذرات عناصر و گیاهان موجب آزاد شدن عنصر مربوطه از این ذرات می­شود یا به‏عبارتی نانوذره دریافتی توسط گیاه، منبعی را فراهم می­کند که عنصر مربوطه و سلول­های گیاهی برهم‏کنش داشته باشند و موجب افزایش سمیت نانوذره شود. نانوذرات با عبور از دیواره سلولی و لایه اپیدرم ریشه به‏درون گیاه نفوذ کرده و به‏ساقه و برگ راه پیدا می­کنند. مطالعات نشان داده که تغییرات محیطی می‌تواند منجر به‏تغییرات تشریحی در سلول و بافت­های گیاهی ­شود. در پژوهشی، در غلظت بالای نانوذرات اکسید روی آشفتگی در بافت­های ریشه لوبیا مشاهده شد، هم‏چنین منجر به‏گسترش سیستم واکوئلی در سلول­های پارانشیم پوست و فشرده شدن استوانه آوندی شد (52). نتایج نشان می­دهد تاثیر نانوذرات در مسیر مکانیسم ژنتیکی هورمون­های رشد می­تواند در شکل‌گیری آوند­های آبکش و چوب تاثیرگذار باشد.  بنابراین تغییر شکل برخی سلول­های بافت آوند چوب ریشه قابل توجیه خواهد بود (53). هم‏چنین به‏گفته برخی محققان تاثیر نانو­ذرات بر دیواره سلولی موجب تغییر شکل سلول شده است. در پژوهشی در تیمار سیلیس و نانوذرات سیلیس برروی گیاه شنبلیله افزایش قطر استوانه آوندی مرکزی ریشه را در ریشه­های جوان بخش چوبی آندودرم را گزارش کردند. تغییرات در دیواره سلولی، مانند لیگینینی شدن، به‏سلول­های گیاهی به‌عنوان یک مانع فیزیکی کمک می­کند تا از ورود فلزات سنگین به ‏سیتوپلاسم جلوگیری کند. در برخی مطالعات فلزات سنگین تمایز زودرس و چوبی شدن دیواره سلول‌های واقع در منطقه رشد طولی ریشه را تحریک نموده و از رشد آن ممانعت می‌نماید (54).

نتیجه­گیری

نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم یکی از بیش‏ترین نانوذرات تولید شده در جهان است و طبق فهرست محصولات مصرفی نانوتکنولوژی رایج‌ترین نانوذره اکسیدهای فلزی در محصولات می­باشد. بررسی­ها نشان داده­اند که این نانوذرات مطمئنا در محیط‌ زیست انتشار می­یابند. تیمار نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم سبب کاهش فاکتورهای رشدی اعم از ارتفاع، سطح برگ، وزن‌تر و خشک‌ ریشه و اندام هوایی گل‏ناز یخی در گیاهان تحت تیمار نسبت به گیاه شاهد شد. تیمار نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم باعث افزایش رنگیزه­های فتوسنتزی کلروفیل a و b در گیاه گل‏ناز یخی شد. به‏نظر می­رسد گونه­ی A. cordifolia دارای تنوعی از مکانیزم­ها در برخورد با نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم است که قادر به‏حداقل رساندن اثرات نامطلوب در گیاه می­شود. بیش‏ترین میزان فنل و فلاونوئید به گیاهان تحت تیمار 05/0 و 03/0 درصد نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم مربوط بود. ریشه به‌عنوان اندام تحت تنش بیش‏ترین تغییر را نشان داد. مشاهدات مقایسه­ای میکروسکوپی نشان داد که تیمار نانوذرات دی‌اکسید تیتانیوم در ریشه­ی گیاه گل‏ناز یخی باعث افزایش قطر دهانه‌ی آوندها و کاهش ضخامت دیواره­ی عرضی آوندها در ساقه­ی تیمار 05/0 درصد شد. باتوجه به‏توانایی رشد گل‏ناز یخی در غلظت‌های مختلف نانوذره تیتانیوم  به‌عنوان فراوان‌ترین نانوذره موجود در محیط حاصل از فعالیت‌های صنعتی و پاسخ‌های متفاوت ریخت­شناسی، فیزیولوژیکی، رنگیزه­های فتوسنتزی و  تشریحی که بیان‏گر پتانسیل و توان ژنتیکی این گیاه برای رشد در محیط آلوده به نانوذرات است، با توجه به‏سهولت رشد، عدم‏استفاده خوراکی و وجود ویژگی‌های جذاب زینتی، کشت این گیاه در محیط‌های آلوده و صنعتی توصیه می‌شد. البته سنجش میزان تجمع این نانوذره در گیاه و نحوه امحا بیومس خشک گیاه از مواردی است که باید مورد تحقیق قرار گیرد.

قدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه تبریز و دانشگاه شهید چمران اهواز به لحاظ تامین هزینه‏های این پژوهش تشکر و قدردانی می نمایند.