مقدمه

نانوتوکسیکولوژی به‏عنوان یک زیرشاخه از نانوتکنولوژی به مطالعه برهم­کنش نانومواد با موجودات زنده می­پردازد (1). از آنجایی‏که صنعت تولید نانو ذرات و استفاده از آن­ها روز به‏روز در حال توسعه می­باشد، نگرانی در رابطه با اثرات محیط ­زیستی این مواد سبب شده تا محققان تحقیقات گسترده­­ای در زمینه خطرات بالقوه نانو مواد بر محیط­زیست و موجودات زنده انجام دهند (2). با توجه به استفاده رو به گسترش از نانو مواد و متعاقبا مخاطرات بالقوه محیط­زیستی و سلامت انسانی، نیاز به بهبود اطلاعات در رابطه با مخاطرات ناشی از حضور این مواد در محیط­های آبی و به‏طور خاص درک ویژگی­های فیزیکوشیمیایی، پروسه­های جذب زیستی و سمیت آن‏ها در موجودات زنده وجود دارد (3).

در دهه­های اخیر گروه­های مختلف موجوات زنده به‏طور گسترده جهت بررسی وقوع آلودگی­های شیمیایی در محیط­های طبیعی مورد استفاده قرار گرفته­اند. دوکفه­ای­ها یکی از گروه­های بسیار مهم در این رابطه به‏شمار می­روند. این موجودات گروهی از نرم­تنان­ می­باشند که مطلوبیت بالایی جهت استفاده به‏عنوان بیواندیکاتورهای آلودگی در محیط­های آبی دارند (4) این گروه از نرم­تنان به‏دلیل آن که از فراوانی بالایی در محیط‏های آبی شیرین، مصبی و دریایی برخوردارند، به‏عنوان یک موجود مدل مناسب در مطالعه اثرات بالقوه نانو ذرات بر موجودات آبزی مطرح شده­اند (5). Wang و همکاران (4) اولین بار پیشنهادی را مطرح نمود مبنی بر این که بی­مهره‏گان تغذیه­کننده از مواد معلق در آب، به‏خصوص نرم­تنان دوکفه­ای به‏عنوان گروه هدف منحصر به‏فرد برای مطالعات سم­شناسی نانو ذرات در نظر گرفته شوند. زیرا این موجودات با توجه به این که در تماس مستقیم با بخش­های آلوده شده زیستگاه‏های آبی (رسوبات و آب) قرار دارند و می­توانند سطوح بالایی از فلزات را در بافت­های خود ذخیره سازند، شواهد مناسبی در رابطه با وقوع آلودگی­های محیطی با مقیاس زمانی از طریق بررسی پاسخ­های سلولی و فیزیولوژیکی فراهم می­سازند (6).

تغییرات هیستوپاتولوژیکی شاخص­های زیستی مناسبی در پایش اثرات آلاینده­ها به‏حساب می­آیند (7)، دوکفه­ای­ها دارای فرآیندهای توسعه یافته­ای جهت درونی­سازی سلولی ذرات با اندازه نانو و میکرو (به‏ترتیب اندوسیتوز و فاگوسیتوز) دارند که در عملکرد و وظایف فیزیولوژیکی آن­ها نظیر هضم درون­سلولی و ایمنی­سلولی اهمیت فراوانی دارند (8). بررسی­های هیستوپاتولوژیکی، بخش مهمی از برنامه‏های مطالعاتی مورد استفاده در پایش اثرات آلاینده­ها به‏حساب می­آیند. این بررسی‏ها، راهی جهت شناسایی اثرات حاد و مزمن ناشی از مواجهه با آلاینده­های گوناگون در بافت­ها و اندام­های خاص موجودات به‏حساب می­آیند (9). تعیین پاسخ­های هیستوسیتولوژیکی نسبتا آسان بوده و می­توان آن‏ها را به سلامت و شایستگی افراد در جوامع اکولوژیک نسبت داد (10). نفوذ نانو ذرات دارای تحرک و فعالیت بالا در بافت­های هدف، وقوع تغییرات هیستوپاتولوژیکی در اندام­ها را سبب می‏شود (11). در مطالعه حاضر در مهر ماه 1393 انجام شد، تغییرات هستولوژیکی و فراساختاری اندام­های آبشش، مانتل، در ماسل آب شیرین Anodonta cygnea در نتیجه مواجهه با سطوح مختلف نانوذرات اکسیدمس مورد بررسی قرار گرفت. هدف از انجام این تحقیق معرفی نانو ذرات اکسید مس به‏عنوان آلاینده پیکره‏های آبی و اثرات سوء آن بر روی موجودات آبزی بوده است.

مواد و روش‏ها

جمع­آوری نمونه­های دوکفه­ای

تعداد مورد نیاز از دوکفه­ای­ A. cygnea با دامنه طولی 9/0 ± 5/11 سانتی‏متر و وزن 6 ± 5/84 گرم در مهر ماه 1393 از مصب رودخانه تجن در شهرستان ساری در استان مازندران جمع­آوری شده (36°48΄46΄΄N, 53°6΄57΄΄E) و به آزمایشگاه آبزی ­پروری گروه شیلات دانشگاه علوم کشاورزی و منابع طبیعی گرگان انتقال داده شد. دوکفه­ای­ها به‏منظور سازگاری و رفع استرس ناشی از حمل و نقل به‏مدت دو هفته در مخازن فایبرگلاس60 لیتری نگه‏داری شدند.

مواجهه دوکفه­ای­ها با نانوذرات اکسید مس

جهت تهیه محلول نانو­ذره مس از محصولات نانوذره تجاری شرکت نانو پیشگامان ایرانیان استفاده شد. به‏منظور مواجهه دوکفه­ای­ها با نانو ذرات بر اساس سطوح 50 LC) lethal concentration ) نانو ذرات اکسید مس گزارش شده در مطالعات پیشین (13)، غلظت ppm 25 در نظر گرفته شد. نانوذرات در ابتدا با استفاده از دستگاه اولتراسوند با تعداد دور 400 دور در دقیقه در حجم مشخص آب مقطر به‏مدت 20 دقیقه پخش شد تا به‏صورت همگن درآید. به‏دلیل اینکه نانو ذرات مس پس از 24 ساعت در توده آبی ترسیب پیدا می­کنند، جهت اختلاط مجدد محلول نانوذره در هر 24 ساعت از دستگاه هموژنایزر با تعداد دور 14000 در دقیقه استفاده شد. هر 24 ساعت یک‏بار تعویض آب مخازن دوکفه­ای­ها جهت اطمینان یافتن از حصول غلظت همگن مورد نظر از نانو ذرات صورت گرفت. همچنین جهت دست یابی به نحوه پخش شدن نانو ذرات در محیط آبی، نمونه آب با دستگاه تست Dynamic light scattering DLS)) شد پس از اتمام دوره تطابق دوکفه­ای­ها با شرایط آزمایشگاهی، مواجهه دوکفه­ای­ها با غلظت انتخابی از نانو ذرات در طول مدت دو هفته انجام گرفت. مواجهه دوکفه­ای­ها با نانو ذرات در مخازن شیشه­ای حاوی سه لیتر آب صورت گرفت. پس از اتمام دوره مواجهه دوکفه­ای­ها با نانو ذرات اکسید مس، نمونه­هایی از بافت­های اندام­های آبشش و مانتل، از محل­هایی معین برداشت شد.

آماده سازی و رنگ­آمیری مقاطع بافتی جهت تهیه تصاویر با استفاده از میکروسکوپ نوری

نمونه­های بافتی برداشت شده از اندام­های مورد مطالعه به‏منظور انجام آماده­سازی برای رنگ­آمیزی، ابتدا به‏مدت 48 ساعت در محلول بوئن (75 قسمت اسید پیکریک، 25 قسمت فرمالین، 5 قسمت اسید استیک گلاسیال) قرار داده شدند. مراحل آماده­سازی نمونه­های بافتی فیکس شده جهت برش و رنگ­آمیزی بر اساس پروتکل Hewitson & Darby (2010) (15) انجام گرفت. در نهایت نمونه­های بافتی برش داده شده و با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ­آمیزی شدند. تهیه تصاویر از مقاطع بافتی آماده­شده با استفاده از میکروسکوپ نوری Leica-MS5 در بزرگ‏نمایی­های 40، 100 و 120 صورت گرفت.

آماده­سازی نمونه­های بافتی جهت تهیه تصاویر با استفاده از میکروسکوپ الکترونی نگاره (SEM)

قطعاتی با ضخامت 2 تا 5 میلی­متر و طول 5 تا 10 میلی‏متر از بافت­های مورد بررسی تهیه شده و به‏مدت 2 ساعت در فرمالین 10 درصد قرار داده شدند. مراحل بعدی آماده­سازی این نمونه­ها عبارت بودند از: قرار دادن نمونه­های بافتی به‏مدت 24 ساعت در فرمالین5 درصد، مدت 30 دقیقه در محلول بافر فسفات، گذراندن از سری الکل اتانول (30، 40، 50 و 70 درصد و در نهایت اتانول 100 درصد). پس از انجام مراحل فوق، آماده­سازی برای تهیه تصاویر صورت گرفت بدین ترتیب که در ابتدا نمونه­های بافتی از اتاتول 100 درصد خارج شده و در داخل پلیت قرار داده شد. سپس برای مدت 2 ساعت در دمای 80- درجه سانتی­گراد قرار گرفتند و به‏دنبال آن به دستگاهFreez dryer  منتقل شدند. در این دستگاه دما در ابتدا تا 50- درجه سانتی‏گراد کاهش یافته و نمونه­ها در همین دما برای مدت 50 دقیقه نگه‏داری شدند. سپس دما تا 25- درجه سانتی­گراد افزایش یافت و در نهایت به دمای صفر درجه سانتی­گراد تغییر یافت تا به دمای محیط رسانده شد. نمونه­های بافتی خشک شده با کمک کیت­های طلا کد شده و تصاویر میکروسکوپ الکترونی نگاره در بزرگنمایی 100 و 1000 برابر تهیه شد. مطالعه حاضر جنبه آزمایشگاهی داشته و همچنین نیاز به محاسبات آماری درانجام این مطالعه نبوده است.

نتایج

وضعیت فراساختاری اندام­های شاهد و  مواجهه یافته

شکل 1 نشان­دهنده تصاویر میکروسکوپ الکترونی نمونه­های مربوط به اندام­های مورد بررسی در دوکفه­ای­های شاهد و مواجهه ­یافته است. وضعیت فراساختاری نمونه­های آبشش به‏وضوح نشان­دهنده ساختار مشخص تیغه­های آبششی و کانال‏های آب و برخی ذرات و مواد چسبیده به سطح آبشش بود (شکل 1-C،A ). نمای سطحی آبشش نمونه­های مواجهه یافته وضعیت کاملا متفاوتی را در مقایسه با نمونه‏های شاهد در این اندام نشان داد (شکل 1-D، B). سطح آبشش به‏وضوح نشان‏دهنده تخریب گسترده این اندام بود به‏طوری‏که تیغه­های آبششی و ساختار مشخص و چیدمان منظم کانال­های آبی آبششی به‏ندرت قابل تشخیص بود و ضایعات نکروز شده بافتی تا حد زیادی سطح این اندام را پوشانده بود.

وضعیت سطحی نمونه­های شاهد مانتل نشان­دهنده وجود چین­خوردگی­ها و برآمدگی­های ملایم و ظریفی و در عین حال تقریبا منظمی در سطح بیرونی این اندام بود (شکل 1-C،A )، اما در نمونه­های مواجهه یافته حالت به‏شدت تخریب یافته و نکروز شده­ای مشاهده شد (شکل 1- B،D ).

شکل 1: تصاویر فراساختاری به‏دست آمده از میکروسکوپ الکترونی. c،A) آبشش نمونه­های شاهد (GF: تیغه­های آبششی،wch: کانال آب؛ فلش زرد رنگ:gl: لاملای آبششیmc: سلول­های موکوسیeptc:سلول­های اپیتیال و  ذرات خارجی چسبیده به آبشش)، B،D) آبشش نمونه­های مواجهه یافته (GF: تیغه­های آبششی، WC: کانال آب، فلش قرمز رنگ: نواحی تخریب شده سطحی)،E،J) مانتل نمونه­های شاهد (SW: چین­های سطحی)،F،H: مانتل نمونه­های مواجهه­یافته (Tr: نواحی تخریب شده سطحی)

وضعیت هیستولوژیک نمونه­های بافتی متعلق به دوکفه‏ای­های شاهد

شکل 2 نشان­دهنده ویژگی­های هیستولوژیکی در نمونه­های شاهد است. تیغه­های آبشش سالم با اندازه تقریبا یکسان و فواصل بینابینی مشخص قابل مشاهده بود (شکل 2-A). اپیتلیوم تیغه­های آبششی به‏صورت سالم و یکپارچه قابل رویت بود. مقاطع کانال­های همولنفی در فضای داخلی تیغه­های آبششی در ساختاری تقریبا منظم با دیواره نازک و یکنواخت وجود داشتند به‏طوری‏که بافت پیوندی فضای پیرامونی آن را اشغال کرده بود (شکل 2-B). در مقاطع مربوط به مانتل (شکل 2- E و D) بافت ­پوششی بخش خارجی این اندام که در واقع احاطه­کننده فضای مانتلی است، قابل تشخیص بود به‏صورتی‏که در لابه‏لای سلول­های اپی‏تلیال، سلول­های ترشح­کننده موکوس نیز وجود داشتند. در قسمت­های داخلی­تر بافت­ عضلانی وجود داشت (شکل 2-E) که تراکم تارهای ماهیچه­ای آن در مقایسه با بخش­های عضلانی پا، کمتر بود و نواحی بینابینی آن­ها توسط بافت پیوندی پر شده بود. همچنین در بخش­های بینابینی بافت پیوندی تجمعاتی از هموسیت­ها وجود داشتند (شکل 2-D).

شکل 2: مقاطع بافتی نمونه­های شاهد (با ضخامت 5 تا 7 میکرومتر، رنگ­آمیزی H&E): آبشش (A و B)، جبه (D و C. (ct: بافت پیوندی؛ hch: کانال همولنفی؛ gl: تیغه آبششی؛ mc: سلول موکوسی؛ ep: اپیتلیوم؛ mb: دسته­تارهای عضلانی؛ hae: هموسیت.

وضعیت هیستولوژیک نمونه­های بافتی متعلق به دوکفه‏ای­های مواجهه­یافته با نانوذرات

وضعیت هیستولوژیکی اندام‏های مورد مطالعه در بافت­های به‏دست آمده از نمونه­های مواجهه­یافته در شکل 3 نشان داده شده است. در آبشش تغییر شکل و اندازه تیغه­های آبششی به‏وضوح مشاهده شد (شکل 3-A و C). افزایش ضخامت اپی‏تلیوم در نتیجه هیپرتروفی سلول­های اپی‏تلیال، کاهش فضای بینابینی تیغه­ها، کوتاه شدگی تیغه­های آبششی و گرزی­شکل شدن آن­ها و همچنین اتصال تیغه­های مجاور دیده شد (شکل 3-A و C). هیپرپلازی یا افزایش تعداد سلول­های اپی‏تلیال تیغه­ها در موارد متعدد مشاهده شد (شکل 3-B). از بین ­رفتن کانال­های همولنفی و به هم خوردن ساختار منظم آن­ها در قسمت­های درونی آبشش وقوع یافته بود (شکل 3-A). گسستگی بافتی در ساختار تیغه­ها و همچنین بافت­های پیوندی در بخش­های درونی­تر مشاهده شد (شکل 3-A). افزایش ضخامت سلول­های اپی‏تلیال دیواره کانال­های همولنفی نیز رخ داده بود (شکل3-B). در اندام مانتل هیپرپلازی اپیتلیوم بیرونی این اندام  به همراه گسستگی بافتی گسترده در بافت پیوندی بخش­های درونی­تر مشاهده شد (شکل 3-D و F). افزایش تعداد سلول­های موکوزی در بافت ­اپی‏تلیال نواحی با شدت آسیب ­دیدگی کمتر همراه با هیپرپلازی اپیتلیوم رویت گردید (شکل 3-E). تخریب بافت پیوندی ذخیره­ای و گسستگی بافتی در آن نیز دیده شد (شکل 3-E و F). مواردی از ابری­شدن و تورم در سلول­های عضلانی اتفاق افتاده بود (شکل 3-D). افزایش غیر متمرکز و پراکنده تعداد هموسیت­ها نیز در مقایسه با نمونه­های بافتی شاهد در نواحی دچار گسستگی در بافت­ پیوندی ذخیره­ای دیده شد (شکل 3-D و E).

شکل 3: تصاویر مقاطع بافتی نمونه­های شاهد (با ضخامت 5 تا 7 میکرومتر، رنگ­آمیزی H&E): آبشش (A، B و C)، مانتل (F، E و D)؛. tr: گسستگی بافتی، gl-c: اتصال تیغه­های آبششی مجاور، hyp: هیپرپلازی، sw: تورم، ابری شدن یا پنیری شدن، hyp: هیپرپلازی،  ct: بافت پیوندی، hae: هموسیت، mc: سلول موکوسی.

شکل 4: توزیع اندازه­ای نانو ذرات اکسید مس در آب مخازن حاوی دوکفه­ای­ها