مقدمه

در سال 1876 میلادی ویلیام گریلز آدامز و شاگردش، ریچارد ایوانز دی، کشف کردند که جریان الکتریکی در اثر تابش نور می­تواند در سلنیوم ایجاد شود که در ادامه داریل چاپین و کالوین فولر با اصلاح و تغییر کشف پیرسون، اولین سلول خورشیدی که قادر به تبدیل انرژی خورشید به توان الکتریکی بود را برای  استفاده در تجهیزات الکتریکی روزمره ساختند (1 و 2). اما تهیه مواد برای سلول‏های خورشیدی سیلیکونی موجود، دارای هزینه بسیار بالایی می‏باشد. نسل دیگری از سلول­های فوتوولتائیک، سلول­های رنگدانه‏ای (DSSC) که اولین بار توسط گراتزل و همکاران به دلیل هزینه پایین، محیط زیست پسند، با ساختار ساده، اختراع و مورد توجه قرار گرفته شدند و شامل لایه‏ای نازک از دی اکسید تیتانیوم و مولکول‏های رنگ آلی که در بین ذرات دی اکسید تیتانیوم قرار گرفته و الکترولیت سیال را جذب می‏کنند. با این وجود این فتوسل‏ها هنوز فاقد راندمان بالایی هستند (3-5).

یکی از این مولکول‏های رنگ آلی که در فتوسل‏ها کاربرد دارد پروتئین‌های فتوکروم می‏باشد. این پروتئین‌ها در فتوسنتز و حس بینایی نقش مهمی را بازی می‌کنند و به‏همین دلیل مطالعات زیادی برروی عملکرد این مولکول­ها، فعل و انفعال آن‏ها با نور و چگونگی تبدیل انرژی نور به انرژی شیمیایی و یا سیگنال‌های فیزیولوژیک انجام گرفته است. پروتئین باکتریورودوپسین از دسته پروتئین‌های فتوکروم می‌باشد، که در سه دهه اخیر بسیار مورد توجه قرار گرفته ­است. این پروتئین غشایی توسط هالوباکتری‌ها تولید می‏شود. هالوباکتریوم سالیناریوم (Halobacterium salinarium)  یک آرکی هوازی، گرم منفی و فوق العاده نمک دوست است و در شوره زارها و نمک زارها یافت می‏شود. سطح هالوباکتریوم سالیناروم شامل مسیرهای غشایی است که غشای ارغوانی نامیده می‏شود. مهم‏ترین پروتئین موجود در غشای ارغوانی، باکتریورودوپسین است. باکتریورودوپسین بهترین پروتئین مطالعه شده در آرکی باکتری‏هایی است که به‏طور طبیعی تحت شرایط نوردهی و هوادهی پایین رشد می‏کنند. این پروتئین یک پروتئین غشایی است که  دارای هفت هلیکس موجود در عرض غشاست (6 و 7) و یک پروتئین کلیدی با قابلیت‌های فتوسنتزی می‌باشد. آنچه که پروتئین باکتریوردوپسین را از مواد فتوکرومیک ارگانیک و غیرارگانیک متمایز می‌سازد ساختمان کریستالی دو بعدی این پروتئین است که در مقابل تخریب‌­های گرمایی و شیمیایی مقاومت خوبی از خود نشان می‌دهد (8).

شبکه موجود در پروتئین باکتریورودوپسین غشای سلولی هالوباکتریوم سالیناریوم، یکی ازساده­ترین مبدل­های انرژی بیولوژیکی شناخته شده­ است (9 و10). در طول چرخه فتوشیمیایی باکتریورودوپسین، این پروتئین هم جهت در غشای ارغوانی، پروتون را از سیتوپلاسم به فضای خارج سلولی، یک سویه پمپ می­کنند. چرخه­ی فتوشیمیایی پمپ پروتون باکتریورودوپسین بیش از 10⁶ بار تکرار می­شود (شکل1) (11 و 12).

شکل 1: باکتریوردوپسین موجود در غشای هالوباکتریوم سالیناروم (13)

روش‏های گوناگونی برای تثبیت و جهت دهی فیلم نازک باکتریورودوپسین به‏کار گرفته شده است (14-16) که متداول‏ترین روش برای تشکیل تک لایه‏های آلی تکنیک لانگ مویر بلادجت می‏باشد (17). مطالعات قبلی نشان می‏دهد که پروتئین باکتریورودوپسین می‏تواند در سطح بالای یک محلول به‏حالت تعلیق به شکل لایه‏های با ثبات بماند. برای انجام روش لانگ مویر بلادجت، یک سوسپانسیون از پروتئین باکتریورودوپسین آماده شد و به‏مدت 25 ثانیه سونیکیت شد تا قطعات پروتئین باکتریورودوپسین به‏حالت تعلیق در بیایند. بعد با پخش کردن این سوسپانسیون در محلول زیر لایه اجازه داده شود به‏مدت 30 دقیقه به ثبات برسد (18) که در نهایت با شروع به‏کار دستگاه لانگ مویر بلادجت تک لایه‏های ایجاد شده به روی بستر جامد انتقال یابند (17).    

از جمله اهداف پژوهش بررسی فیلم باکتریورودوپسین تک­لایه، بررسی ساخت فتوسل بیولوژیک با بازده بیشتر، ارزیابی ترکیبات (TiO₂, FTO, Br) مورد آزمایش جهت افزایش بازده فتوسل‏های بیولوژیک، امکان سنجی ساخت فتوسل‏های جهت به‏کارگیری در معماری و مصارف نظامی.

مواد و روش‏ها

مواد و دستگاه‏ها:

جدول1:  مشخصات مواد شیمیایی

دستگاه­ها:

1- دستگاه لانگ مویر: در این پژوهش از دستگاهLangmuir- Blodgett Trough   مدل ایرمان تک استفاده شد.

2- دستگاه سونیکا سیون با قدرت Hz55: در این پژوهش از دستگاه سونیکاسیونSoniprep 150  استفاده شد.

3- دستگاه طیف سنجی ماورا بنفش: در این پژوهش از دستگاه Unicum UV-300 استفاده شد.

4- کوره آزمایشگاهی: پارس آزمون.

5- ترازو: در این پژوهش از ترازوی دیجیتال Sartorius مدل TE1242 با دقت 0001/0 استفاده شد.

6- دستگاه هیتر استیرر: در این پژوهش از دستگاه Heidolf مدل MR 3001 استفاده شد.

7- pH متر: در این پژوهش از دستگاه pH متر WTW مدل Inolab استفاده شد.

8- دستگاه مولتی­متر: در این پژوهش HIOKI استفاده شد.

روش‏ها در 6 مرحله انجام شد که شامل:

1- تهیه فتوآند

تهیه لایه نازک خمیر TiO₂ (نانو ذره دی اکسید تیتانیوم) بر روی شیشه سخت، مقاوم و ارزان فلوئور اکسید قلع (FTO) (19) به‏روش بلدینگ:

ازسمت رساناFTO  دو نوارچسب موازی برروی لبه‏­های صفحه شیشه­ای به‏فاصله حدود 5 میلی‏متر از هم چسبانده می­شود. مساحت بدون پوشش وسط شیشه با خمیر TiO₂ لایه نشانی خواهد شد. لبه پوشانده ­شده توسط نوار­چسب، ناحیه­ای برای آب بندی‏ها و اتصالات الکتریکی در آینده خواهد شد. از مزایای دیگر نوار چسب، نگه­داری صفحه شیشه برروی میزکار است. مقداری ازخمیر درنزدیکی لبه بالای شیشه­یFTO بین دو قطعه نوار چسب ریخته شد. با یک لام میکروسکوپ و یا یک میله شیشه ای، خمیر در سراسر صفحه با پشتیبانی نوار چسب برروی هر دو طرف گسترده می­شود. شکاف میان نوار­ها باید با  لایه‏ای از خمیر پر شده­ باشد. این عمل تا زمانی‏که یک لایه نازک و یکنواخت ایجاد شود تکرار می‏شود (20). صفحه شیشه‏ای تازه پوشش داده شده جهت تثبیت و ایجاد تخلخل در داخل کوره قرار می‏گیرد، سپس الکترودهای پوشش­داده ­شده با خمیر TiO₂ به‏تدریج تحت جریان هوا به دمای 325 درجه سانتی‏گراد رسیده و به‏مدت 5 دقیقه درآن دما ­ماند و به‏ترتیب در 375 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 5 دقیقه و در دمای450 درجه سانتی‏گراد برای 15 دقیقه و در نهایت، در 500 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 15 دقیقه در کوره حرارت داده شد (21).

2- جداسازی غشای ارغوانی حاوی باکتریورودوپسین با روش یوسل

محتویات کشت هالوباکتریومسالیناریوم به حجم یک لیتر با دورg 12000 به‏مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی‏گراد سانتریفیوژ شد. رسوب سلولی در 20 میلی‏لیتر محیط کشت پایه نمکی به‏حالت تعلیق درآمد. تعلیق سلولی در دمای 20 درجه سانتی‏گراد به‏حالت ساکن زیر نور ملایم مهتابی به‏مدت یک شب قرار داده شد. سپس 300 میکرو لیتر از محلول DNase به آن افزوده شد.  تعلیق سلولی تهیه شده آنزیمی داخل کسیه دیالیز که از قبل آماده شده بود ریخته شد کیسه دیالیز درون بشر 2 لیتری حاوی NaCl  1/0 مولار قرار گرفت. بشر بر روی همزن در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 3 روز قرار داده شد و بافر آن طی این مدت سه بار تعویض شد. در پایان دیالیز، محتویات درون کیسه دیالیز داخل فالکون ریخته شده و در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 20 دقیقه و دور g 2500 سانتریفیوژ شد. سپس محلول رویی در دمای 4 درجه سانتی‏گراد به‏مدت 60 دقیقه  و با دورg  38000  سانتریفیوژ شد. در مرحله بعد محلول رویی که حاوی باکتریورودوپسین است دور ریخته شد و رسوب ارغوانی رنگ با NaCl  1/0 مولار چندین بار تحت شرایط مرحله قبل شستشو داده شد. عمل شستشو تا جایی صورت گرفت که محلول رویی بی‏رنگ و رسوب ارغوانی رنگ جدا شد، سپس رسوب حاصل در آب مقطر استریل حل و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد (22).

3- روش انجام تکنیک لانگ مویر بلادجت

ابتدا سوسپانسیون حاوی 380 میکرولیتر آب، 126 میکرولیتر DMF (Dimethylformamide) (به‏عنوان ماده فرار برای بالا آوردن پروتئین مورد نظر به سطح آب)،94 میکرولیتر پروتئین باکتریورودوپسین (mg/ml05/0) را به‏مدت یک دقیقه سونیکیت و در داخل تشتک حاوی محلول (CaCl₂) (زیر لایه) با pH حدود 5/5 و در دمای محیط ریخته و به‏مدت یک ساعت صبر کرده تا خوب در سطح پخش شود که این مرحله را فاز گازی می‏نامند (شکل2) با شروع به‏کار دستگاه لانگ مویر بلادجت و حرکت بازوها به‏سمت یکدیگر باعث افزایش فشار سطح می‏شوند، این مرحله را فاز مایع می‏نامند. با افزایش بیشتر فشار سطح به فاز مشترک جامد- مایع تبدیل می‏شود.

سرعت انتقال تک لایه بر روی بستر و جنس بستر نقش تعیین‏کننده‏ای در انتقال، جهت‏گیری و تثبیت پروتئین باکتریورودوپسین دارد. سرعت بازوها mm/s05/0، سرعت پایین رفتن بستر mm/s08/0 و فشار سطح mN/m²20 تنظیم گردید و تک لایه پروتئین باکتریو رودوپسین در فاز مشترک جامد- مایع بر روی بستر جامد (FTO) انتقال یافت (23)

شکل 2: نمودار لانگ مویر تک لایه پروتئین باکتریورودوپسین. محلول زیر لایه، ( در دمای محیط و5/5 pH =)

تا این مرحله شیشه FTO به‏عنوان فتوآند آماده شد.

4- تهیه فتو کاتد: دو سوراخ (با قطر1 میلی­متر) در شیشه­ی FTO با دریل ایجاد شده است (از سمت رسانا). شیشه­ی FTO سوراخ شده با آب و هم­چنین با محلول هیدروکلراید 1/0 مولار در اتانول شستشو داده شد و در حمام استون به‏مدت 10 دقیقه اولتراسونیکایت شد و تمیز شد. پس از بین بردن لکه­های آلی باقی مانده، شیشه به‏مدت 15 دقیقه در دمای 400 درجه سانتی‏گراد حرارت داده شد، سپس با یک قطره از محلول H₂PtCl₆ (2 میلی­گرم Pt در 1 میلی­لیتر اتانول) روی شیشه FTO را پوشانده و با عملیات حرارتی به‏مدت 15 دقیقه در دمای 400 درجه سانتی‏گراد، لایه نشانی Pt انجام می­گیرد (ضخامت حدود 50 میکرون) (21 و 24). برای تست فعالیت کاتالیستی پلاتین، یک قطره پراکسید هیدروژن در روی سطح الکترود (محلول 30 درصد در آب کافی است) ریخته می‏شود. حباب­های ایجاد شده از سطح پلاتین نشان می­دهد که لایه پلاتین فعال و به‏درستی شکل گرفته است (25).

 5-  بستن فتوسل

برای ساختن فتوسل، پلیمر آب­ بندی (طلق پلاستیکی) بین الکترود فتوآند (TiO₂, FTO, Br) و الکترود مقابل (کاتد) (FTO/Pt) به‏صورت ساندویچ قرار داده شد (26). حرارت و فشار بر سر سطح فیلم پلیمر با کمک پرس داغ یا یک ابزار مشابه در دمای 110 درجه سانتی‏گراد اعمال شد. پس از چند ثانیه، پلیمر مذاب داغ باید از دو طرف به الکترودها بچسبند. این عمل تا زمانی‏که تمام سطح هر دو الکترود با ذوب فیلم پلیمر بر روی هم بچسبند تکرار می­شود. با استفاده از یک سرنگ با فشار، محلول الکترولیت از یک سوراخ تزریق شد. با خروج هوا از سوراخ دوم، الکترولیت تری­یدید لیتیم به‏داخل سلول پر شد. برای جلوگیری از نشت الکترولیت، می­توان مفصل­های کوچکی از لوله سیلیکونی در نوک سرنگ قرار داد (21, 24 و 25).

6- روش ساخت فتوسل تجمع یافته

تمام مراحل بالا برای ساخت فتوسل تجمع یافته انجام شد به‏جز مرحله 3 (تکنیک لانگ مویر). در این فتوسل به‏جای استفاده از پروتئین باکتریورودوپسین تک لایه توسط دستگاه لانگ مویر، بعد از آماده کردن فتوآند آن‏را به‏کمک یک پنس در داخل محلول رنگدانه (باکتریورودوپسین) به‏مدت 18 ساعت منتظر مانده تا جذب نانو ذرات دی اکسید تیتانیوم شوند بعد فتوآند دو تا سه دقیقه در داخل یک ظرف تمیز و استریل که حاوی اتانول است قرار داده تا رنگدانه‏های که جذب سطح نشده اند جدا شده و درون اتانول حل شوند، بقیه مراحل مثل روش قبل انجام گرفت.

در نهایت به‏منظور بررسی عملکرد فتوسل بیولوژیک ساخته شده فوتوولتائیک در فاصله 25 سانتی‏متری نور چراغ مطالعه با لامپ w40 با شدت روشنایی lux450 قرار گرفتند که نتایج آن در ادامه بررسی شده است.

نتایج

تست خلوص نمونه باکتریورودوپسین

جهت سنجش میزان خلوص باکتریورودوپسین، نسبت جذب در طول موج‏های 280 و 560 نانومتر استفاده شد. درصد خلوص از رابطه (1) محاسبه شد.

(1)                        

هر چه این نسبت بیشتر باشد، میزان خلوص باکتریورودوپسین بیشتر و آلودگی با سایر پروتئین‏ها کمتر است. جذب در طول موج 280 نانومتر مربوط به کل پروتئین‏ها و طول موج 560 نانومتر مربوط به جذب باکتریورودوپسین است (27).

تست فعالیت زیستی پروتئین باکتریورودوپسین

جهت اثبات فعالیت باکتریوردوپسین، تغییرات pH وابسته به نور بررسی می­شود. زیرا باکتریوردوپسین یک پمپ پروتونی وابسته به نور است و تحت شرایط تابش نور، پروتون پمپ کرده و منجر به تغییرات pH می­شود، برای اندازه‏گیری میزان فعالیت باکتریورودوپسین داخل غشای ارغوانی، 5/0 میلی‏گرم از غشای ارغوانی با سونیکاسیون به‏صورت تعلیق در آمد. قطعات معلق به‏مدت 1 ساعت تیمار شدند و در معرض نوردهی قرار گرفتند و تغییرات pH  توسط pH متر ثبت شد ( شکل3) (25).

شکل3: نمودار تغییرات pH پروتئین باکتریورودوپسین در دمای محیط

بررسی صحت نمونه باکتریورودوپسین بر روی شیشه FTO با طیف سنجی در طول موج  380 تا 650 نانومتر

پروتئین باکتریورودوپسین انرژی نور سبز (500 تا 650 و ماکزیمم 568 نانومتر) را جذب و نور آبی و قرمز را منعکس کرده و به همین علت ارغوانی رنگ به‏نظر می­رسد. در شکل (4) باکتریورودوپسین تک لایه ته نشین شده بر روی FTO  حاوی TiO₂ که در ناحیه 566 نانومتر جذب داشته که نشان می‏دهد پروتئین باکتریورودوپسین به‏صورت سالم و بدون آسیب بر روی بستر تثبیت شده و ساختار ذاتی و فتوشیمیایی شبکه پروتئین باکتریورودوپسین بر روی بستر حفظ شده است (23).

شکل 4: طیف جذبی جذب در مقابل طول موج حاصل از پروتئین تک لایه بر روی FTO (طول موج بین 380 تا 650 نانومتر در دمای 25 درجه سانتی‏گراد)

همانطور که در شکل (5 و 6) مشاهده می‏کنید، توان فتوسل‏های ساخته ­شده با پروتئین باکتریورودوپسین تک لایه تقریبا µA 5/0 در مقایسه با پروتئین باکتریورودوپسین تجمع یافته افزایش داشته و همچنین ولتاژ فتوسل‏های ساخته ­شده با پروتئین باکتریورودوپسین تک لایه تقریباmv 25 در مقایسه با پروتئین باکتریورودوپسین تجمع یافته افزایش داشته است.

شکل5:  نمودار جریان الکتریکی فتوسل ­های ساخته شده (فاصله 25 سانتی‏متری نور لامپ 40 وات و شدت روشنایی lux450)

شکل6:  نمودار ولتاژ فتوسل ساخته شده ( فاصله 25 سانتی‏متری نور لامپ 40 وات و شدت روشنایی lux450)

بحث

توان فتوسل‏های تک لایه در این مطالعه µA7/0 و ولتاژ آن mV190 می‏باشد که با توان فتوسل‏های تجمع یافته (µA2/0)،  µA5/0 و با ولتاژ آن (mV165)، mV25 تفاوت داشته یعنی فتوسل‏های تک لایه نسبت به تجمع بازدهی بیشتری دارد که می‏تواند ناشی از تک لایه کردن پروتئین باکتریورودوپسین توسط دستگاه لانگ مویر بلادجت و یا ناشی از حرارت‏های متوالی در دماهای مختلف باشد که با ایجاد تخلخل در خمیر TiO₂ باعث افزایش و در نتیجه توسعه بیشتر تک لایه پروتئین باکتریورودوپسین که باعث جذب نور بیشتر می‏شود، باشد. توانایی پروتئین باکتریورودوپسین برای به‏کارگیری در دستگاه­های بیولوژیکی، ناشی از ثبات آن نسبت به حرارت، مواد شیمیایی و تخریب­های فتوشیمیایی، همراه با ویژگی­های مطلوب فوتوالکتریکیو فتوکرومیکی است. علاوه بر این، رابطه بین عملکرد- ساختار باکتریورودوپسین و راه­های اصلاح ساختار باکتریورودوپسین، به‏شدت مورد مطالعه قرار گرفته است (26). مطالعه کنترل جهت‏گیری باکتریورودوپسین تک لایه گام مهمی در استفاده از چنین غشایی در پیکربندیحالت جامد دارد که از آن جمله می‏توان به‏کارگیری در فوتوالکتریک را مثال زد (28).

سیستم­های سیلیکونی استحکام کمتری در محیط دارند، مزیت فتوسل‏های ارگانیک باکتریورودوپسین آزمایش شده در مقایسه با سیستم‏های سیلیکونی، استحکام بیشتر آن‏ها در محیط است. پروتئین باکتریورودوپسین جزء سیستم‏های نوظهور زیستی و مواد اپتوالکتریک بسیار تجدید پذیر و پایان­ناپذیر می­باشند (29).

ولی بازدهی این سیستم‏ها (فتوسل‏های تک لایه زیستی) نسبت به فتوسل‏های سیلیکونی که جزء فتوسل‏های نسل اول بوده و هنوز هم مورد استفاده قرار می‏گیرند کمتر است (30) که از عیوب این روش محسوب می‏شود، گرچه ممکن است با انعطاف پذیری، ارزانی، فرآوری آسان، سبک وزنی و سازگار با محیط زیست که از مزایای آن محسوب می شود (31) جبران شود.

نتیجه‏گیری

در این پژوهش با تک لایه کردن پروتئین باکتریورودوپسین توسط دستگاه لانگ مویر بلادجت روی سطح شیشه FTO که حاوی  TiO₂  که خود یک نیمه رسانا می‏باشد، به‏عنوان بستری مناسب برای تثبیت تک لایه‏های هم جهت پروتئین باکتریورودوپسین به‏عنوان پمپ پروتونی استفاده شد که در مقایسه با فتوسل‏های با پروتئین باکتریورودوپسین چند لایه، نشان داد که هر پروتئین مستقیما نور بیشتری دریافت و مقاومت داخلی کاهش یافته، توان فتوسل‏های تک لایه در این مطالعه µA7/0 و ولتاژ آن mV190 می‏باشد که با توان فتوسل‏های تجمع یافته (µA2/0)،  µA5/0 و با ولتاژ آن (mV165)، mV25 تفاوت داشته یعنی فتوسل‏های تک لایه نسبت به تجمع بازدهی بیشتری داشت، این بازدهی فتوسل‏ها در فاصله 25 سانتی‏متری نور لامپ 40 وات و شدت روشنایی lux450 تست شد که نشان دهنده این است که می‏توان از این فتوسل جهت اماکن عمومی و یا حتی در داخل منازل برای جلوگیری از هدر رفت انرژی استفاده کرد. با این تفاسیر مشخص شد که تکنیک لانگ مویر روشی بسیار مناسب برای تثبیت پروتئین باکتریورودوپسین به‏صورت تک لایه بر روی بستر حاوی نانو ذرات (دی اکسید تیتانیوم) با حفظ حداکثر فعالیت می‏باشد، پیشنهاد می‏شود که برای بازدهی بیشتر از مولکول‏های میانجی نانوساختاری مانند نانو ذرات رس یا نانو ذرات اکسید روی (به‏خاطر خاصیت فتو کاتالیستی زیاد) و به‏عنوان علم روز و عوامل بهبود دهنده کیفیت فیلم استفاده شود، شاید در بازدهی فتوسل‏های خورشیدی ارگانیک موثر واقع شوند.

تشکر و قدردانی

در پایان از دکتر سجاد جانفزا و همکاران که در انجام این تحقیق کمک و یاری نموده اند کمال تشکر و قدردانی به‏عمل می‏آید.