Effects of Silver Nanoparticles on Sperm Parameters, Serum and Seminal plasma Reactive Oxygen Species

R, A; T, A; P, F; R, S; R, SA; Sh, HR

doi:10.52547/JCT.5.4.394

Effects of Silver Nanoparticles on Sperm Parameters, Serum and Seminal plasma Reactive Oxygen Species

Document Type : Research - Scientific

Authors

A R

A T

F P

S R

SA R

HR Sh

10.52547/JCT.5.4.394

Abstract

Aim: Due to the role of silver nanoparticles on elevation of reactive oxygen species, and high sensitivity of spermatozoa to these agents, it is possible that silver nanoparticles reduce the fertility potential of spermatozoa. The aim of present study was to evaluate the effects of silver nanoparticles on sperm parameters and the concentration of reactive oxygen species in mouse serum and seminal fluid.
Material and Methods: In this experimental study, 24 adult male Syrian mice were divided into a control and three experimental groups. The experimental groups received silver nanoparticles orally at different doses (0.05, 0.1 and 0.2 ml orally) for 5 weeks. Then blood samples were taken from hearts to examine the Malondialdehyde (MDA) concentration by spectrophotometry. In addition, to analyze the sperm parameter cauda epididymis was dissected and swim-out spermatozoa were analyzed.
Results: The 3rd experimental group (highest dose) significantly showed the lowest mean of sperm count (16±2.6), the lowest percentage of rapid progressive motile spermatozoa (18.16±5.45), the highest rates of abnormal spermatozoa (35.83±4.4) and the highest concentrations of MDA in serum and seminal plasma compared to the control and other experimental groups.
Conclusion: The silver nanoparticles as a factor which increase the effects of free radicals and reactive oxygen species in serum and seminal fluid caused reduction of sperm parameters.

Keywords

Silver nanoparticles

Sperm

Reactive Oxygen Species

Seminal fluid

Mouse

نانو تکنولوژی به فناوری موادی اطلاق می‏شود که ابعادی در حدود 1 تا 100 نانومتر دارند (1). نانوذرات دارای ویژگی‏های فیزیکی و شیمیایی منحصر به فردی هستند، به‏طوری‏که حتی این خصوصیات در موادی که از آن‏ها مشتق می‏شوند، دیده نمی‏شود. اندازه کوچک و مساحت سطحی بالای نانوذرات، سبب افزایش فعالیت شیمیایی آن‏ها گردیده و به آن‏ها اجازه می‏دهد که به‏عنوان یک کاتالیست با کارایی بالا عمل نمایند (2 و 3). این افزایش در فعالیت شیمیایی و فیزیکی، در بسیاری از نانوذرات منجر به کاربردهای گسترده آن‏ها در فرآیندهایی نظیر انتقال داروها، واکسن، تشخیص یا درمان انواعی از بیماری‏ها گردیده است (4). نانوذرات نقره یکی از محصولات با ارزش تکنولوژی نانو می‏باشند که امروزه کاربردهای گسترده‏ای در علوم مختلف، به‏ویژه بیولوژی و پزشکی پیدا نموده‏اند. به‏عنوان مثال در زمینه پزشکی، از نانوذرات نقره به‏عنوان پوششی برای ترمیم زخم‏ها، تهیه ابزارهای جراحی و پروتزهای استخوانی و دندانپزشکی استفاده می‏شود. همچنین به‏علت خاصیت ضد میکروبی، می‏توان از این پوشش در صنایع بسته بندی مواد غذایی استفاده کرد (5). دلیل اصلی برای کاربردهای گسترده نانوذرات نقره خاصیت ضد میکروبی آن می‏باشد. نانوذرات نقره دارای خواص ضد باکتریایی، ضد قارچی و ضد ویروسی و ضد تک‏یاخته‏ها هستند، به‏طوری‏که با افزودن مقدار اندکی از این نانوذرات در پوشش‏ها می‏توان سطوح ضد میکروبی ایجاد کرد و آلودگی‏ها را برطرف نمود (5، 6 و7). با افزایش کاربردهای نانوذرات نقره، احتمال در معرض قرار گرفتن انسان توسط این مواد نیز افزایش می‏یابد (8 و 9). تا کنون اثرات سمی برخی از نانو مواد تا حدودی ثابت شده و همین مسئله استفاده از آن‏ها را تا حدودی محدود کرده است (10). نانو ذرات ممکن است از مسیر‏های متفاوت وارد بدن شوند و این موضوع تعیین خطرات مربوط به هر ماده را با دشواری روبرو می کند. گزارش شده است که نانوذرات نقره هنگامی‏که از راه دهانی، تنفسی یا زیر پوستی مصرف شوند، به جریان خون وارد شده و در بعضی از اندام‏های بدن انباشته می‏شوند که موجب مسمومیت کبدی یا کلیوی و یا سلول‏های خونی می‏شود ( 11- 15 ).

گونه‏های فعال اکسیژن (ROS )، واسطه‏های شیمیایی با نیمه عمر پائینی هستند که در مسیرهای متابولیکی همه سلول‏های هوازی از اکسیژن مشتق می‏شوند. رادیکال‏های آزاد به‏خاطر داشتن الکترون جفت نشده بسیار واکنش‏پذیر بوده و قادرند برای جبران کمبود اکسیژن خود، ماکرومولکول‏های زیستی نظیر آمینواسیدها یا پروتئین‏ها، قندها، لیپیدها و اسیدهای نوکلئوئیک را مورد حمله قرار داده و با آسیب شدید ساختار و عمل‏کرد سلولی نهایتا سبب مرگ زودرس سلولی می‏گردند (16 و 17). بدن انسان دارای یک سیستم دفاعی جهت مقابله با رادیکال‏های آزاد موسوم به سیستم آنتی‏اکسیدانت است. عدم تعادل بین میزان رادیکال آزاد تولید شده و ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی باعث استرس اکسیداتیو می گردد (17 و 18). هم اکنون استرس اکسیداتیو القا شده با رادیکال‏های آزاد اکسیژن، به‏عنوان یکی از مهم‏ترین عوامل پاتولوژی در بسیاری از بیماری‏ها محسوب می‏شود (18 و 19). با توجه به اینکه سلول‏های اسپرم همانند هر سلول هوازی دیگری در طی مسیرهای متابولیکی قادر به تولید ROS می‏باشند، شدیدا مستعد آسیب‏های اکسیداتیوی و نهایتا از دست دادن عمل‏کرد طبیعی خود هستند (17). زمانی‏که غلظت این رادیکال‏های آزاد بیشتر از حد فیزیولوژیک خود گردد، منجر به اثرات اکسیداتیوی جبران ناپذیری نظیر اکسیداسیون اسیدهای چرب غیر اشباع، آسیب پروتئین‏ها، آسیبDNA و مرگ زودرس یا آپوپتوزیس در سلول‏ها می‏شوند که نهایتا با عدم عمل‏کرد طبیعی سلول‏ها همراه خواهد بود (16-19).

پراکسیداسیون لیپیدها (LPO) یکی از مهم‏ترین اثرات پاتولوژیک رادیکال‏های آزاد محسوب می‏شود و به‏طور عمومی تحت عنوان فساد اکسیداتیو اسیدهای چرب دارای چند پیوند غیر اشباع‏، نامیده می‏شود (20). محصولات پراکسیداتیوی قادرند که خصوصیات فیزیکی غشاهای زیستی را تغییر دهند. بنابراین برداشت این محصولات پراکسیداتیوی لیپیدها، برای عمل‏کرد طبیعی غشاها ضروری بوده که توسط سیستم آنتی اکسیدانتی آنزیمی انجام می‏شود (20 و 21). از طرفی، اسپرم‏ها در مقایسه با دیگر سلول‏های بدن با اینکه سرشار از اسیدهای چرب در غشا خود هستند، ظرفیت آنتی اکسیدانتی موجود در سیتوپلاسم آن‏ها اندک می‏باشد. بنابراین انتظار می‏رود که سلول‏های اسپرم بر خلاف دیگر سلول‏های بدن، حساسیت بالاتری نسبت به اثرات اکسیداتیوی داشته و در معرض آسیب‏های اکسیداتیوی بیشتری قرار داشته باشند (21). از آنجایی‏که آنالیز مستقیم محصولات اولیه پرکسیداسیون لیپیدها کار بسیار مشکلی است، بنابراین بهتر است که محصولات ثانوی پرکسیداسیون لیپیدها جهت بررسی وضعیت اکسیداتیوی مورد آنالیز قرار گیرند (22). محصولات اولیه پراکسیداسیون لیپیدها، ترکیبات ناپایداری هستند که طی واکنش‏هایی چند مرحله‏ای به ترکیبات ثانوی دیگری نظیر آلدئیدها و کتون‏ها شکسته می‏شوند (23 و 24). مالون دی الدئید (MDA) یکی از محصولات ثانوی پایدار از اکسیداسیون لیپیدها می‏باشد که به راحتی قابل اندازه‏گیری است (25).

یکی از نانوذرات مهم با تاثیر بیولوژیکی فراوان، نانوذرات اکسید روی بوده که به‏طور معنی‏داری، بر تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم‏ها تاثیر منفی دارد به‏طوری‏که از نانوذرات اکسید روی به‏عنوان یک ماده سمی برای بافت بیضه یاد می‏گردد (26). مطالعات نشان داده‏اند که نانوذرات نقره نیز به‏طور معنی‏داری، مرگ سلولی را از طریق مکانیسم‏های مرتبط بااسترس اکسیداتیو که موجب آسیب رساندن به DNA در سلول‏های پستانداران می‏شود، افزایش می‏دهند (10). اثرات کلوئید نانوذرات نقره بر روی پارامترهای اسپرم قوچ در شرایط آزمایشگاهی بررسی شد و نتایج حاصل از این آزمایش شاهدی بر ادعای سمیت نانونقره بر روی سلول‏های اسپرم می‏باشد (27). به‏نظر می‏رسد که نانوذرات نقره اثرات جدّی و معنی‏داری بر روی فرآیند اسپرماتوژنز و همچنین تعداد سلول‏های اسپرم ساز و واکنش اکروزومی اسپرم موش صحرایی داشته باشد (28).

با توجه به نقش نانوذرات نقره در تولید و افزایش رادیکال‏های آزاد و حساسیت بیش از حد سلول‏های اسپرم نسبت به اثرات پاتولوژیک گونه‏های فعال اکسیژن و کاهش سطح آنتی‏اکسیدانتی اسپرم، احتمال می‏رود که نانو ذرات نقره سبب اثرات پاتولوژیک و استرس اکسیداتیو در مایع سمینال و در پی آن کاهش کیفیت و توانایی بارورسازی اسپرم گردند. به‏همین منظور در این مطالعه اثر احتمالی نانوذرات نقره بر ایجاد استرس اکسیداتیو در مایع سمینال و خون و همچنین کیفیت اسپرم موش مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‏ها

نانو ذرات نقره به ابعاد40 نانومتر به‏صورت محلول با غلظت ^4-10× 43/1 مولار و وزن 868/107 گرم سنتز شده از پژوهشکده علوم پایه نانوفناوری دانشگاه پیام نور استان یزد تهیه گردید.

به‏منظـور انجام این مطالعه تجـربی، 24 سرمـوش نر بالغ از نـژاد

سوری به 4 گروه 6 تایی شامل یک گروه کنترل و 3 گروه تجربی تقسیم شده و در شرایط کنترل شده درجه حرارت 20 تا 25 درجه سانتی‏گراد، رطوبت حدود 55 تا 60 درصد با دوره نوری 12ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی با دسترسی آسان به آب و غذای کامل طبق ضوابط قانون نگه‏داری از حیوانات آزمایشگاهی نگه‏داری شدند. موش‏های گروه مطالعه به‏مدت 35 روز (بیش از یک دوره اسپرماتوژنز) به‏طور روزانه مورد تجویز دهانی نانوذرات نقره از طزیق گاواژ قرار گرفتند. گروه مورد مطالعه اول، دوم و سوم هر روز به‏ترتیب دوزهای 50 ، 100 و 200 میکرولیتر نانوذرات نقره محلول و گروه کنترل تنها سرم فیزیولوژی به‏صورت دهانی دریافت می‏نمودند.

پس از این مدت موش‏ها از لحاظ وزنی اندازه گیری و سپس توسط اتر بی‏هوش و با استفاده از سرنگ 5 میلی‏لیتر از قلب موش‏ها (بطن راست) عمل خون‏گیری انجام شد. سرم حاصل از هر نمونه در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری و برای اندازه‏گیری غلظت مالون در آلدئید (MDA) با استفاده از روش اسپکتروفتومتری مورد استفاده قرار گرفت (29).

جهت بررسی پارامترهای اسپرمی پس از بی‏هوش کردن موش‏های مورد مطالعه، ناحیه شکم برش داده شد و دم اپی‏دیدیم که در قطب تحتانی هر بیضه قابل مشاهده بود، توسط قیچی استریل بریده و در محیط کشت HamsF10 قرار گرفت. سپس با فشردن و تکان دادن آرام، سلول‏های اسپرم به‏صورت شناور وارد محیط کشت شدند. قطعات اضافی اپی‏دیدیم از داخل ظرف برداشته شده و این محیط کشت حاوی سوسپانسیون اسپرم به‏مدت 30 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد با فشار CO₂، 5 درصد انکوبه شد. سپس سوسپانسیون حاوی اسپرم مربوط به هر نمونه توسط سمپلر برداشته شده و مورد آنالیز قرار گرفت. باقیمانده نمونه‏ها به میکروتیوپ انتقال یافتند و به‏مدت 10 دقیقه در دور g4000 سانتریفوژ گردیدند. پس از آن مایع رویی برداشته شده و سریعا در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شده تا بعدا برای اندازه گیری MDA مورد بررسی قرار گیرند.

پارامتر‏های اسپرم: مطالعه شکل ظاهری (morphology) اسپرم‏ها، با استفاده از پروتکل استاندارد پاپانیکولا انجام گردید (30). این نوع رنگ آمیزی که یکی از روش‏های معمول برای بررسی مورفولوژی اسپرم می‏باشد، نواحی آکروزوم و بخش سر و قطعه میانی اسپرم رنگ‏آمیزی شده و اشکال طبیعی و غیرطبیعی اسپرم، در زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی ×100 مورد بررسی قرار می‏گیرند. مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم شامل اسپرم‏هایی با دو سر، سر بزرگ، سر کوچک، سر گرد، بدون آکروزوم، بدون سر، دم بلند یا کوتاه، بدون دم و یا دم پیچ خورده و قطره سیتوپلاسمی در 200 اسپرم مشاهده گردیده و گزارش شدند.

برای بررسی تحرک (motility) اسپرم‏ها‏، مقدار 10 میکرولیتر از هر نمونه را در مرکز Makler chamber قرار داده و پس از گذاشتن درپوش توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×40 مشاهده و شمارش گردیدند. در این بررسی، تعداد 200 سلول اسپرم مورد شمارش قرار گرفته و از این تعداد درصد تحرک اسپرم بر اساس معیار سازمان جهانی سلامت (WHO) مشخص گردید (31 و 32). بر این اساس، تحرک اسپرم‏ها به گروه‏های بدون تحرک (Immotile)، متحرک با حرکت پیش رونده سریع (Fast progressive motile)، متحرک با حرکت پیش رونده آهسته (Slow progressive motile) و اسپرم‏های متحرک به فرم درجا (Non-progressive motile) تقسیم شدند.

مطالعه قابلیت حیات (Viability) اسپرم‏ها به‏روش بررسی سلامت غشا سیتوپلاسمی اسپرم، با استفاده از رنگ آمیزی ائوزین و توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×100 انجام گردید (31). اسپرم‏های زنده به‏دلیل سالم بودن غشا سیتوپلاسمی رنگ ائوزین وارد شده به‏داخل سلول را مجددا خارج می‏کنند و بنابراین در زیر میکروسکوپ بدون رنگ قابل مشاهده هستند. در حالی‏که که اسپرم‏های مرده به‏دلیل غشا آسیب دیده رنگ وارد شده به‏داخل سلول را حفظ نموده، بعد از شستشو همچنان به به حالت رنگی مشاهده می‏شوند.

اندازه گیری MDA در سرم و مایع سمینال: نمونه‏های سرم و مایع سمینال فریز شده بعد از قرار گرفتن در دمای اتاق برای اندازه گیری MDA توسط دستگاه اسپکتروفتومتر مورد استفاده قرار گرفتند. به‏طور خلاصه 50 میکرولیتر از نمونه های مورد آزمایش با مقدار 150 میکرولیتر از محلول آب مقطر دو بار تقطیرشده مخلوط گردیده و به مدت یک ساعت در حمام آب گرم در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند. با اضافه کردن 300 میکرو لیتر تری کلرواستیک اسید 20 درصد واکنش متوقف شده و به مدت 10 دقیقه در دور rpm 3000 سانتریفوژ گردیدند. سپس 200 میکرو لیتر از محلول رویی را برداشته شده و به آن 200 میکرو لیتر محلول تیوباربیتوریک اسید 67 درصد اضافه شد و به‏مدت 10 دقیقه در دمای 100 درجه سانتی‏گراد در حمام آب جوش نگه‏داری گردید. پس از سرد شدن نمونه‏ها، جذب نوری در طیف 532 نانومتر توسط دستگاه اسپکتروفتومتر خوانده شد (24 و 29).

آنالیز آماری: برای انجام محاسبات آماری از نرم افزار آماری SPSS Windows Version 16 استفاده گردید. میانگین تمام پارامترها به‏صورت Mean±SD و سطح معنی‏دار 05/0 p< نشان داده شد. مقایسه میانگین غلظت کیفیت پارامترهای اسپرمی و غلظت MDA در بین تمام گروه‏ها با استفاده از آنالیز ANOVA و بین دو گروه با آزمون t-test مورد ارزیابی قرار گرفت. نمودار استاندارد غلظت‏های مختلف MDA به‏کمک نرم افزار اکسل رسم گردید.

نتایج

در بررسی وزن حیوانات مورد مطالعه، تفاوت معنی‏داری در بین گروه‏ها و همچنین قبل و بعد از تیمار موش‏ها با نانوذرات نقره مشاهده نگردید. مقایسه میانگین تعداد اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف، تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏های مختلف نشان داد. به‏طوری‏که گروه مطالعه سوم، که بیشترین دوز مصرفی نانوذرات نقره را دریافت کرده بود، به‏طور معنی‏داری کمترین میانگین تعداد اسپرم در مقایسه با گروه کنترل و حتی در مقایسه با گروه‏های مورد مطالعه اول و گروه دوم بود (جدول1). مقایسه میانگین درصد حرکت پیش رونده سریع اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏ها نشان داد. میانگین درصد اسپرم‏هایی با حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 3 به‏طور معنی‏داری کمتر از سایر گروه‏ها بود. از طرفی درصد حرکت پیش رونده سریع در گروه مورد مطالعه 1 در مقایسه با سایر گروه‏ها و حتی گروه کنترل به‏طور معنی‏داری بیشتر بوده است. تفاوت معنی‏داری بین گروه کنترل و گروه 2 مشاهده نگردید (جدول1). در مقایسه میانگین درصد حرکت پیشرونده آهسته اسپرم‏ها نیز، تفاوت معنی‏داری بین گروه‏های مورد مطالعه 3 و 2 مشاهده نگردید. همچنین درصد اسپرم‏های با حرکت آهسته در گروه مورد مطالعه 3 و 1 به‏طور معنی‏داری بیشتر از گروه 2 گزارش گردید (جدول1). میانگین درصد حرکت غیرطبیعی به فرم درجا در گروه 3 در مقایسه با سایر گروه‏ها به‏طور معنی داری افزایش یافته بود. درحالی‏که گروه کنترل به‏طور معنی دارای کمترین میانگین درصد اسپرم‏های متحرک به فرم درجا در مقایسه با گروه 2 و گروه 3 داشت. تفاوت معنی‏داری بین میزان تحرک گروه کنترل و گروه 1 مورد مطالعه مشاهده نگردید (جدول1).

مقایسه مورفولوژی اسپرم‏ها بین گروه‏های مختلف نشان داد که درصد اسپرم‏های غیرطبیعی در گروه‏های مورد مطالعه، به‏ویژه در گروه‏های دریافت کننده دوزهای بالاتر نانوذرات نقره بیشتر بوده و حد‏اکثر تفاوت بین گروه 3 و گروه کنترل مشاهده گردید (جدول1).

آنالیز میانگین درصد قابلیت حیات اسپرم‏ها، تفاوت معنی‏داری را بین گروه‏های مختلف نشان داد. در این میان گروه مورد مطالعه دوم و سوم کمترین درصد اسپرم‏های زنده را در مقایسه با گروه کنترل داشتند. تفاوت معنی داری بین درصد اسپرم‏های زنده در گروه کنترل و گروه اول مشاهده نگردید (جدول1).

جدول 1: مقایسه میانگین پارامترهای اسپرم در گروه های مختلف

پارامترهای اسپرم	گروه کنترل (n=6)	گروه مطالعه a (n=6)	گروه مطالعه b (n=6)	گروه مطالعه c (n=6)	p- value abc	p-value ab	p-value ac	p-value bc
تعداد اسپرم ml (×106 )	23/66±3/55	13/5±4/59	22/17±3/08	16±2.6	*0/004	0/897	*0/008	0/053
اسپرم های زنده (%)	63/16±5/03	61/66±3/77	59±7/29	51/4±8	*0/029	0/027	0/661	0/219
حرکت پیشرونده سریع (%)	35/83±4/49	49±8/14	37/6±4/33	18/16±5/45	*0/000	*0/005	*0/000	*0/000
حرکت پیشرونده آهسته (%)	33/5±2/34	22/33±5/64	15/6±2/51	22/33±5/68	*0/000	*0/019	1/000	*0/019
متحرک به فرم درجا (%)	19/16±4/7	16/83±3/54	28/2±3/11	44±5/83	*0/000	*0/001	*0/000	*0/000
اسپرم های بی حرکت (%)	11/5±2/88	11/66±3/38	18/4±5/22	17±3/28	*0/009	*0/007	*0/022	0/541
اسپرم های با مورفولوژی طبیعی (%)	70/83±5/47	69/17±3/6	64/67±3/8	64/17±5/6	0/192	0/262	*0/027	0/973

گروه دریافت کننده دوز 50 میکرولیتر نانو ذرات نقره = a

گروه دریافت کننده دوز 100 میکرولیتر نانو ذرات نقره = b

گروه دریافت کننده دوز 200 میکرولیتر نانو ذرات نقره = c

در بخش بررسی میانگین غلظت MDA سرم، غلظت این ماده از گروه کنترل به گروه 3 رو به افزایش بوده و تفاوت معنی‏داری بین گروه 3 و گروه کنترل مشاهده شد (جدول 2). میانگین غلظت MDA مایع سمینال نیز در گروه‏های مورد مطالعه 2 و 3 در مقایسه با گروه‏های کنترل و گروه 1 به‏طور معنی‏داری افزایش یافته بود (جدول 2).

جدول 2: مقایسه میانگین غلظت MDA در گروه‏های مختلف

غلظت MDA

برحسب nmol/ml

گروه کنترل (n=6)

گروه مطالعه a (n=6)

گروه مطالعه b (n=6)

گروه مطالعه c (n=6)

p- value

abc

p-value ab

p-value

مایع سرم

0/331

0/332

0/360

0/430

0/069

0/172

*0/000

*0/008

مایع سیمن

0/277

0/278

0/323

0/346

*0/026

*0/000

0/057

بحث

در این پژوهش, اثرات مضر نانوذرات نقره 40 نانومتر با دوزهای مختلف (50 ، 100 و 200 میکرولیتر) برروی کیفیت اسپرم و استرس‏های اکسیداتیو موش بررسی گردیده و نتایج با گروه کنترل مورد مقایسه قرار گرفت. نتایج حاصل نشان داد که افزایش دوز، اثر سمیت بیشتری را در حیوان ایجاد می‏کند. حیوانات گروه تجربی سوم که بیشترین دوز مصرفی نانوذرات نقره را دریافت کرده بودند، به‏طور معنی‏داری کمترین میانگین تعداد اسپرم، کمترین درصد اسپرم‏های با حرکت پیش رونده سریع، بیشترین درصد اسپرم‏های غیرطبیعی و بیشترین میزان غلظت MDA در سرم و مایع سمینال در مقایسه با گروه کنترل و حتی گروه‏های مورد مطالعه اول و گروه دوم بودند. به‏طور کلی می‌توان گفت که اثر نانوذره نقره بر کیفیت اسپرم قابل ملاحظه بود.

همانطور که در بخش مقدمه عنوان گردید نانوذرات فلزی دارای اثرات مخربی بر سیستم‏های بیولوژیکی و بافت‏های مختلف بدن می‏باشند. در یک مطالعه اثر نانوذرات نقره بر روی سلول‏های خونی موش مورد بررسی گرفته و نشان داده شد که نانوذرات نقره در دوزهای بالا (200 میلی‏گرم بر کیلوگرم) منجر به مهار فرآیند انعقاد توسط پلاکت‏ها در خون و در نتیجه افزایش زمان خون‏ریزی می‏گردند. علاوه بر این نتایج آن‏ها مشخص نمود که تعداد سلول‏های خونی از جمله تعداد سلول‏های سفید و قرمز، غلطت هموگلوبین، تعداد نوتروفیل و لنفوسیت به‏طور معنی‏داری در مقایسه با گروه‏های کنترل تغییر کرده است (11). یافته‏های دیگر نیز نشان‏دهنده افزایش آپوپتوزیس و نکروز بافتی به‏دنبال مصرف نانوذرات نقره در بافت‏هایی همچون ریه و بیضه می‏باشند (12).

مطالعات متعددی نیز اثر نانوذرات به ویژه نانوذرات نقره را بر پتانسیل باروری و عمل‏کرد اسپرم مورد بررسی قرار داده‏اند. در بررسی که اخیرا توسط گروه تحقیقاتی Talebi صورت پذیرفت، تاثیرات توکسیک نانوذرات روی بر فرآیند اسپرماتوژنز و کاهش سلول‏های زایای لوله‏های اسپرم ساز موش مشاهده گردید (26). همچنین گروه تحقیقاتی Komatsu ضمن بررسی اثر نانوذرات اکسید تیتانیوم (TiO2) بر توانایی باروری موش‏ها، نشان دادند که این نانوذرات با القا مسیر استرس اکسیداتیو سبب کاهش شدید سلول‏های لایدیگ، قابلیت حیاتی اسپرم و همچنین بیان برخی از ژن‏ها می‏شوند (33).

در مطالعه حاضر علی‏رغم اینکه ناهنجاری‏های DNA اسپرم مورد آنالیز قرار نگرفت ولی به‏دلیل افزایش میزان MDA سرم و مایع سمینال می‏توان نتیجه گرفت که طبیعتا بایستی اسپرم‏هایی با ناهنجاری‏های کروماتین نیز به‏دنبال تیمار با نانوذرات نقره افزایش یافته باشد. در راستای یافته‏های تحقیق حاضر، در مطالعه‏ای مشابه ضمن بررسی اثر نانوذرات نقره بر میزان اکسیداسیون DNA و پارامترهای اسپرمی نشان داده شده است که افزایش اکسیداسیون DNA و تغییر مورفولوژی مجاری اسپرم‏ساز در گروه‏های تیمار شده با نانوذرات نقره به‏میزان معنی‏داری بالاتر از گروه کنترل بوده است. لازم به‏ذکر است که در این پژوهش تغییری در تعداد اسپرم‏هایی با مورفولوژی غیرطبیعی بین گروه‏ها مشاهده نگردید (34).

یکی از یافته‏های تحقیق حاضر مشاهده کاهش تعداد اسپرم به‏دنبال مصرف نانوذرات نقره در موش‏ها بود. در یک پژوهش، اثرات کلوئید نانوذرات نقره بر پارامترهای اسپرماتوزوای قوچ در شرایط آزمایشگاهی بررسی گردیده و نتایج حاصل از این آزمایش، سمیت نانوذرات نقره بر فرآیند اسپرم‏سازی و کاهش تعداد اسپرماتوزوا مشاهده گردید (27). همچنین Miresmaeili و همکاران (28) نشان دادند که نانوذرات نقره اثرات جدی و معنی‏داری بر فرآیند اسپرماتوژنز و تعداد سلول‏های اسپرم‏ساز و همچنین واکنش اکروزومی در سلول‏های اسپرمی موش صحرایی دارد.

همانطور که در تحقیق ما مشاهده گردید، وضعیت استرس اکسیداتیو در مایع سمینال و سرم نمونه‏های مورد بررسی، عامل مهمی در کاهش کیفیت اسپرم محسوب می‏گردد و با توجه به اینکه نانوذرات نقره با مکانیسم‏های متعددی سبب افزایش سطح رادیکال‏های آزاد می‏گردند، بنابراین انتظار می‏رود که درصد اسپرم‏هایی با DNA آسیب دیده و جهش یافته نیز در حیوانات مورد آزمایش افزایش یابد. لازم به‏ذکر است که این وضعیت می‏تواند سبب بروز آسیب های متعددی در نسل های آینده گردد (35).

آنالیز حاصل از کیفیت اسپرم و میزان MDA در این تحقیق نشان داد که کیقیت اسپرم موش‏های دریافت کننده نانوذرات نقره در مقایسه با گروه کنترل به‏طور معنی‏داری کاهش یافته و این کاهش وابسته به دوز مصرفی می‏باشد. به‏عبارتی با افزایش دوز نانوذرات نقره، کیفیت پارامترهای اسپرم، به‏ویژه درصد مورفولوژی طبیعی، تعداد اسپرم‏های زنده و درصد اسپرم‏های متحرک کمتر می‏گردد. با توجه به اطلاعات موجود به نظر می‏رسد که یکی از مهم‏ترین مکانیسم‏های اثر نانوذرات نقره بر کیفیت اسپرم، تشدید استرس اکسیداتیو و به‏ویژه پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی اسپرم‏ها باشد (34 ،17). با توجه به نتایج تحقیق ما، نانوذرات نقره یکی از عوامل تشدید کننده اثرات اکسیداتیوی در سرم و مایع سمینال محسوب می‏شود که با کاهش سیالیت غشا اسپرم و پارامترهای اسپرمی همراه می‏باشد (16 و 17). اگرچه امروزه با پیشرفت تکنیک‏های مختلف، اکثر مردان نابارور ممکن است که بدون هیچ مشکل خاصی صاحب فرزند شوند، اما احتمال اینکه یک اسپرم غیر طبیعی (مثلا اسپرمی که در یک یا چند ژن خاص دچار جهش شده باشد) به‏صورت مصنوعی (مثلا از طریق ICSI) در بارورسازی تخمک شرکت نماید، وجود دارد و این مشکل ممکن است که اولا منجر به یک لقاح ناموفق گردد و یا اینکه در نسل‏های آینده اثرات خود را نشان دهد و سبب اثرات شدیدی در نوزادان مثل انواع سرطان و یا عدم تکامل طبیعی جنین گردد. بنابراین بررسی و رسیدگی به استفاده از نانوذرات نقره در زمینه‏های مختلف از اهمیت خاصی برخوردار بوده و به‏عنوان یکی از فاکتورهای اساسی موثر بر روی توانایی باروری مردان باید به دقت مورد بررسی قرار گیرد و تحقیقات بیشتر، درک مکانیسم دقیق روند تاثیر نانوذرات بر بافت‏های مختلف را روشن خواهد ساخت.

نتیجه گیری

مطالعه حاضر نشان داد که مصرف نانو ذرات نقره علاوه کاهش کیفیت اسپرم، سبب افزایش میزان MDA در مایع سمینال و سرم خون موش می‏گردد. همچنین مشخص گردید که اثرات فوق وابسته به دوز بوده و با افزایش دوز مصرفی این اثرات مضر شدیدتر بروز می نمایند.

تشکر و قدردانی

با تشکر از راهنمایی‏های بی شائبه اساتید و همکاران پژوهشکده علوم پایه و فناوری نانو فناوری دانشگاه پیام نور استان یزد، مرکز درمانی و تحقیقاتی ناباروری و گروه فیزیولوژی دانشگاه علوم پزشکی شهید صدوقی یزد که در مراحل مختلف این تحقیق همکاری داشتند.

Masciangioli T, Zhang W. Environmental technologies at the nanoscale. Environ. Sci. Technol. 2003; 37(5): 102.
Erb U, Aust KT, Palumbo G. Nanostructured materials: processing, properties and potential applications. New York: Noyes Publications; 2002: 179-222.
Goddard WA, Brenner DW, Lyshevski SE, Iafrate GJ. Handbook of nanoscience engineering, and technology. USA: CRC Press; 2002: 22-47.
Chen X, Schluesener HJ. Nanosilver: a nanoproduct in medical application. Toxicol Lett. 2008; 176 (1): 1–12.
Buzea C, Pacheco I, Robbie K. Nanomaterials and nanoparticles:Sources and toxicity. Biointerphases. 2007; 2(4): 17-71.
Gibbons B, Warner L. The role of antimicrobial silver nanotechnology. Medical Device and Diagnostic Industry Magazine. 2005; 27(5): 164-169.
Panacek A, Kvitek L, prucek R, Kolar M. et al Silver colloid nanoparticles: synthesis, characterization, and antibacterial activity. J Phys Chem. 2006; 110(33): 16248-16253.
Tang J, Xi T. Status of biological evaluation on silver nanoparticles. Sheng Wu Yi Xue Gong Cheng Xue Za Zhi. 2008; 25(4): 958-61.
Panyala NR, Pena-Mendez EM, Havel J. Silver or silver nanoparticles: A hazardous threat to the environment and human health? J.Appl.Biomed. 2008; 6: 117-129.
10. Ostiguy C, Soucy B, Lapointe G, Woods C, et al. Health Effects of Nanoparticles Second ed. Quebec: IRSST; 2008: 589-590.
11. Hamrahi-michak M, Sadeghi SA, Haghighi H, Ghanbari-kakavandi Y, et al. The toxicity effect of cerium oxide nanoparticles on blood cells of male Rat. Annals of Biological Research. 2012; 3(6): 2859-2866.
12. Ranjbar Sardari RR, Rezaei Zarchi S, Talebi A, Nasri S. et al. Toxicological effects of silver nanoparticles in rats. African Journal of Microbiology Research. 2012; 6(27): 5587-5593.
13. Parka E, Bae E. Repeated-dose toxicity and inflammatory responses in mice by oral administration of silver nanoparticles. Environmental Toxicology and Pharmacology. 2010; 30(2): 162–168.

14. Kim YS, Kim JS, Cho HS, Rha DS, et al Twenty-eight day oral toxicity, genotoicity, and gender-related tissue distribution of silver nanoparticles in Sprague–Dawley rats. Inhal. Toxicol. 2008; 20(6): 575–583.

15. Hyun JS, Lee BS, Ryu HY, Sung JH, et al. Effects of repeated silver nanoparticles exposure on the histological structure and mucins of nasal respiratory mucosa in rats. Toxicol. Lett. 2008; 182 (1–3): 24–28.

16. Warren JS, Johnson KJ, Ward PA. Oxygen Radicals in Cell Injury and Cell Death Pathol. Immunopathol. Res. 1987; 6(5-6): 301–315.

17. Sikka SC, Rajasekaran M, Hellstrom WJ. Role of oxidative stress and antioxidants in male infertility. J Androl. 1995; 16(6): 464-8.

18. Agarwal A, Saleh RA, Bedaiwy MA. Role of reactive oxygen species in the pathophysiology of humn reproduction. Fertil Stil. 2003; 79(4): 829-843.

19. Ochsendorf FR. Infection in male genital tract and reactive oxygen species. Human reproduction Update. 1999; 5(5): 399-420.

20. Saleh RA, Agarwal A. Oxidative stress and male infertility: From Research Bench to Clinical Practice. Journal of Andrology. 2002; 23(6): 737-752.
21. Zabludovsky N, Eltes F, Geva E, Berkovitz E, et al. Relationship between human sperm lipid peroxidation, comprehensive quality parameters and IVF outcome. Andrologia. 1999; 31: 91-8.

22. Aitken RJ, Clarkson JS, Fisher S. Generation of reactive oxygen species, lipid peroxidation and human sperm function. Biol Reprod. 1989; 40: 183-197.

23. Iwasaki A, Gagnon A. Formation of reactive oxygen species in spermatozoa of infertile patients. Fertil Steril. 1992; 57: 409-416.

24. Buege JA, Aust SD. Microsomal lipid peroxidation. Methods Enzymol. 1978; 105: 302-310.

25. Tavilani H, Doosti M, Saiedi H. Malondialdehyde levels in sperm and seminal plasma of asthenozoospermic and its relationship with semen parameters. Clinica Chemica Acta. 2005; 356(1-2): 199-203.

26. Talebi AR, Khorsandi L, Moridian M. The effect of zinc oxide nanoparticles on mouse spermatogenesis. J Assist Reprod Genet. 2013; 30(9): 1203–1209.

27. Mirshokraei P, Hassanpour H, Akhavan Taheri M, Riyahi M, et al. The in vitro effects of nanosilver colloid on kinematic parameters of ram spermatozoa. Iranian Journal of Veterinary Research. 2011; 12: 317-323.

28. Miresmaeili SM, Halvaei I, Fesahat F, Fallah A, et al Evaluating the role of silver nanoparticles on acrosomal reaction and spermatogenic cells in rat. Iran J Reprod Med. 2013; 11(5): 423-430.

29. Siddiqi N, Abdelhalim MAK, El-Ansari LK, Alhomida AS, et al. Identification of potential biomarkers of gold nanoparticle toxicity in rat brains. JNI. 2012; 9(123): 1-7.

30. Zare Z, Eimani H, Mohammadi M, Mofid M, et al. The Effect of Orally Administered L-carnitine on Testis Tissue, Sperm Parametrs and Daily Sperm Production in Adult Mice.Yakhte medical journal. 2010; 11(4): 382-389.

31. World Health Organization (WHO) Laboratory manual for the examination of human and sperm-cervical mucus interaction. 4^th Ed Cambridge university press; 1999.

32. Lin MH, Morshedi M, Stisombot C, Nassar A, et al. Plasma membrane integrity of cryopreserved human sperm: an investigation of results of the hyposomatic test, the water test and eosin- Y staining. Fertil Steril.1998; 10: 1148-55.

33. Komatsu T, Tabata M, Kubo-Lrie M, Shimizu T, et al. The effects of nanoparticles on mouse testis Leydig cells in vitro. Toxicol In Vitro. 2008; 22(8): 1825-1831.

34. Gromadzka-Ostrowska J, Dziendzikowska K, Lankoff A, Dobrzyńska M, et al. Silver nanoparticles effects on epididymal sperm in rats. Toxicol Lett. 2012; 214(3): 251-8.

35. Braydich-Stolle LK, Lucas B, Schrand A, Murdock RC, et al. Silver nanoparticles disrupt GDNF/Fyn kinase signaling in spermatogonial stem cells. Toxicological Scences. 2010; 116(2): 577-589.