مقدمه

شوک حرارتی بیان ژن‌‌های بیشماری از جمله Hsp70 را افزایش می‌دهد. سازش سلولی به شوک حرارتی مکانیسم بسیار پیچیده ای می‌باشد. چگونگی پاسخ سلول به شوک حرارتی به سکانس ژن و مقاومت نسبت به گرما بستگی دارد و سلول را وادار به تحریک بقا می‫کند و یا القای آپوپتوزیس در آن را سبب می‌شود (2-1). پروتئین‌های خانواده Hsp70 در محدوده وزنی 68 تا 74 کیلودالتون می‌باشند و تقریبا در همه ارگانیسنم‌ها و ارگانل‌ها یافت می‌شوند. در پستانداران و اغلب یوکاریوت‌ها این پروتئین‌ها در تمام اجزای سلولی نظیر سیتوزول، میتوکندری و شبکه اندوپلاسمیک یافت می‌شوند و در اعمالی نظیر تاخوردن پروتئین‌ها، انتقال پروتئین‌ها از غشا و تجزیه پروتئین‌ها دخالت دارند (4-3). نقش Hsp70 در تا شدن پروتئین‌های غیر طبیعی به سه فعالیت مرتبط با یکدیگر تقسیم می‌شود: جلوگیری از تجمع پروتئین‌ها، تا کردن پروتئین به شکل طبیعی و تا کردن مجدد پروتئین‌های تجمع یافته. همچنین اشکال تحریک شده‌ی Hsp70، نقش مرکزی را در کنترل هومئوستاز پروتئین‌ها دارند (5). افزایش سطح Hsp70 در جلوگیری از تجمعات پروتئینی در برخی از بیماری‌ها مانند پارکینسون، آلزایمر، هانتینگتون و سرطان ثابت شده است (7-6). از آنجایی‫که چپرون‌ها قادر به کاهش میزان تجمع پروتئین‌های دناتوره و افزایش راندمان تاخوردگی مجدد پروتئین‌ها می‫باشند، به‫منظور مطالعه‌ی فعالیت چپرونی در شرایط in vivo از تکنیک‫های مختلفی در این راستا استفاده می شود، اما بسیاری از این روش‌ها مستلزم لیز سلولی و استخراج پروتئین کل از سلول می باشد. به‫منظور رفع این مشکل و توسعه‫ی روشی که بتوان به‫صورت Real Time به بررسی تغییرات اعمال شده پروتئینی درون سلول پی برد، سیستم بیان هم‫زمان چپرون و ژن گزارش‫گر برای اولین بار توسط Schroder در سال 1993 برای سلول های E. coli پیشنهاد شد (8)، پس از آن نیز فرضیه‌ی نقش sHsp ها در حفاظت از پروتئین‌های گزارش‫گر در سال 1997 توسط Forreiter و همکاران در مورد Hsp17.6 آرابیدوپسیس در شرایط in vivo مورد حمایت قرار گرفت (9) سرانجام به سایر سلول‌ها نیز تعمیم داده شد (10). در بررسی‌های صورت گرفته در این خصوص تاکنون، از الحاق ژن گزارش‫گر و نیز چپرون مورد نظر به ژنوم سلول میزبان و یا از جایگیری درون سلولی ژن گزارش‫گر و چپرون ویژه در یک وکتور استفاده شده است و وکتور نوترکیب مشتق شده جهت ایجاد شرایط هم القایی و هم بیانی به میزبان مناسب انتقال یافته است (11و9). آنزیم لوسیفراز به‫طور وسیعی در زیست فناوری و بیوتکنولوژی برای مثال در تهیه‌ی کیت‌های تشخیص سرطان، تصویربرداری از سلول‌های زنده، غربال‫گری داروها و همچنین مطالعه‌ی حیوانات ترانس ژن کاربردهای فراوان دارد (13و12). در دهه‌های اخیر این آنزیم در زیست حسگرها، ژن‌های گزارش‫گر، بررسی روابط برهم‫کنشی پروتئین‌ها و سنجش‌های آنزیمی مورد استفاده قرار گرفته است (15و14). مطالعات نشان داده که لوسیفراز یک پروتئین مونومر حساس به دما است که در جهت بررسی نقش چپرون‌ها در ممانعت و تعمیر پروتئین‌های دناتوره شده گرمایی در شرایط in vivoبه‫عنوان یک سوبسترای مناسب عمل می‌کند (16). برای مثال در مطالعات پیشین از لوسیفراز به‫عنوان یک گزارش‫گر جهت مطالعه‌ی مکانیسم عملکردsHsp ها در شرایط in vivoاستفاده شد (17). لوسیفراز به‫دلیل داشتن ویژگی‌هایی مانند سنجش بسیار حساس و تکرارپذیر بودن آن کاندیدای بسیار مناسبی در سیستم‌‌های گزارش‫گر و تصویربرداری‌های بیولومینسانس در شرایط سیستم زنده و بدون انجام لیز سلولی می‌باشد (8). بیولومینسانس یکی از انواع شیمی لومینسانس است که در آن دو ترکیب شیمیایی به نام‌های لوسیفرین (سوبسترا) و لوسیفراز (آنزیم) در این فرایند دخیل هستند. واکنش لوسیفرین با اکسیژن توسط لوسیفراز کاتالیز شده و در نهایت منجر به تولید نور می‫شود. با استفاده از دستگاه لومینومتر می‌توان فعالیت لوسیفراز را بر پایه اندازه‌گیری نور مورد سنجش قرار داد. حساسیت بیولومینسانس نسبت به فوتولومینسانس (فلورسانس) بیشتر می‌باشد زیرا در فلورسانس ذرات و آلودگی‌های محیطی می‌توانند فوتون را جذب کنند و پراش داشته باشند. علاوه بر این در غلظت‌های بالا متوسط فاصله بین مولکول‌های جذب‌کننده کاهش می‌یابد و مانع جذب فوتون در مولکول‌های دیگر می‌شود. اما از آن‫جا که بیولومینسانس یک واکنش شیمیایی است و برخورد فوتونی وجود ندارد لذا این مشکلات هم در آن دیده نمی‌شود. فقدان نقش فیزیولوژیکی لوسیفراز در باکتری E. coli امکان مطالعات غیرفعال سازی دمایی و بازیابی فعالیت آن را در شرایط in vivoبدون به خطر انداختن اعمال متابولیک ضروری سلول ایجاد می‫کند (18و8). بنابراین از آن‫جا‫که سنجش فعالیت لوسیفراز توسط دستگاه لومینومتر بسیار حساس و دقیق می‌باشد و در ثانی اندازه‫گیری فعالیت لوسیفراز را می‫توان توسط سلول‌های زنده باکتری E. coli بیان کننده لوسیفراز و بدون انجام لیز سلولی و با افزودن سوبسترای آن صورت داد، لذا لوسیفراز به‫عنوان یک پروتئین گزارش‫گر مناسب در باکتری معرفی می شود. علاوه بر این همان‫طور که اشاره شد بیان پروتئین Hsp70 در شرایط استرس دمایی به‫طور قابل توجهی افزایش می‌یابد لذا گرچه لوسیفراز یک پروتئین باکتریایی نیست اما به‫دلیل اینکه یک پروتئین مونومر حساس به دما است (طبق مطالعات قبلی صورت گرفته بر سینتیک غیرفعال سازی لوسیفراز تحت شرایط in vitro نیمه عمر آن در 42 درجه  سانتی‫گراد کمتر از 3 دقیقه است) به‫همین دلیل به‫عنوان سوبسترای مناسب حساس به دما انتخاب شد (19و 8). از آنجا که فعالیت لوسیفراز بسیار حساس به دما می‌باشد و با افزایش دما فعالیت خود را از دست می‌دهد بنابراین با هم انتقالی وکتورهای حاوی ژن‌های Hsp70 و لوسیفراز در سلول باکتری E. coli و بیان هم‫زمان هر دو پروتئین درسلول، انتظار می‌رود که تحت شرایط استرس‌‌های دمایی درصد فعالیت لوسیفراز در سلول‌های کوترنسفرم شده تفاوت قابل ملاحظه‌ای نسبت به لوسیفراز بدون چپرون در سلول‌های کنترل داشته باشد.

مواد و روش‫ها

در مطالعه قبل وکتورهای PET16b (مقاوم به آنتی بیوتیک آمپی سیلین) حاوی ژن لوسیفراز و PET28a (مقاوم به آنتی بیوتیک کانامایسین) حاوی ژن Hsp70 فراهم شد (20).

انتقال هم‫زمان وکتورهای نوترکیب به باکتری E. coli سویه‌ی بیانی BL21: بعد از آماده سازی سلول‌های مستعد، انتقال شیمیایی وکتورها به سلول‌ها انجام پذیرفت. به‫منظور غربال‌گری کلونی‌های حاصل از کوترنسفرماسیون (حاوی وکتورهای حامل ژن Hsp70 و لوسیفراز)، کلونی PCR و سنجش فعالیت لوسیفرازی صورت گرفت. در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز با استفاده از پرایمر اختصاصی Hsp70 و بر اساس شرایط بهینه‌ای که در تحقیقات قبلی طراحی و تعیین شده بود انجام گرفت. با این تفاوت که در کلونی PCR از کلونی‌های باکتری حاوی ژن مورد نظر به‫عنوان الگو در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز استفاده می‌شود و در صورتی‌که کلونی مزبور حاوی وکتور ناقل ژن باشد، نتیجه PCR مثبت خواهد بود. در واکنش کلونی PCR چون به جای DNA از کلونی‌های باکتری به‫عنوان الگو استفاده می‌شود، مدت زمان واسرشت سازی اولیه طولانی‌تر است (10 دقیقه). به‫منظور اندازه گیری فعالیت بیولومینسانسی آنزیم لوسیفراز در سلول ها 5 میکرولیتر از نمونه باکتری زنده حاوی لوسیفراز به 5 میکرولیتر از کوکتل 5X سوبسترای آن (شامل لوسیفرین5mM،4 mM ATP ،MgSO4  100 mM و تریس 50 mM) اضافه شد و با کمک دستگاه بیولومینومتر (Sirius L tube luminometer, Germany) خوانده شد. جهت سنجش فعالیت لوسیفرازی لازم است که در ابتدا بیان پروتئین در سلول باکتری صورت گیرد.

بررسی اثر مهاری تتراسایکلین بر بیان از نو پروتئین‌ها (De novosynthesis of proteins) در شرایط in vivo: جهت اطمینان از کارایی عملکرد چپرونی Hsp70، عدم سنتز مجدد لوسیفراز در سلول زنده باکتری پس از اعمال استرس ضروری می‌باشد. بنابراین می‌بایست سیستم بیان در باکتری را سرکوب نمود. بدین‫منظور از آنتی بیوتیک تتراسایکلین استفاده شد. پس از بیان نمونه باکتری کوترنسفرم شده (حاوی سازه‫های‫ ژنی pET28a:Hsp70‫ و pET16b:luciferase)، در محیط LB دارای 50 میکرولیتر بر میلی‫لیتر کانامایسین و 100 میکرولیتر بر میلی‫لیتر آمپی‌سیلین در دمای 30 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 ساعت، 10 میلی‫لیتر از نمونه‌های باکتری در لوله‌‌‌های آزمایش تقسیم شد و فعالیت لوسیفرازی آن‌ها در حضور و عدم حضور تتراسایکلین 25 میکرولیتر بر میلی‫لیتر در دمای42 درجه سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین شد. واکنش با افزودن نسبت‌های برابر سوبسترای آنزیم لوسیفراز (شامل کمپلکس لوسفرین و ATP) و نمونه باکتری صورت گرفت و تغییرات توسط دستگاه لومینومتر (Sirius L tube luminometer, Germany) اندازه‌گیری شد.

شوک حرارتی و سنجش فعالیت لوسیفراز: جهت سنجش استاندارد فعالیت لوسیفرازی در شرایط in vivo، باکتری E. coli کوترنسفرم شده حاوی وکتور نوترکیب pET28a:Hsp70 وpET16b:luciferase  پس از کشت شبانه در محیط  LBدارای 50 میکرولیتر بر میلی‫لیتر کانامایسین و 100 میکرولیتر بر میلی‫لیتر آمپی‌سیلین در دمای 30 درجه سانتی‫گراد به‫مدت 4 ساعت تحت القای بیان پروتئین‌ها قرار گرفت. سپس 10 میلی‫لیتر از نمونه باکتریایی برداشته شد و پس از افزودن تتراسایکلین 25 میکرولیتر بر میلی‫لیتر، 1 میلی‫لیتر از نمونه‌های باکتریایی برداشته شد و در میکروتیوب‌های 2/0 میلی‫لیتر در حجم 50 میکرولیتر الیکوت شدند. نمونه‌ها در گرادیان دمایی دستگاه ترموسایکلر PCR)) تحت استرس دمایی قرار گرفتند. پس از تیمار دمایی، در زمان‌های (0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه)، 5 میکرولیتر از الیکوت‫ها برداشته شد و فعالیت لوسیفرازی آن‌ها توسط دستگاه لومینومتر تعیین شد. درصد فعالیت لوسیفراز نمونه‌‌های تیمار حرارتی با توجه به‫میزان فعالیت اولیه‌ی لوسیفراز قبل از اعمال استرس حرارتی سنجیده شد و درصد فعالیت لوسیفراز قبل از تیمار حرارتی 100 درصد در نظر گرفته شد.

در این آزمایش نیز از نمونه باکتری حاوی سازه ژنی pET16b:luciferase به‫عنوان کنترل استفاده و فعالیت لوسیفرازی آن با نمونه کوترنسفرم شده مطابق روش فوق مقایسه شد.

نتایج

کوترنسفورماسیون و بیان هم‫زمان ژن Hsp70 و لوسیفراز

برای انجام کوترنسفرماسیون، از غلظت‌های برابر سازه‌های ژنی pET16b:Luciferase وHsp70  pET28a: جهت انتقال به سلول‌های مستعد BL21 استفاده شد. به‫منظور غربالگری کلونی‫های حاوی ژن Hsp70 از روش کلونی PCR  استفاده شد و نتیجه‌ی آن بر روی ژل آگارز مشاهده شد (شکل 1).

شکل 1: آنالیز محصولات کلونی PCR با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز به‫منظور غربال کلونی‌های BL21 کوترنسفرم حاوی وکتور نوترکیب Hsp70، کلونی‌های BL21 حاوی وکتور نوترکیب بیانیHsp70 5) محصول PCR مربوط به ژن Hsp70 به‫عنوان کنترل و M مارکر وزن مولکولی (#SM0322, Fermentas)

 به‫منظور تایید نتایج حاصل از کلونی PCR واکنش PCR با پرایمرهای اختصاصیHsp70 با وکتور استخراج شده Hsp70  به‫عنوان کنترل انجام گرفت. از‫آنجا‫‫که از پرایمرهای خود ژن استفاده شده است لذا طول حدود 2000 باز مشاهده می‌شودکه مطابقت با ژن Hsp70 دارد. شرایط بیان بهینه هم‫زمان دو پروتئین در سلول‫های E. coli سویه BL21 مورد بررسی قرار گرفت و با توجه به انجام برخی شرایط هم بیانی و مشاهده نتایج تکرار پذیر آن، در نهایت بیان نمونه کوترنسفرم در E. coli سویه BL21 توسط القاءگر IPTG mM 1 و با توجه به انتخاب دمای بهینه‌ی بیان در 30 درجه سانتی‫گراد و پس از گذشت 4 ساعت از زمان شروع القاء با هوادهی مطلوب انجام گرفت. در حالی‫که تحت این شرایط نمونه لوسیفرازی فاقد بیان آن ناموفق است. آنالیز بیان توسط SDS-PAGE 5/12 درصد انجام شد و باند پروتئینی مربوط به‫هریک از آن‫ها مشاهده شد. حضور باند پروتئینی در ناحیه 66 و 61 کیلودالتون به‫ترتیب مربوط به پروتئین‌های Hsp70 و لوسیفراز نسبت به نمونه کنترل حاکی از بیان پروتئین‌های Hsp70و لوسیفراز می‌باشد شکل (2).

شکل 2: آنالیز بیان ژن Hsp70 و لوسیفراز در سلول های E. coli سویه BL21 توسط القاگر IPTG mM 1 با استفاده از ژل SDS-PAGE  5/12 درصد. M. مارکر وزن مولکولی ( (#SM0431, Fermentas1) نمونه کنترل بدون وکتورهای بیانی، نمونه کنترل حاوی وکتور نوترکیب Hsp70، 3) نمونه کنترل حاوی وکتور نوترکیب لوسیفراز، 4) نمونه کوترنسفرم شده

بررسی اثر مهاری تتراسایکلین بر بیان از نو پروتئین‫ها (De novo synthesis of proteins) طی اعمال استرسحرارتی

پس از بیان4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القایIPTG mM 1 در دمای 30 درجه سانتی‫گراد، ml10 از نمونه‫های باکتری در لوله‫های آزمایش الیکوت شد و فعالیت لوسیفرازی آن‫ها در حضور و عدم حضور

تتراسایکلین 25 میکرولیتر برمیلی‫لیتر در دمای 42 درجه سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین شد. واکنش با افزودن نسبت‌های برابر سوبسترای آنزیم لوسیفراز (شامل کمپلکس لوسفرین وATP ) و نمونه باکتری صورت گرفت. همان‫طور که در شکل 3 مشاهده می‌شود اختلاف در میزان فعالیت لوسیفرازی دو نمونه وجود دارد، به‫طوری که در عدم حضور تتراسایکلین درصد بالاتری از فعالیت لوسیفرازی دیده می‌شود که این افزایش ناشی از بیان مجدد پروتئین در عدم حضور تتراسایکلین باشد.

شکل 3: اثر تتراسایکلین بر مهار بیان مجدد پروتئین در حین اعمال استرس در نمونه کوترنسفرم حاوی ژن Hsp70 در مقایسه با نمونه کنترل. پس از بیان4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القای IPTG mM 1 در دمای30 درجه  سانتی‫گراد، فعالیت لوسیفرازی نمونه‌ها در حضور و عدم حضور تتراسایکلین μg/ml 25 در دمای 42 درجه  سانتی‫گراد در طی یک ساعت تعیین گردید. در عدم حضور تتراسایکلین درصد بالاتری از فعالیت لوسیفرازی دیده می‌شود که این افزایش ناشی از بیان مجدد پروتئین در عدم حضور تتراسایکلین باشد.

شوکحرارتیوسنجشفعالیتلوسیفراز

پس از بیان 4 ساعته نمونه کوترنسفرم تحت القای IPTG  1 میلی‫مولار در دمای 30 درجه  سانتی‫گراد، 10 میلی‫لیتر از نمونه باکتریایی برداشته شد و پس از افزودن تتراسایکلین 25 میکروگرم بر میلی‫لیتر، در دماهای 40، 42، 44، 46، 48 و 50 درجه سانتی‫گراد در طی زمان یک ساعت انکوبه شدند. فعالیت لوسیفرازی آنها در شرایط in vivo و بدون لیز سلولی در زمان‌های 0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه توسط دستگاه لومینومتر اندازه‫گیری شد. فعالیت لوسیفراز نمونه‌های کوترنسفرم شده در دماها و زمان‌های تعیین شده نسبت به نمونه‌ی فاقد چپرون Hsp70 مقایسه گردید و درصد فعالیت لوسیفراز نمونه‌‌ها با توجه به میزان فعالیت اولیه‌ی لوسیفراز قبل از اعمال استرس حرارتی سنجیده شد. شکل 4 نشان می‌دهد در دماهای 40، 42 و 44 درجه  سانتی‫گراد در زمان 15 دقیقه اختلاف ملاحظه‌ای در میزان فعالیت آنزیم در دو نمونه وجود دارد به‫طوری‫که در دمای 44 درجه  سانتی‫گراد بعد از 15 دقیقه درصد فعالیت لوسیفراز در نمونه کنترل به صفر می‌رسد این در حالی است که در نمونه کوترنسفرم 44 درصد فعالیت حفظ می‌‫شود. از طرفی در دماهای 40 و 42 درجه  سانتی‫گراد در مدت

زمان 30 دقیقه نیز تفاوت قابل ملاحظه‌ای در فعالیت لوسیفرازی همچنان مشاهده می‌شود به‫طوری که با گذشت زمان 30 دقیقه، در دمای 40 و 42  سانتی‫گراد به‫ترتیب حدود 72  درصد و 60  درصد فعالیت لوسیفرازی در نمونه کوترنسفرم حفظ می‫شود، درصورتی‫که در نمونه فاقد چپرون این میزان به صفر می‌رسد. علاوه بر این شکل 4 نشان می‌دهد در نمونه کوترنسفرم، تحت استرس دماهای 40 و42 درجه  سانتی‫گراد با گذشت 45 دقیقه پس از اعمال استرس به‫ترتیب تا حدود 50 و 38 درصد فعالیت اولیه لوسیفرازی حفظ می‌شود و حتی پس از60 دقیقه نیز تا 36  درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی می‌ماند. در استرس دمای 46 درجه سانتی‫گراد با گذشت تنها 5 دقیقه پس از اعمال استرس، فعالیت لوسیفرازی نمونه فاقد Hsp70 تنها حدود 12  درصد فعالیت آن حفظ می‌‌‫شود، در صورتی‌که این تغییرات برای نمونه کوترنسفرم در حدود 60 درصد فعالیت اولیه می‫باشد. از طرفی در دماهای 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد در نمونه فاقدچپرون با گذشت 5 دقیقه اولیه پس از اعمال استرس، فعالیت لوسیفرازی نمونه به‫طور کامل از بین می‌رود اما در نمونه‌‌های کوترنسفرم در زمان 5 دقیقه به‫ترتیب 12 و 4 درصد فعالیت لوسیفراز حفظ می‌شود.

شکل 4: نمودارهای تغییرات فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم حاوی ژن Hsp70 در دماهای (A) 40 و (B) 42،(C) 44، (D) 46، (E) 48 و (F) 50 درجه  سانتی‫گراد در زمان‌های 0، 5، 10، 15، 30، 45 و 60 دقیقه. پس از بیان4 ساعته نمونه‌های کوترنسفرم تحت القای IPTG mM 1 در دمای30 درجه  سانتی‫گراد و افزودن تتراسایکلین  25 میکروگرم بر میلی‫لیتر، نمونه‌ها در دماهای تعیین شده به‫مدت یک ساعت انکوبه شدند و فعالیت لوسیفرازی نمونه‌ها تنسبت به نمونه‌های قبل از تیمار حرارتی اندازه‌گیری شد. در دماهای 40، 42 درجه  سانتی‫گراد با گذشت زمان 30 دقیقه، فعالیت لوسیفرازی در نمونه فاقد چپرون تقریبا به صفر می‌رسد در صورتی‌که در نمونه کوترنسفرم به ترتیب حدود 72  درصد و 60  درصد فعالیت لوسیفرازی حفظ می‌شود و حتی پس از60 دقیقه نیز تا 36  درصد و 22 درصد فعالیت همچنان باقی می‌ماند. همچنین در استرس دماهای 44 و46 درجه  سانتی‫گراد، در زمان‌های اولیه پس از اعمال استرس اختلاف قابل ملاحظه‌ای بین فعالیت لوسیفرازی نمونه‌های کوترنسفرم و کنترل مشاهده می‌شود، در صورتی‌که در دماهای 48 و 50 درجه  سانتی‫گراد تغییرات فعالیت لوسیفرازی نمونه کوترنسفرم نسبت به کنترل حتی در زمان‌های اولیه استرس ناچیز بود.