Document Type : Research - Scientific
Authors
1 1. Department of Biochemistry-Biophysics, Faculty of Advance Science and Technology, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran
2 Department of Developmental Biology, Faculty of Advance Science and Technology, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran
3 Department of Medical Biotechnology, Faculty of Advance Science and Technology, Tehran Medical Sciences, Islamic Azad University, Tehran, Iran
Abstract
Aim: This study was performed to evaluate the cytotoxic effects of hydroalcoholic extract of Artemisia sieberi and its effect on the cell cycle in the SKBr3 breast cancer cell line.
Material and Methods: In this study, hydroalcoholic extract of Artemisia was prepared. SKBr3 cells were exposed to different concentrations (1, 10, 100, 1000 µgml-1) of extract at two different time intervals of 24 and 48 h. We employed MTT assay and flow cytometry analysis to evaluate effects of the prepared extract on the cell cycle characteristics and its cytotoxic properties.
Results: Based on the data obtained from the MTT test, the highest toxicity of the extract observed at the concentration of 1000 µgml-1 within 48 h after the extract exposure. The IC50 of hydroalcoholic extract was 150 and 50 µgml-1 at 24 and 48 h, respectively. According to the data obtained from flow cytometry analysis, the extract arrests cell cycle in 24 and 48 h treatment groups.
Conclusion: The hydroalcoholic extract of Artemisia at certain concentrations inhibits the growth of SKBr3 breast cancer cells by ceasing cell cycle step.
Highlights
-
Keywords
مقدمه
سرطان یکی از شایعترین دلایل مرگ و میر در جهان است (2،1) که از این میان سرطان پستان در خانمها بسیار رایج میباشد و سلامت آنها را بهخطر میاندازد (3). در سال 2018، 627 هزار مرگ ناشی از ابتلا به این بیماری گزارش شده است (4). سرطان پستان یک بیماری چند عاملی است (5) و عمده دلایل در ایجاد این بیماری عبارتند از جنسیت (6)، سن، فاکتورهای تولید مثلی (7)، فاکتورهای هورمونی (8)، فاکتورهای ژنتیکی (9)، سن یائسگی (10،11)، سقط (12)، تاریخچه خانوادگی (7)، تراکم بافت پستان (13) و سبک زندگی (15،14،7). میزان شیوع و مرگومیر حاصل از این بیماری در بخشهای مختلف جهان بهدلیل فاکتورهای ژنتیکی و محیطی متنوع و سبک زندگی متفاوت میباشد (16). از بزرگترین محدودیتهای داروهای ضدسرطان، مقاومت سلولهای سرطانی نسبت به داروها است (17). مناسبترین روش درمانی توسط پزشک و بیمار و با توجه به مرحله و خصوصیات زیستی سرطان، سن بیمار، خطرات و فواید هر روش درمانی انتخاب میشود. برخی از روشهای درمان سرطان شامل: جراحی، پرتودرمانی، شیمی درمانی، هورمون درمانی و گیاه درمانی میباشندکه گیاهان بهعلت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهای شیمیایی بیشتر مورد توجه قرار گرفتهاند (18). از گیاهان دارویی میتوان به گیاه درمنه یا آرتمیزیا (A. sieberi) اشاره کرد که بالغ بر 400 گونه از این جنس در جهان و 34 گونه در ایران گزارش شده است. گیاه درمنه متعلق به تیره کاسنیان (Asteraceae) میباشد. این گیاه بوتهای و معطر بوده و رنگ آن سبز متمایل به خاکستری است، بسیار پر شاخه و طعم آن تلخ میباشد (19). ترکیبات موثر آن آلفاتیوجون (alphathujone)، کامفور (camphor)، بتاتیوجون (betathujone)، 1 و 8 سینئول (1,8-cineole) میباشد (20). گیاه آرتمیزیا در درمان بیماریهای مختلف انگلی، باکتریایی، قارچی، التهابی و توموری نقش دارد و قادر به القای آپوپتوزیس و فعالیت ضدتکثیری و آنتیاکسیدانتی نیز میباشد (23،22،21).
گیاه آرتمیزیا قبلا بر روی سایر ردههای سلولی سرطان پستان و سایر انواع سرطانها از قبیل کولون، رحم، معده ، کبد و خون کار شده است و موثر واقع گردید. تحقیقات نشان داد که عصاره متانولیA. sieberi موجب القای مرگ سلولی در رده سلولیMCF7 میشود (24). یکی از ترکیبات موثر گیاه آرتمیزیا، سسکوئیترپن لاکتونی بهنام آرتمیزینین میباشد که در درمان مالاریا موثر است و از دهه 1990 ویژگیهای ضدسرطانی آن نیز گزارش شده است (25،26). این ترکیب در حضور آهن فرو یا هم احیا شده به رادیکال سیتوتوکسیکی تبدیل میشود که در سلولهای سرطانی استرس اکسیداتیو را القا میکند. همچنین گزارش شده است که این ترکیب آپوپتوزیس و فروپتوزیس را القا میکند و متاستاز سرطانی را مهار میکند (27) .A.sieberi گونهای بومی ایران میباشد که تحقیقات اندکی روی اثرات ضدسرطانی آن انجام شده است. با توجه به آنکه جنسهای مختلف آرتمیزیا حاوی ترکیبات تا حدودی متفاوت هستند و ازطرفدیگر احتمالا میزان ترکیبات آهندار در بافتهای سرطانی مختلف نیز متغیر میباشد، بنابراین در مطالعه حاضر برای نخستین بار اثرات ضد سرطانی عصاره هیدروالکلی A. sieberi بر رده سلولی سرطان پستان SKBr3 با تمرکز بر سمیت سلولی و ارزیابی چرخه سلولی مورد بررسی قرار گرفت.
مواد و روشها
آماده سازی عصاره:گیاه A. sieberi از منطقه قم جمعآوری شد و توسط مرکز هرباریوم دانشگاه تهران شناسایی شد. سپس در مجاورت هوا خشک و آسیاب شد. بهمنظور عصارهگیری مقدار 82 گرم از نمونه بهمدت 24 ساعت در اتانول 96 درصد (زکریا، ایران) قرار گرفت. سپس عصاره صاف شد و بهمدت یک هفته در دمای اتاق قرار گرفت تا حلال آن تبخیر شد. باقیمانده برای انجام آزمایشات در یخچال با درجه حرارت 4 درجه سانتیگراد نگهداری شد.
تهیه رقتهای مختلف از عصاره گیاه:200 میلیگرم عصاره گیاه در 4 میلیلیتر بافر PBS (Merck، آلمان) حل شد و سپس از فیلتر سرسرنگی 2/0 میکرون ( Getبایوفیل) عبور و مایع کاملا صاف و استریل شد. رقتهای بعدی مورد نظر توسط محیط کشت DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) تهیه شد.
کشت سلول:رده سلولی SKBr3 مربوط به سرطان پستان با منشا انسانی از بانک سلولی انستیتوپاستور ایران خریداری شد و در محیط کشت DMEM (Gibco، آمریکا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco، آمریکا) و 1 درصد آنتی بیوتیک (پنیسیلین/استرپتومایسین) (Gibco، آمریکا) کشت داده شده و در فلاسک 25 سانتیمتر مکعب در انکوباتور (Memert، آلمان) با دمای 37 درجه سانتیگراد و فشار 5 درصد CO2 و 95 درصد نگهداری شدند. تمام مراحل فوق در زیر هود لامینار (ژال تجهیز، ایران) و در محیطی کاملا استریل انجام گرفت.
سنجش سمیت سلولی:MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromidethiazole) یک نمک تترازولیوم محلول در آب است که براساس فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلولهای زنده عمل میکند (28). پس از پر شدن حدود 70 درصد کف فلاسک، با 1000 میکرولیتر بافر PBS (Phosphate Buffer Serum) (Merck، آلمان) شستشو شده و تخلیه شد. سپس 1000 میکرولیتر تریپسین (Gibco، آمریکا) اضافه کرده و بهمدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه شد و بهمنظور کند شدن عملکرد آنزیم تریپسین 2000 میکرولیتر محیط کشت DMEM به سلولها اضافه شد. سپس سلولها به داخل لوله آزمایش در پیچدارمنتقل شدند. بعد از شمارش سلولهای موجود در فالکون، بههر چاهک از پلیت 96 خانه (SPL، کره) 103×8 سلول منتقل شد و با دوزهای مختلف عصاره تیمار شد. بعد از گذشت 24 و 48 ساعت ابتدا سلولها با استفاده از بافر PBS شست و شو داده شدند. سپس محلول MTT (Merck، آلمان) (5 میلیگرم بر میلیلیتر در PBS) به چاهکهای پلیت 96 خانهای اضافه شد و بهمدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از طی زمان انکوباسیون، محلول رویی در چاهکها خالی شد و 100 میکرولیتر محلول DMSO (Merck، آلمان) بههر کدام از چاهکهای پلیت 96 خانهای اضافه شد و سپس توسط الایزا ریدر (Biotec، آمریکا) جذب نوری نمونهها در طول موج 570 نانومتر اندازهگیری شد و سپس دادهها در نرم افزار Graph Pad Prism وارد شدند و میزان IC50 مربوط بههر زمان محاسبه شد.
ساخت غلظت IC50 (24 و 48 ساعت) از محلول آماده شده اولیه: طبق دادههای آنالیزی نرم افزار Graph Pad Prism، IC50 در زمانهای 24 و 48 ساعت بهترتیب برابر با 150 میلیگرم بر میلیلیتر و 50 میلیگرم بر میلیلیتر محاسبه شد. طبق اعداد بهدست آمده غلظتی از عصاره که دارای میزان جذب بهاندازه نصف جذب مشاهده شده در کنترل منفی میباشد را بهعنوان IC50 در نظر گرفته میشود و بیانگر غلظتی از عصاره میباشد که باعث مرگ سلولی در 50 درصد از جمعیت سلولی تیمار شده، می شود. با توجه به رابطهی M1*V1=M2*V2 حجم مناسب از محیط کشت DMEM و محلول آماده شده اولیه برای افزودن به چاهکهای پلیت های 6 خانه 24 و 48 ساعت برای تست چرخه سلولی برآورده شد.
سنجش چرخه سلولی: در ابتدا محیط کشت درون فلاسک حاوی رده سلولی SKBr3 توسط 1000 میکرولیتر بافر PBS شست و شو شد و تخلیه شد. بهمنظور کنده شدن سلولها از کف فلاسک 1000 میکرولیتر تریپسین به آن اضافه شد و بهمدت 5 دقیقه انکوبه شد. در مرحله بعد محتوی فلاسک به یک لوله آزمایش در پیچدار منتقل و به آن در حدود 2000 میکرولیتر محیط کشت DMEM افزوده شد. بعد از شمارش سلولها، حجم سلولی مورد نظر 3 میلیلیتر محاسبه شد و بههر چاهک از پلیت 6 خانهای (SPL، کره )، 105×1سلول منتقل شد. از لوله آزمایش در پیچدار (حاوی 3 میلیلیتر سلول و 17میلیلیتر محیط کشت DMEM ) بههر چاهک از پلیت 6 خانهای، 1000 میکرولیتر اضافه شد و انکوبه شد. بعد از پایان مدت زمان 24 و 48 ساعت با توجه به IC50 هر زمان، لوله آزمایش در پیچدار مخصوص به آنها تهیه شد و سپس محیط رویی چاهکها، تخلیه شد و از آن لولههای آزمایش در پیچدار 2 میلیلیتر به چاهکهای مرتبط افزوده و انکوبه شد. در ادامه، هر چاهک از پلیت به لوله آزمایش در پیچدار همنام با خود منتقل شد و هر چاهک با 1000 میکرولیتر بافر PBS مورد شست و شو قرار گرفت، سپس 500 میکرولیتر تریپسین به آن اضافه و به لولههای آزمایش در پیچدار منتقل شدند. سپس بهمدت 5 دقیقه با 1200 دور در دقیقه سانتریفیوژ (ژال تجهیز، ایران) شدند و به رسوب آنها، 900 میکرولیتر اتانول 70 درصد (زکریا، ایران) و 100 میکرولیتر بافر PBS اضافه شد. در آخر برای خوانش آن توسط دستگاه فلوسایتومتری FACS Calibur) BD، انگلیس) بههرکدام از لولههای آزمایش در پیچدار کوکتل نهایی (20 میکرولیتر PI (Sigma، آمریکا) و 20 میکرولیتر RNase A (سیناژن، ایران) و 1 میکرولیتر ترایتون X 100 (Sigma، آمریکا) که همگی در بافر PBS حل شده و به حجم 1 میلیلیتر رسیده) اضافه شد.
آنالیز آماری
نتایج بهدست آمده در این مطالعه براساس حداقل سه بار تکرار استوار است که با گرفتن میانگین و محاسبه انحراف معیار، میزان تغییرات محاسبه شد. با استفاده از نرم افزار Graph pad prism 5 (Graph Pad Software, Inc., LA Jolla, CA, USA)، مقدار IC50 نمونهها (غلظتی از عصاره است که منجر به مهار رشد 50 درصدی سلولهای سرطانی میشود) محاسبه شد. برای تجزیه و تحلیل اثر غلظتهای مختلف عصاره بر رده سلولی سرطانی از آزمون آماری آنالیز واریانس دو طرفه (Two-way ANOVA) برای مقایسه گروهها با کنترل استفاده شد. همچنین (05/0>p) معنیدار در نظر گرفته شد.
نتایج
بررسی سمیت سلولی عصاره هیدرو الکلی گیاه درمنه بر روی رده سلولی SKBr3 با استفاده از تست MTT انجام شد. همانطورکه نتایج تحلیل آماری در شکل 1 نشان داده است. عصاره مورد نظر در غلظت 10 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت در سطح 05/0>p و در غلظتهای 100 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت در سطح معنیداری 001/0>p و در غلظت های 1، 10، 100، 1000 میکروگرم بر میلی لیتر در 48 ساعت در سطح 001/0>p موجب کاهش معنیدار بقای سلولهای سرطانی در مقایسه با گروه کنترل شد. این نتایج نشان داد که اثر کشندگی سلولی عصاره وابسته بهدوز و زمان است.
همچنین مقادیر IC50 عصاره پس از 24 و 48 ساعت بهترتیب 150 و50 میکروگرم بر میلیلیتر محاسبه شد. نتایج حاصل از تاثیرگذاری این عصاره بر فازهای مختلف چرخه سلولی سلولهای SKBr3 توسط دستگاه فلوسایتومتری در زمانهای 24 و 48 ساعت در شکل 2 آورده شده و در شکل 3 آنالیز شده است.
شکل 1: میزان درصد بقای سلولها با استفاده از روش MTT پس از 24 و 48 ساعت تیمار با عصاره هیدروالکلی گیاه آرتمیزیا سیبری. نمودار نشان میدهد که درصد بازدارندگی این عصاره روی سلولهای سرطان پستان SKBr3 وابسته به دوز و زمان میباشد. مقایسه سلولها با هم با آزمون آماری p< 0.001*** و p< 0.05 *.
شکل 2: نتیجه مبتنی بر میزان فلوئورسنت و درصد سلولها در چرخه سلولی در سه گروه کنترل، 24 و 48 ساعت (بهترتیب از چپ به راست)
شکل 3: مقایسه شدت تغییرات سه فاز چرخه سلولی در دو گروه تیمار و یک گروه کنترل تحت تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه آرتمیزیا سیبری (P value0.05 (ns) ، P value
بحث
سرطان مشکلی روبهرشد در سراسر جهان میباشد و یکی از مهمترین دلایل مرگومیر در جوامع انسانی است (29). بیشتر گیاهانی که در طبیعت وجود دارند دارای خاصیت دارویی هستند. عوامل دارویی در گیاهان با خاصیت آنتی اکسیدانتی میتوانند بهعنوان یک عامل ضدسرطانی عمل کنند (30). امروزه فرآوردههای گیاهی نسبت به سایر روشهای درمانی نظیر شیمی درمانی، پرتودرمانی و هورمون درمانی بهعلت در دسترس و ارزان بودن و داشتن عوارض جانبی کمتر بیشتر مورد توجه قرار گرفتهاند (31).
در مطالعه حاضر اثرات ضدسرطانی گیاه A. Sieberi مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از تست MTTنشان داد که غلظتهای مختلف عصاره هیدروالکلی گیاه درمنه در مقایسه با گروه شاهد تفاوت معنیداری بر روی سمیت سلولی رده سلولی SKBr3 دارد. بیشترین اثر مهاری این عصاره در غلظت 1000 میکروگرم بر میلیلیتر در 48 ساعت بوده است. ازطرف دیگر حداکثر تاثیر آن بر چرخه سلولی بر تمامی فازها (G1 و S و G2) در 48 ساعت بوده است. مطالعات گذشته نشان داده است که عصاره گیاه A. capillaris Thunbergدر غلظت 200- 25 میکروگرم بر میلیلیتر مانع تکثیر سلولهای هپاتومای انسانی SMMC-7721 در طی 72 ساعت و القای توقف چرخه سلولی در فاز G0/G1 میشود (32). نتایج تحقیق دیگری نشان داد که عصاره متانولی گیاه A. absinthium در غلظت 25 و 20 میکروگرم بر میلی لیتر بهترتیب باعث مهار رشد 50 درصدی سلولهای MCF-7 و MDA-MB-231 شده و اوج القای آپوپتوزیس این گیاه در فاز قبل از G1 در مدت زمان 72 ساعت بوده است (33). کیم و همکارانش نشان دادند که عصاره برگ گیاه A.princeps قابلیت مهار ردههای سلولی آندومتریوتیک انسانی (11Z و 12Z) در فازG1 چرخه سلولی دارد. علاوهبراین، عصاره گیاه موجب فعالسازی کاسپازهای 3، 8 و 9 شده است (34). در تحقیق حاضر نیز عصاره هیدروالکلی A. sieberi منجر به القای آپوپتوزیس و توقف چرخه سلولی شده است.
نتایج این بررسی نشان داد که خاصیت ضدسرطانی عصاره هیدروالکلی درمنه وابسته به دوز بوده است. در تحقیق دیگری نشان داده شد که اثر مهاری عصاره آبی A. princeps بر رده سلولی سرطان پستان MCF-7 وابسته به دوز بوده و منجر به مهار رشد این نوع از سلولهای سرطانی شده است (35). گزارش شده است که اثر مهاری عصاره اتیل استاتی گیاهA.capillaris Thunberg بر سلولهای سرطانی هپاتوسلولار (HCC) وابسته به دوز بوده است و علاوه بر القای آپوپتوزیس، قابلیت مهار رشد سلولها و مهاجرت آنها به نواحی دیگر را نیز دارا میباشد (36). میرکین و همکاران (37) نشان دادند که گیاه A.absinthum میتواند آپوپتوز را در سلولهای لوسمی لنفوسیتیک مزمن القا کند. عصاره متانولی گیاه A.annua با غلظتهای مختلف سبب مهار رشد سلولهای سرطانی لوسمی لنفوبلاستیک حاد ردههای Reh و Nalm-6 میشود (38).
نشان داده شده است که عصاره متانولی A. annua سبب کاهش رشد تمام ردههای سلولی سرطانی معده
(AGS)، سرویکس (Hela)، کولون (HT-29) و پستان (MCF-7) با غلظتهای مختلف بهمدت 72 ساعت شده است (39). محققان نشان دادند که عصارههای مختلف A. turanica و A. biennis در مدت زمان 48 ساعت بیشترین اثر ضدتکثیری بر ردههای سلولی سرطان خون ( HL-60 و K562) را داشته است (41،40). تحقیقات گردانیان و همکاران (24) نشان داد که عصاره متانولی A. sieberi موجب القای مرگ سلولی در رده سلولیMCF7 میشود . همچنین نشان داده شده است که مهمترین مواد موثره گیاه آرتمیزیا لیمونن، اوژنول، آلفا پینن، توژون، بورنئول، پیپریتون، کامفور و مقادیر زیادی آرتمیزین است. همچنین این ترکیبات موجب القای آپوپتوزیس، مهار رشد سلولهای توموری و توقف چرخه سلولی در مرحله G2/M میشوند (42) . آرتمیزینین در حضور آهن فرو یا هم احیا شده به رادیکال سیتوتوکسیکی تبدیل میشود که در سلولهای سرطانی استرس اکسیداتیو را القا میکند. همچنین گزارش شده است که این ترکیب آپوپتوزیس و فروپتوز را القا میکند و متاستاز سرطانی را مهار میکند (27). نتایج این تحقیق از آن جهت با مطالعه ما همسو است که در مدت زمان 48 ساعت بیشترین اثر ضدتکثیری بر روی سلولهای سرطانی مشاهده شده است. نتایج این تحقیقات خاصیت القای آپوپتوزی حاصل از مطالعه حاضر بر روی رده سلولیSKBr3 را تایید میکند.
نتیجهگیری
در این مطالعه مشخص گردید بیشترین اثر مهاری عصاره هیدروالکلی گیاه A. sieberi در غلظت 1000 میلیگرم بر میلیلیتر در 48 ساعت بر روی سلولهای سرطانی SKBr3 بوده است. از طرفی عصاره مذکور بر سلولهای سرطانی فوق در فازهای (G1 و G2) و (G1 و S و G2) از چرخه سلولی بهترتیب در طی 24 و 48 ساعت اثر داشته است. با توجه به نتایج بهدست آمده، عصاره هیدروالکلی گیاه درمنه بهعنوان یک داروی موثر در درمان انواع سرطانها از جمله سرطان پستان میتواند مورد استفاده قرار گیرد. البته شناخت مکانیسمهای موثر اثر عصاره در القای اثرات آپوپتوتیک بر روی این رده سلولی نیازمند تحقیقات بیشتری است.
تشکر و قدردانی
این مقاله حاضر بخشی از پایان نامه دوره کارشناسی ارشد بیوشیمی مصوب دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران میباشد.