مقدمه

ناباروری یکی از مشکلات مهم سلامت باروری در جهان محسوب می‌شود و عوامل مردانه در حدود 40 تا 50 درصد موارد ناباروری نقش دارند. در سال‌های اخیر علاوه بر پارامترهای متداول مایع منی شامل تعداد، تحرک و مورفولوژی اسپرم، توجه ویژه‌ای به سلامت ژنتیکی اسپرم و یکپارچگی DNA آن شده است. مطالعات نشان داده‌اند که آسیب DNA اسپرم می‌تواند بر فرآیند لقاح، رشد جنین و موفقیت روش‌های کمک‌باروری تاثیرگذار باشد (1،2).

در طی فرآیند اسپرماتوژنز، تراکم مناسب کروماتین و جایگزینی هیستون‌ها با پروتامین‌ها نقش مهمی در حفظ پایداری DNA اسپرم دارند. هرگونه اختلال در این فرآیند، افزایش استرس اکسیداتیو، آپوپتوز ناقص سلول‌های زایا، عفونت‌ها، واریکوسل، افزایش سن و برخی عوامل محیطی می‌تواند منجر به افزایش شکست یا قطعه‌قطعه شدن DNA اسپرم شود. افزایش گونه‌ اکسیژن واکنش‫گر (ROS) یکی از مهم‌ترین عوامل ایجاد آسیب DNA اسپرم شناخته می‌شود که می‌تواند کیفیت اسپرم و توان باروری مردان را تحت تاثیر قرار دهد (1،3).

اگرچه آنالیز متداول مایع منی همچنان یکی از روش‌های اصلی ارزیابی باروری مردان است، اما این آزمایش‌ها به تنهایی قادر به پیش‌بینی دقیق نتایج درمان‌های کمک‌باروری نیستند. مطالعات متعددی نشان داده‌اند که میزان آسیب DNA اسپرم در مردان نابارور به‫طور معنی‌داری بیشتر از مردان بارور است و این شاخص می‌تواند به‫عنوان یک عامل مستقل در پیش‌بینی نتایج لقاح و کیفیت جنین مورد استفاده قرار گیرد. علاوه بر این، مطالعات متعدد نشان داده‌اند که افزایش آسیب DNA اسپرم با کاهش قدرت باروری مردان، کاهش احتمال بارداری طبیعی و اختلال در نتایج برخی روش‌های کمک‌باروری همراه است. هرچند نتایج مطالعات در مورد ارتباط مستقیم شکست DNA اسپرم با کیفیت جنین یکسان نبوده است، شواهد موجود نشان می‌دهد که این شاخص می‌تواند بر رشد جنینی و پیامدهای درمانی به‌ویژه در سیکل‌های ICSI تاثیرگذار باشد (2،4،5).

تزریق اسپرم به داخل سیتوپلاسم تخمک (ICSI) یکی از پرکاربردترین روش‌های کمک‌باروری در درمان ناباروری مردان است. با وجود موفقیت بالای این روش، شواهد نشان می‌دهد که کیفیت ژنتیکی اسپرم همچنان می‌تواند بر میزان لقاح، کیفیت جنین و پیامدهای درمانی تاثیرگذار باشد. از این رو، ارزیابی سلامت DNA اسپرم در کنار پارامترهای معمول مایع منی می‌تواند اطلاعات ارزشمندی در انتخاب راهبردهای درمانی مناسب ارائه دهد (4).

با توجه به اهمیت آسیب DNA اسپرم در موفقیت درمان‌های کمک‌باروری و محدود بودن مطالعات انجام‌شده در این زمینه، پژوهش حاضر با هدف تعیین میزان شکست DNA اسپرم در مردان مبتلا به الیگواستنواسپرمی مراجعه‌کننده به مرکز درمان ناباروری رویش کرج و بررسی ارتباط آن با کیفیت جنین‌های حاصل از روش ICSI در همسران دارای ذخیره تخمدانی طبیعی انجام شد.

2- مواد و روش­ها

پژوهش حاضر از نوع تجربی بود. در این مطالعه، نمونه‌های مایع منی ۶۰ زوج نابارور مراجعه‌کننده به مرکز درمان ناباروری رویش کرج برای انجام ICSI جمع‌آوری شد که ۳۰ نمونه به‌عنوان گروه کنترل و ۳۰ نمونه مربوط به مردان مبتلا به الیگوآستنواسپرمی بودند. نمونه‌های مایع منی پس از ۳ تا ۴ روز پرهیز از انزال، در روز تخمک‌گیری جمع‌آوری شدند. بخشی از هر نمونه برای ارزیابی پارامترهای اسپرمی شامل تعداد، تحرک و مورفولوژی بر اساس دستورالعمل سازمان جهانی بهداشت (WHO) با استفاده از میکروسکوپ نوری بررسی شد و بخش دیگر برای انجام ICSI آماده شد.

زنان کاندید ICSI با سطح سرمی هورمون آنتی‌مولرین (AMH) برابر یا بیشتر از ۲ وارد مطالعه شدند. پس از شست‌وشو و آماده‌سازی اسپرم به روش استاندارد، اسپرم‌های با مورفولوژی مناسب برای تزریق داخل سیتوپلاسمی انتخاب شدند. اووسیت‌ها پس از بازیابی، دنود شده و با استفاده از روش استاندارد ICSI تلقیح شدند. جنین‌های حاصل در محیط کشت مناسب نگه‫داری شدند و در روز سوم، تعداد و کیفیت آن‌ها ارزیابی گردید.

در ادامه، میزان قطعه‌قطعه شدن DNA اسپرم با استفاده از آزمون پراکندگی کروماتین اسپرم (Sperm Chromatin Dispersion; SCD)  و به کمک کیت ارزیابی شکست DNA اسپرم یا SDFA خریداری شده از شرکت ایده ورزان فردا (ایران) ارزیابی شد. در این روش، پس از دناتوره شدن DNA و حذف پروتئین‌های کروماتین، اسپرم‌های دارای DNA سالم هاله‌های بزرگ‌تری در اطراف سر اسپرم ایجاد کردند، در حالی که اسپرم‌های دارای DNA آسیب‌دیده فاقد هاله یا دارای هاله‌های کوچک بودند.

ارزیابی میزان قطعه‌قطعه شدن DNA اسپرم بلافاصله پس از دریافت نمونه‌ها انجام شد. داده‌های جمع‌آوری‌شده با استفاده از نرم‌افزار SPSS و آزمون‌های آماری مناسب تجزیه و تحلیل شدند.

3- آنالیز آماری

به‌منظور تجزیه و تحلیل داده‌ها، از نرم‌افزار SPSS استفاده شد. برای توصیف داده‌ها از شاخص‌های آمار توصیفی شامل میانگین، میانه، واریانس، انحراف معیار، فراوانی و درصد فراوانی استفاده گردید. داده‌های کمی به‌صورت میانگین ± انحراف معیار گزارش شدند. به‌منظور بررسی ارتباط بین میزان قطعه‌قطعه شدن DNA اسپرم و تعداد و سرعت اسپرم‌ها، از ضریب همبستگی رتبه‌ای اسپیرمن استفاده شد. همچنین، برای بررسی همگنی واریانس‌ها بین گروه‌ها از آزمون لوین استفاده گردید. در مواردی که فرض برابری واریانس‌ها برقرار نبود، برای مقایسه میانگین دو گروه از آزمون t استیودنت برای واریانس‌های نابرابر (آزمون Welch) استفاده شد. همچنین، به‌منظور بررسی تفاوت کیفیت جنین در گروه‌های مختلف بر اساس میزان قطعه‌قطعه شدن DNA اسپرم، از آزمون آماری مناسب برای مقایسه گروه‌ها استفاده شد. کلیه آزمون‌های آماری به‌صورت دوطرفه انجام شدند و مقدار P کم‫تر از 05/0 از نظر آماری معنی‌دار در نظر گرفته شد.

4- نتایج

در ابتدا، ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم انجام شد، همان طوری که در شکل 1 مشاهده می­شود، اسپرم‌های دارای DNA سالم هاله‌های بزرگ‌تری در اطراف سر اسپرم ایجاد کردند، در حالی که اسپرم‌های دارای DNA آسیب‌دیده فاقد هاله یا دارای هاله‌های کوچک بودند.

شکل 1: از سمت راست به چپ به ترتیب مربوط به، تفاوت DNA سالم و شکسته، نمونه با DFI متوسط، نمونه باDFI  بالا، نمونه  با DFI کم است.

با توجه به این‫که دو نمونه همتای 30 نفره بصورت گروه کنترل مثبت و گروه آزمایش در نظر گرفته شد؛ میزان درصد شکست اسپرم در دو گروه نشان داد که 93.3 درصد گروه آزمایش دچار شکست اسپرم به میزان 31 درصد به بالا شدند و 6.7 درصد از زوج های گروه آزمایش به میزان متوسط بین 16 تا 30 درصد دچار شکست در اسپرم شدند و این درحالی رخ داده است که گروه اسپرم نرمال همگی در وضعیت خوب (کم‫تر از 15 درصد شکست اسپرم) قرار داشتند. همچنین، 7/96 درصد از افراد گروه آزمایش دارای مورفولوژی غیرطبیعی اسپرم بودند، در حالی‫که گروه کنترل از نظر مورفولوژی و سلامت ژنتیکی اسپرم وضعیت مطلوبی داشت.

همان‫طور که در شکل 2 مشاهده می­شود، بررسی میانگین‌ها نشان داد که کیفیت جنین در گروه اسپرم طبیعی به‌طور قابل‌توجهی بیشتر از گروه دارای شکست DNA اسپرم بود (35/93 درصد در مقابل 74/75 درصد همچنین، میانگین سرعت اسپرم در گروه طبیعی به‌طور چشمگیری بالاتر از گروه دارای شکست DNA بود (2/36 در مقابل 53/5 درصد).

شکل2: میانگین کیفیت جنین و سرعت اسپرم

همچنین مقایسه میانگین درصد حرکت اسپرم (شکل 3) در چهار وضعیت مختلف نشان داد که میانگین درصد اسپرم‌های بدون حرکت (D) در گروه دارای شکست DNA برابر با 82.17 درصد و در گروه اسپرم طبیعی 93/41 درصد بود. در گروه دارای شکست DNA، میانگین درصد اسپرم‌های با حرکت چرخشی (C)، حرکت پیشرونده کند (B) و حرکت پیشرونده سریع (A) به‌ترتیب 17، 4/5 و 1/0 درصد بود، در حالی‫که این مقادیر در گروه اسپرم طبیعی به‌ترتیب 87/0، 13/25 و 07/11درصد ثبت شد.

بررسی داده‌های شکل 4 نیز نشان داد که در گروه دارای شکست DNA، میانگین درصد جنین‌های درجه A، B  و C به‌ترتیب 96/29، 89/45 و 6/27 درصد بود، در حالی که این مقادیر در گروه اسپرم طبیعی به‌ترتیب 74/65، 15/24 و 64/6 درصد به‌دست آمد.

برای بررسی تاثیر شکست DNA اسپرم بر کیفیت جنین، آزمون t مستقل با در نظر گرفتن نابرابری واریانس‌ها انجام شد. نتایج جدول 1نشان داد که شکست DNA اسپرم تاثیر معنی‌داری بر کاهش کیفیت جنین دارد (P<0.01). همچنین، اندازه اثر (Eta squared= t²/t²+(N1+N2-2)=0.21) نشان داد که حدود 21 درصد از واریانس کیفیت جنین توسط شکست DNA اسپرم تبیین می‌شود که بیانگر اندازه اثر متوسط است.

شکل3: میانگین درصد حرکت اسپرم

شکل 4: میانگین درصد تعداد جنین

برای بررسی فرضیه دوم پژوهش، از آزمون همبستگی اسپیرمن استفاده شد. نتایج (جدول 2) نشان داد که بین شکست DNA اسپرم و تعداد اسپرم، همبستگی منفی و معنی‌داری وجود دارد (r=-0.799, P<0.01). همچنین، بین شکست DNA اسپرم و سرعت اسپرم نیز همبستگی منفی و معنی‌داری مشاهده شد (r=-0.732 , P<0.01). این یافته‌ها نشان می‌دهد که افزایش میزان شکست DNA اسپرم با کاهش تعداد و سرعت اسپرم همراه است.

جدول1 : آزمون T مستقل برای بررسی ارتباط شکست DNA  اسپرم و کیفیت جنین

P<0.01^**

جدول 2: همبستگی پیرسون برای بررسی ارتباط شکست DNA اسپرم و تعداد و سرعت اسپرم

برای بررسی تاثیر شکست DNA اسپرم بر مورفولوژی اسپرم، از آزمون t استیودنت استفاده شد. با توجه به عدم برقراری همگنی واریانس‌ها بر اساس آزمون لوین (p<0.01)، تحلیل بر مبنای نابرابری واریانس‌ها انجام شد. نتایج جدول 3 نشان داد که شکست DNA  اسپرم تاثیر معنی‌داری بر مورفولوژی اسپرم دارد (p<0.01) . همچنین، اندازه اثر برابر با 67/0 به‌دست آمد که نشان می‌دهد حدود 67 درصد از واریانس مورفولوژی اسپرم توسط شکست DNA اسپرم تبیین می‌شود و بیانگر اندازه اثر بزرگ است.

برای بررسی فرضیه سوم، مبنی بر تاثیر میزان شکست DNA اسپرم بر کیفیت جنین، از آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه استفاده شد (جدول 4). بر این اساس، میزان شکست DNA اسپرم به سه سطح خوب (کمتر از 15 درصد)، متوسط (16 تا 30 درصد) و ضعیف (بیش از 31 درصد) تقسیم‌بندی شد. با توجه به عدم همگنی واریانس‌ها بر اساس آزمون لوین (p<0.05)، تحلیل واریانس با در نظر گرفتن ناهمگنی واریانس‌ها انجام شد. نتایج نشان داد که میزان شکست DNA اسپرم تاثیر معنی‌داری بر کیفیت جنین دارد  (p<0.01).

جدول3: بررسی میزان تأثیر شکست DNA اسپرم بر روی شکل اسپرم به کمک آزمون تی استودنت

p<0.01^**

جدول4 : بررسی تاثیر میزان شکست DNA اسپرم بر کیفیت جنین به کمک آزمون تحلیل واریانس یک‌طرفه

مقایسه زوجی دانت نشان داد که افراد با میزان شکست DNA اسپرم کمتر از 15 درصد (گروه خوب)، در مقایسه با افراد دارای شکست بیش از 31 درصد (گروه ضعیف)، به‌طور معنی‌داری (p<0.05)، کیفیت جنین بالاتری داشتند (اختلاف میانگین=34/18). با این حال، بین گروه‌های دارای شکست DNA اسپرم در سطوح خوب و متوسط، تفاوت معنی‌داری از نظر کیفیت جنین مشاهده نشد.

5- بحث

ناباروری با عامل مردانه حدود نیمی از موارد ناباروری را شامل می‌شود و اختلال در پارامترهای اسپرم یکی از مهم‌ترین علل آن است. سلامت DNA و کروماتین اسپرم نقش اساسی در لقاح، تکامل جنین و موفقیت روش‌های کمک‌باروری دارد؛ ازاین‌رو، ارزیابی سلامت DNA اسپرم در مردان دارای عوامل خطر، از جمله سن بالا، واریکوسل، سقط مکرر، مواجهه با عوامل محیطی زیان‌آور و بیماران مبتلا به سرطان پیش از شیمی‌درمانی توصیه می‌شود (6).

مطالعات متعددی ارتباط بین آسیب DNA اسپرم و نتایج روش‌های کمک‌باروری را بررسی کرده‌اند، اما تفاوت در روش‌های ارزیابی، پروتکل‌ها، مقادیر آستانه و ویژگی‌های جمعیت مورد مطالعه، مقایسه مستقیم نتایج را دشوار کرده است. با وجود این، شواهد نشان می‌دهد که افزایش آسیب DNA اسپرم با کاهش کیفیت جنین و کاهش موفقیت IVF و ICSI همراه است. همچنین، با توجه به هزینه نسبتا پایین آزمون SDF در مقایسه با روش‌های کمک‌باروری، انجام این آزمون پیش از شروع درمان می‌تواند از نظر بالینی و اقتصادی سودمند باشد  (7).

نتایج پژوهش حاضر نیز این یافته‌ها را تایید کرد و نشان داد که افزایش شکست DNA اسپرم با کاهش تعداد، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم همراه است. در گروه دارای DFI بالا، تعداد اسپرم کم‫تر، تحرک پیشرونده ضعیف‌تر و درصد مورفولوژی طبیعی پایین‌تر از گروه اسپرم طبیعی بود. به‌طور کلی، افزایش شکست DNA اسپرم با کاهش کیفیت کلی اسپرم و در نتیجه کاهش کیفیت جنین همراه بود که اهمیت ارزیابی سلامت DNA اسپرم را پیش از انجام روش‌های کمک‌باروری نشان می‌دهد.

در این مطالعه، افراد با DFI کم‫تر از 15 درصد در گروه با کیفیت مناسب اسپرم و افراد با DFI بیش از 31 درصد در گروه با کیفیت پایین اسپرم قرار گرفتند که به‌ترتیب بیانگر سلامت ژنتیکی مطلوب و نامطلوب اسپرم بود. با توجه به این‫که هدف اصلی پژوهش بررسی تاثیر شکست DNA اسپرم بر نتایج ICSI بود، کیفیت جنین به‌عنوان نخستین شاخص موفقیت درمان ارزیابی شد. نتایج نشان داد که میانگین کیفیت جنین و درصد جنین‌های درجه A در گروه اسپرم طبیعی به‌طور معنی‌داری بیشتر از گروه دارای DFI بالا بود، در حالی که درصد جنین‌های درجه C در گروه دارای شکست DNA بیشتر، افزایش معنی‌داری داشت.

مطالعات نشان داده‌اند که انتخاب اسپرم بر اساس پارامترهای متداول مانند تعداد، تحرک و مورفولوژی، لزوما بیانگر سلامت DNA اسپرم نیست. از آن‫جا که اسپرم بالغ فاقد سیستم‌های موثر ترمیم DNA است، آسیب‌های ایجادشده طی اسپرماتوژنز تا زمان لقاح باقی می‌مانند. اگرچه اووسیت تا حدودی قادر به ترمیم آسیب‌های DNA اسپرم است، اما در مواردی که میزان آسیب زیاد باشد، این ظرفیت کافی نبوده و می‌تواند موجب کاهش لانه‌گزینی، اختلال در رشد جنین و کاهش موفقیت IVF و ICSI شود. مطالعات متعدد نیز وجود ارتباط معکوس بین آسیب DNA اسپرم و تشکیل بلاستوسیست، رشد جنین و میزان بارداری را گزارش کرده‌اند (8).

یافته‌های پژوهش حاضر نیز با این نتایج همسو بود و نشان داد که افزایش شکست DNA اسپرم در مردان مبتلا به الیگوآستنواسپرمی با کاهش کیفیت جنین همراه است و می‌تواند یکی از عوامل موثر بر کاهش موفقیت روش‌های کمک‌باروری باشد. نتایج این مطالعه نشان داد که در اغلب موارد، اسپرم‌های با مورفولوژی طبیعی و درصد پایین شکست DNA، جنین‌های باکیفیت‌تری تشکیل دادند. با این‫حال، این رابطه مطلق نبود؛ به‌طوری‌که در برخی نمونه‌ها، با وجود پارامترهای مناسب اسپرم، میزان شکست DNA بالا بود و در مقابل، در برخی موارد با وجود تعداد، تحرک و مورفولوژی نامطلوب و DFI بالا، جنین‌های باکیفیت گرید A تشکیل شد. این یافته می‌تواند بیانگر نقش جبرانی کیفیت بالای اووسیت در ترمیم بخشی از آسیب‌های DNA اسپرم باشد.

از آن‫جا که نمونه‌های مایع منی از نظر ویژگی‌های اسپرم ناهمگن هستند، انتخاب اسپرم در روش ICSI صرفا بر اساس مورفولوژی و تحرک، همواره تضمین‌کننده سلامت ژنتیکی آن نیست. بنابراین، ممکن است اسپرم‌هایی با ظاهر طبیعی اما دارای آسیب DNA برای تزریق انتخاب شوند. یافته‌های این مطالعه، همسو با مطالعات پیشین، نشان داد که آسیب و اختلال در ساختار کروماتین اسپرم با کاهش کیفیت جنین و نتایج ICSI ارتباط دارد، اگرچه بررسی اثرات بلندمدت آن بر سلامت فرزندان حاصل از ART همچنان نیازمند مطالعات بیشتری است (12-9).

با وجود محدودیت‌هایی در پیش‌بینی پیامدهای تولیدمثل، ارزیابی شکست DNA اسپرم می‌تواند به‌عنوان ابزاری ارزشمند در کنار سایر شاخص‌های آزمایشگاهی، به پیش‌بینی نتایج ICSI و انتخاب راهبرد درمانی مناسب کمک کند. همچنین، شناسایی آسیب DNA اسپرم پیش از درمان، امکان انجام مداخلاتی مانند اصلاح سبک زندگی یا استفاده از آنتی‌اکسیدانت‌هایی نظیر روی، ویتامین C و ویتامین E را برای بهبود کیفیت اسپرم فراهم می‌کند.

از محدودیت‌های این پژوهش می‌توان به حجم نسبتا محدود نمونه‌ها، انجام مطالعه در یک مرکز درمان ناباروری، عدم بررسی برخی عوامل مداخله‌گر از جمله سبک زندگی، شاخص توده بدنی، وضعیت تغذیه و مدت ناباروری، و نیز عدم ارزیابی پیامدهای نهایی بارداری و تولد زنده اشاره کرد. بنابراین، انجام مطالعات چندمرکزی با حجم نمونه بیشتر و پیگیری پیامدهای بارداری و تولد زنده برای تأیید و تعمیم این یافته‌ها پیشنهاد می‌شود.

6- نتیجه­گیری

یافته‌های این پژوهش نشان داد که افزایش شکست DNA اسپرم با کاهش تعداد، تحرک و مورفولوژی طبیعی اسپرم و همچنین کاهش کیفیت جنین در روش ICSI همراه است. این نتایج بیانگر آن است که سلامت DNA اسپرم نقش مهمی در موفقیت روش‌های کمک ‌باروری ایفا می‌کند و آسیب DNA می‌تواند یکی از عوامل مؤثر در شکست درمان باشد.

بر این اساس، ارزیابی میزان شکست DNA اسپرم (SDF/SDFA) پیش از انتخاب روش درمانی، به‌ویژه در زوجین با سابقه شکست مکرر IVF یا ICSI، می‌تواند به تصمیم‌گیری بالینی و انتخاب راهبرد درمانی مناسب کمک کند. همچنین، در مواردی که آسیب DNA اسپرم تشخیص داده شود، انجام مداخلات درمانی مناسب ممکن است موجب بهبود کیفیت اسپرم و افزایش احتمال موفقیت درمان شود.

با وجود شواهد امیدوارکننده، هنوز اتفاق نظر کاملی درباره استفاده روتین از آزمون SDF در تمامی مردان نابارور وجود ندارد و انجام مطالعات بیشتر برای تعیین جایگاه دقیق این آزمون در ارزیابی ناباروری مردان ضروری است.

 7- تشکر و قدردانی

از تمام افرادی که در به نتیجه رسیدن این کار مشارکت داشته­اند تقدیر و تشکر داریم.