مقدمه

فناوری نانو در جهت بهبود و افزایش کمیت و کیفیت دستاوردهای علمی بکار گرفته می شود. اولین کاربرد فناوری نانو در کشاورزی توسط وزارت کشاورزی آمریکا، در سال 2003 صورت گرفت (1). پاسخ گیاهان به نانوذرات وابسته به گونه گیاه، مرحله رویشی آن، نوع نانوذرات (2) و زمان در معرض قرارگیری گیاه به این ذرات است (3). در سال­های اخیر، استفاده از نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم به دلیل خواص ویژه آن شامل توانایی فتوکاتالیزوری، آب­دوستی زیاد، هدایت­پذیری بالا (4) و تحریک واکنش­های اکسیداسیون و احیاء (5) مورد توجه قرارگرفته است. گزارش شده است که نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم قادرند با ترغیب جذب آب و عناصر غذایی از سیستم ریشه، فعالیت آنزیم­های کاتالاز، پراکسیداز (6) و سوپراکسیددیسموتاز (7) را افزایش دهند.

مرزنجوش (Origanum spp.) گیاهی یک تا چند ساله و معطر از تیره نعناع (Lamiaceae) می­باشد که حدودا 50 گونه دارد (8). پراکنش این گیاه در دامنه­های شمالی البرز و در نواحی جنگلی کشور، در استان­های گلستان، مازندران، گیلان، آذربایجان­شرقی، غربی، خراسان و تهران می­باشد (9). مرزنجوش از گیاهان خوراکی رایجی است که در نقاط مختلف دنیا به عنوان ادویه استفاده می­شود. از کاربردهای درمانی آن می­توان به درمان کلیه، ضعف اعصاب، اختلالات تنفسی، اسپاسم، گلودرد، دیابت، فشارخون بالا، سرماخوردگی، سردرد، صرع و عفونت­های ادراری اشاره داشت. هم­چنین این گیاه دارای خاصیت ضدسرطانی، ضدچربی خون و ضدالتهابی قابل­توجه است (8). بر طبق گزارش­های علمی معتبر، این گیاه دارای خواص آنتی­اکسیدان و ضد میکروبی قوی بر ضد پاتوژن­های انسانی و نیز عوامل فساد مواد­غذایی است. این خواص به دارا بودن روغن­های اسانسی، فلاونوئیدها، اسیدهای فنلی و سایر ترکیبات شیمیایی مرزنجوش نسبت داده می­شود (10).

نانوذرات بسته به غلظت خود می­توانند موجب تنش اکسیداتیو و افزایش تولید گونه­های­کنشگر­اکسیژن ((ROS، پراکسیداسیون لیپیدها، اکسیدشدن پروتئین­ها، آسیب به اسیدهای نوکلئیک، مهار آنزیمی وگاهاً مرگ سلولی شوند (11). اکسیژن یکتایی (O₂ ^.)، سوپراکسید (O₂ ^.-)، رادیکال هیدروکسیل (OH ^.) و پراکسیدهیدروژن (H₂O₂) از انواع رایج ROS می‌باشند (12). بنابراین وقتی گیاه در معرض نانوذرات قرار می­گیرد، تولید ترکیبات آنتی­اکسیدان (آنزیمی و غیرآنزیمی) را به منظور حفظ متابولیسم درون سلولی افزایش می­دهد (13). تاثیر مثبت این ذرات بر واکنش­های نوری (14و 15) و غیرنوری (16 و 17) فتوسنتز نیز تائید شده­است. تاثیر افزاینده نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر محتوای رنگیزه­های فتوسنتزی نعنا فلفلی (Mentha piperita L.) (18)، محتوای کلروفیل توت­فرنگی (Fragaria ananassa c.v. Queen Elisa) و گوجه­فرنگی (Lycospersicom esculentum L.)، (19 و 20) وکلروفیل a اسفناج (Spinacia oleraceae L.) (21) از مجموعه این نتایج است که پیامد افزایش رشد و راندمان تولید را به همراه داشت. با توجه به اهمیت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم و خواص ویژه آن در افزایش زیست­توده گیاهان، این پژوهش به مطالعه مقایسه­ای اثر این نانوذرات بر برخی ویژگی­های فیزیولوژیکی و توان آنتی­اکسیدانی دو گونه مرزنجوش می­پردازد.

2- مواد و روش­ها

تهیه و آماده‌سازی بذر: بذرهای مرزنجوش مدیترانه­ای و اروپایی به ترتیب از 'مرکز تحقیقات کشاورزی' مشهد و شرکت 'پاکان بذر' اصفهان تهیه شدند. بذرهای سالم از هر دو گونه مرزنجوش، ابتدا به مدت 10 دقیقه با محلول هیپوکلریت سدیم 6 درصد (v/v) ضدعفونی و سپس سه بار با آب مقطر شستشو داده شدند.

تهیه و آماده‌سازی نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم: نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم ازUS3490, US Research Nanomaterials, Inc. تهیه گردید. محلول پایه نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم (2/1 میلی­گرم در 10 میلی­لیتر آب مقطر) تهیه و به مدت 25 دقیقه در دستگاه اولتراسونیک (مدل 2600s، شرکت Parsonic، ژاپن) با فرکانس 40 هرتز قرار گرفتند. سپس غلظت­های مختلف نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم تهیه شده از محلول پایه (10، 60 و 120 میلی‌گرم درلیتر) به مدت 40 دقیقه با فرکانس 30 هرتز سونیکیت شدند.

کاشت گیاه و اعمال تیمارها: گلدان‌ها (15×15 سانتی­متر مربع) با نسبت مساوی خاک و ماسه پر شدند. بذرها به سطح رویی خاک گلدان‌ها انتقال یافتند. گیاهان به مدت دو ماه در شرایط گلخانه با دمای 2±25 درجه سانتی‌گراد، دوره 16 ساعت روشنایی - 8 ساعت تاریکی و آبیاری در حد ظرفیت زراعی قرار گرفتند. سپس بخش­های هوایی مرزنجوش­ها، با غلظت­های مختلف ذرات­نانو، در سه نوبت و با فواصل زمانی سه روز، محلول­پاشی شدند. بعد از دو هفته از آخرین تیمار،برداشت گیاهان انجام شد.

سنجش رنگیزه­های فتوسنتزی: برای اندازه­گیری مقدار کلروفیل­ها و کاروتنوئید از روش (22) با کمی تغییرات استفاده شد؛ بدین صورت که 05/0 گرم از بافت­تر برگ با4میلی­لیتر استون80درصد(v/v) سائیده و پس از رساندن به حجم نهایی 6 میلی­لیتر، به مدت 5 دقیقه درg  894 (rpm 4000) سانتریفیوژ شد. خوانش جذب با دستگاه اسپکتروفتومتر (مدل z230a، شرکت Chermle، آلمان) در طول­موج­های470،645 و 663 نانومتر و محاسبه مقدار کلروفیل­ها و کاروتنوئیدبرمبنای رابطه­های ارائه شده در رفرنس، انجام شد و نتایج بر حسب میکروگرم بر گرم وزن­تر ارائه گردید.

اندازه­گیری شاخص پایداری غشاء: میزان پایداری غشاءبرگ­های متقابل ردیف دوم از قاعده ساقه، بر اساس رابطهMSI = 1- EC₄₀/ EC₁₀₀ و به روش(23) سنجش شد. در این رابطه، EC₄₀ هدایت­الکتریکی نمونه در دمای 40 درجه سانتی­گراد و EC₁₀₀ هدایت الکتریکی نمونه در دمای 100درجه سانتیگراد است.

سنجش میزان مالون دی­آلدئید: بدین منظور، 1/0 گرم از بافت تربرگبا 2میلی­لیتر تری­کلرواستیک­اسید(TCA) 1/0 درصد(w/v)ساییده و سپس درg 8050 ( rpm 12000) سانتریفیوژ گردید. سپس به 5/0 میلی‌لیتر از عصاره، 2 میلی­لیترمحلول TCA 20 درصد (w/v) و تیوباربیتوریک­اسید (TBA) 5/0 درصد (w/v) اضافه شد. پس از قرارگیری مخلوط به مدت 30 دقیقه در دمای 95 درجه سانتیگراد، جذب نوری هر یک از نمونه‌ها در طول­موج 532 و 600 نانومتر خوانده و غلظتکمپلکس(MDA-TBA) بااستفاده از رابطه  A₅₃₂-A₆₀₀/155محاسبه و برحسب میکرومول بر گرم وزن­تر بیان شد (24).

سنجش میزان پرولین: برای تعیین مقدار پرولین، ابتدا 1/0 گرم از بافت­تر برگ در 5/2 میلی‌لیتر سولفوسالیسیلیک­اسید 3 درصد (v/w) سائیده و سپس در g  894 ( rpm 4000) سانتریفیوژ شد. پس از اضافه نمودن 1 میلی‌لیتر از معرف نین­هیدرین و1 میلی‌لیتر استیک­اسید، نمونه در حمام آب جوش 100 درجه سانتیگراد قرار داده شد. با افزودن 2 میلی‌لیتر تولوئن، نمونه­ها به مدت 30 ثانیه ورتکس شدند. در نهایت با خوانش جذب در 520 نانومتر، غلظت پرولین براساس میکرومول در گرم وزن­تر نمونه گیاهی محاسبه شد (25).

تهیه عصاره آنزیمی و سنجش میزان پروتئین: برای اندازه گیری فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، ابتدا تهیه عصاره آنزیمی از بافت برگ به کمک بافر فسفات­پتاسیم100 میلی­مولار (4/7= pH) صورت گرفت (26) و مقدار پروتئین کل در هر نمونه بر حسب میلی­گرم در گرم وزن­ترنمونه ارائه گردید (27).

سنجش فعالیت آنزیم گایاکول پراکسیداز (POX): سنجش آنزیم گایاکول پراکسیداز براساس اکسیداسیون گایاکول مورد اندازه­گیری قرار گرفت. مخلوط واکنش شامل عصاره آنزیمی و مجموعه بافر فسفات پتاسیم 25 میلی­مولار (8/6pH=)، H₂O₂ 40 میلی­مولارو گایاکول 20 میلی­مولار تهیه شد. با استفاده ازتغییرات جذب به مدت1دقیقه در طول­موج 470 نانومتر و ضریب خاموشیmM^-1 cm^-15/25، فعالیت ویژه آنزیم براساس واحد آنزیمی در گرم وزن ­تر محاسبه شد (28).

سنجش فعالیت آنزیم آسکوربات پراکسیداز(APX): فعالیت آسکوربات پراکسیداز، بر پایه سرعت اکسیداسیون آسکوربات محاسبه شد. مخلوط واکنش از مجموعه بافر فسفات پتاسیم 100 میلی­مولار (7 pH= )، آسکوربات 1 میلی­مولار،EDTA  4/0 میلی­مولار، آب دو بار تقطیر، H₂O₂ 10 میلــی­مــولار و در نهایت عصاره آنزیمــی آماده شد. تغییرات جذب مخلوط واکنش در طول­مـوج 290نانومتر یادداشت و با استفاده از ضریب خاموشـی mM^-1 cm^-18/2، فعالیت ویژه آنزیم براساس واحد آنزیمی در گرم وزن تر بیان شد(29).

سنجش فعالیت آنزیم پلی­فنل اکسیداز (PPO): مخلوط واکنش حاوی بافر فسفات پتاسیم 2/0 مولار (8/6 pH=)، پیروگالل02/0 مولار و عصاره آنزیمی، در جهت بررسی فعالیت آنزیم پلی­فنل­اکسیداز تهیه شد. ضرورت تامین دمای 40 درجه سانتیگراد برای واکنش آنزیم وجود دارد. جذب نمونه­ها در طول­موج 430 نانومتر به مدت 3 دقیقه ثبت و فعالیت ویژه آنزیم با استفاده از ضریب­خاموشی mM^-1 cm^-1 47/2 و براساس واحد آنزیمی در گرم وزن تر محاسبه شد(30).

سنجش فعالیت آنزیم کاتالاز(CAT): فعالیت آنزیم کاتالاز برمبنای محاسبه کاهش جذب H₂O₂ در 240نانومترو به روش(31) و بـااسـتفاده از ضـریب­خاموشـیmM^-1 cm^-15/39 و براساس واحد آنزیمی در گرم وزن تر ارائه گردید.

سنجش فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز (SOD): برای اندازه­گیری فعالیت آنزیم سوپراکسیددیسموتاز، مخلوط واکنش (3 میلـی­لیتـر) شامل بـافر فسـفات پتاسـیم 50 میلی­مولار (5/7pH= )، EDTA1/0 میلی­مولا ، نیتروبلوتترازولیوم (NBT) 75میکرومولار، ریبوفلاوین 4 میلی­مولار و100 میکرولیتر عصاره آنزیمی استفاده شد. لولــه­هــای آزمایش به مدت 15 دقیقه در زیر لامپ­های فلورسنت (در حدود 30 وات) قرار گرفتند. از مخلوط واکنش بدون آنزیم به عنوان شاهد روشنایی و مخلوط واکنش­کامـل قرار گرفته در شرایط تاریکی بـه عنـوان شاهد استفاده گردیـد. پـس از توقـف واکـنش، جذب نمونه­ها در 560 نانومتر خوانش و براساس 50% ممانعت از احیای نوری NBT، فعالیت ویژه آنزیم براساس واحد آنزیمی در گرم وزن­تر گزارش گردید (32).

سنجش فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس-ترانسفراز (GST): فعالیت آنزیم گلوتاتیون اس-ترانسفراز به روش (33) مورد سنجش قرار گرفت. مخلوط واکنش شامل بافر فسفات پتاسیم100 میلی­مولار (7pH= )، گلوتاتیون احیا 1 میلی­مولار، 1-کلرو 2، 4- دی­نیترو بنزن 1میلی­مولار و 100 میکرولیتر از عصاره آنزیمی تهیه گردید. سپس تغییرات جذب نمونه­ها در طول­موج 340 نانومتر بررسی و میزان فعالیت ویژه آنزیم با درنظر گرفتن ضریب­خاموشیmM^-1 cm^-1 6/9 و براساس واحد آنزیمی در گرم وزن­تر محاسبه شد.

3- آنالیز آماری

کلیه آزمایشات براساس طرح فاکتوریل، در قالب کاملا تصادفی با سه تکرار صورت گرفت. میانگین داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS (v.16) مورد تحلیل واریانس (ANOVA) قرار گرفت. میانگین­ها با کمک آزمون دانکن در سطح احتمال خطا یک و پنج درصد مقایسه شدند.

4-  نتایج

نتایج حاصل ازآنالیز واریانس داده­های پژوهش حاضر نشان داد که نوع گونه گیاهی، تیمار اعمال شده و برهمکنش آن­ها، بر صفات فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی بررسی­شده معنی­دار (p ≤ 0.05 و p ≤ 0.01) بود (جدول 1 و 2).

جدول1: تجزیه واریانس اثرات گونه و تیمارهای نانوذره دی­اکسیدتیتانیوم برمقدار کلروفیل­های a، b و کل، کاروتنوئیدها، شاخص پایداری غشا، مالون دی­آلدئید و پرولین دو گونه مرزنجوش. ns، *و ** به‫ترتیب بیانگر عدم معنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال خطای پنج و یک درصد است.

جدول2: تجزیه واریانس اثرات گونه و تیمارهای نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر مقدار پروتئین­کل و فعالیت ویژه آنزیم­های آنتی­اکسیدانت در سطوح مختلف تیماری نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر دو گونه مرزنجوش. ns، * و ** به‫ترتیب بیانگر عدم معنی‌داری و معنی‌داری در سطح احتمال خطای پنج و یک درصد است.

مقدار کلروفیل­ها و کاروتنوئید کل

بررسی مقادیر کلروفیل­های a، b و کل نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم، تقریبا مقدار رنگیزه­های مذکور در هر دو گونه مرزنجوش مورد مطالعه افزایش یافت، به‫طوری‫که بیشترین میزان کلروفیل­های a وکل در تیمار 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات مشاهده شد. هرچند بین تیمار 60 و 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات تفاوت معنی­دار آماری مشاهده نشد (شکل1 - A و C)؛ اما بیشترین مقدار کلروفیل b مرزنجوش اروپایی در غلظت 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات اندازه­گیری شد (شکل­1- B). میزان کاروتنوئید­های دو گونه تیمار شده با غلظت های نانوذرات، در ابتدا افزایشی و سپس کاهشی بود؛ به این نحو که بیشترین مقدار کاروتنوئید مرزنجوش مدیترانه ای در تیمار غلظت 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات مشاهده شد و بعد از آن کاهش یافت ولی بین تیمار 60 و 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات در گونه اروپایی، تفاوت معنی­داری از لحاظ آماری وجود نداشت (شکل1- D). نکته قابل­توجه، بیشتر بودن محتوای تمام رنگیزه­ها، در شرایط تیمارشده با نانوذرات نسبت به شرایط کنترل (شاهد) دو گونه بود.

شکل 1: تاثیر تیمار با غلظت‌­های مختلف نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر میزان کلروفیل a (A)، کلروفیلb (B)، کلروفیل­کل (C) و میزان کاروتنوئید (D) دو گونه مرزنجوش. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای آزمون دانکن در سطح 05/0 ≤ p  است.

بر اساس منابع، با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیومتا 100 میلی­گرم درلیتر، محتوا کلروفیل a، b و کل مریم­گلی (Salvia officinalis L.) و بادرنجبویه (Dracocephalom moldavica L.) افزایش یافت (17 و 34)، اما غلظت­های بالاتر این نانوذرات (200 میلی­گرم درلیتر)، موجب کاهش مقدار کلروفیل a، b و کاروتنوئید بادرنجبویه گردید. در پژوهشی دیگر، کلروفیل a، b و کل گندم (Triticum aestivum L.) درنتیجه افزایش غلظت تیمار نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم تا 40 میلی­گرم درلیتر، افزایش و در غلظت­های 60 و 80 میلی­گرم درلیتر کاهش یافت (35). در پژوهش حاضر، تاثیر القایی نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر محتوا رنگیزه­های دو گونه مرزنجوش مشاهده شد. مشخص شده است که نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم با بهبود ساختار کلروفیل و افزایش تولید این گروه از رنگیزه­ها (7)، به نوعی از پیری کلروپلاست جلوگیری می­کنند (36). محققان بیان داشتند که این اثرات مثبت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم می­تواند منوط به افزایش جذب مواد مغذی مانند نیتروژن و منیزیم (اجزاء ساختار کلروفیل) باشد (37). ولیکن در غلظت­های زیاد نانوذرات و آسیب ناشی از آن بر سیستم غشایی کلروپلاست و کلروفیل، راندمان فتوسنتز و زیتوده گیاه تحت­تاثیر قرار می­گیرد (38).کاروتنوئیدها علاوه بر ایفای نقش رنگیزه کمکی در دستگاه فتوسنتزی،وظیفه حفاظت کلروفیل­ها در برابر تنش اکسیداتیو را بر عهده دارند و می­توانند با گرفتن انرژی اضافی طول­موج­های کوتاه و تبدیل اکسیژن یکتایی به اکسیژن سه­تایی و خنثی­کردن رادیکال­های آزاد، نقش آنتی­اکسیدانی خود را ایفا کنند (39). لذا افزایش غلظت کاروتنوئیدها در شرایط تیمار با سطوح متوسط نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم منطقی به نظر می­رسد؛ اما در غلظت­های بیشتر نانوذراتو تولید بیش از حد ROSها، پراکسیداسیون غشاء و به هم خوردن تعادل یونی و به­دنبال آن آسیب ساختار کلروپلاست (غشاء) و در نهایت کاهش مقدار رنگیزه­ها صورت می­گیرد (40 و 41).

شاخص پایداری غشا

 ارزیابی تیمار غلظت­های مختلف نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر دو گونه مرزنجوش نشان داد که هرچند از لحاظ آماری، تفاوتی در اثر غلظت‫های مختلف نانوذره دی اکسیدتیتانیوم بر شاخص پایداری غشا وجود ندارد اما می‫توان بیان داشت که غلظت 60 میلی­گرم در­لیتر تیمار، موجب افزایش شاخص پایداری غشا مرزنجوش مدیترانه­ای نسبت به شاهد شد (شکل 2- A). شایان ذکر است که تاثیر منفی غلظت­ 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر سیستم غشایی دو گونه از لحاظ آماری معنی­دار بوده و به‫دلیل نشت الکترولیت­ها قابل­توجه است. مشابه این نتایج، افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم تیمار شده موجب کاهش شاخص پایداری غشا گندم شد (35). کاهش شاخص پایداری غشا در غلظت­های بالا این نانوذرات ، در گیاه نخود (Cicer arietinum L.) نیز مشاهده شد (42). غشا یکی از نقاط اصلی آسیب اعمال­شده از سوی رادیکال­های هیدروکسیل است. لذا هرگونه کاهش در شاخص پایداری غشا نشان­دهنده آسیب به غشاهای زیستی و معیاری برای ارزیابی سطح اکسایش وارده به آن می­باشد. هرچه آسیب به سیستم غشایی کمتر باشد، میزان نشت الکترولیتی کمتر و در نتیجه نفوذ‫پذیری انتخابی غشا بهتر حفظ می­گردد (43). در گیاهانی که در معرض انواع تنش­ها قرار می‫گیرند، نفوذپذیری غشاهای سلولی به‫دلیل صدمات ناشی از تجمعROS  افزایش می­یابد که این امر منجر به کاهش تمامیت غشاها و کاهش توانایی در کنترل ورود و خروج مواد می­شود.

مالون دی­آلدئید

بررسی نتایج داده ها نشان داد که تیمارهای نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم تاثیر معنی­داری بر تغییر میزان مالون­دی­آلدئید مرزنجوش مدیترانه­ای (در مقایسه با نمونه شاهد) نداشت؛ اما تاثیر افزایشی تیمارهای 10 و 120 میلی­گرم درلیتر نانوذرات بر میزان مالون­دی­آلدئید مرزنجوش اروپایی قابل­توجه بود؛ به­طوری­که در غلظت 120 میلی­گرم درلیتر نانوذرات، مقدار مالون دی­آلدئید دو برابری نسبت به نمونه شاهد مشاهده شد (شکل 2- B). مالون­دی­آلدئید یکی از نشانگرهای مهم پراکسیده شدن سیستم غشایی و وقوع تنش اکسیداتیو است. در پژوهش­های پیشین مشخص شد که با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم ، میزان مالون­دی­آلدئید لوبیا سبز (Phaseolus vuigaris L.) و نخود افزایش یافت (13 و 42)؛ اما افزایش غلظت نانوذرات تا 150 میکرومول درلیتر موجب کاهش مالون­دی­آلدئید گیاه آروندیناریا (Arundinari apygmaea L.) شد (44). پراکسیداسیون لیپیدهای غشاءتوسط رادیکال­های آزاد،یک شاخص برای حضورترکیبات سمی درمحیط است که منجربه تولید و افزایش مالون­دی­آلدئید ناشی ازتنش اکسیداتیو می­گردد (45). بر پایه نتایج مطالعه حاضر، به نظر می­رسد که سیستم آنتی­اکسیدانی گیاه مرزنجوش مدیترانه­ای تحت تیمار با غلظت­های نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم، قادر است تا رادیکال­های آزاد را خنثی کرده و مانع از پراکسیداسیون غشاء شود. در حالی­که غلظت­های میانه و بالا نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم اعمال شده بر مرزنجوش اروپایی به­جهت تولید بیش از حد ROS در مسیر پیام­رسانی سیگنال، موجب پراکسیداسیون لیپیدهای غشاء و تغییر در ساختارغشاء و دیواره سلولی گردید (40 و 46 و 47) که درصورت تشدید­شدن شرایط تنش ونشت بالای یونی،مرگ سلولی را به­دنبال خواهد داشت (48).

پرولین

 بررسی میزان پرولین هر دو گونه مرزنجوش نشان داد که با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم ، مقدار این ترکیب افزایش یافت؛ البته این روند تغییر به گونه­ای بود که مرزنجوش مدیترانه­ای 54/58 درصد افزایش بیشتری در مقدار پرولین (تیمار 120 میلی­گرم در­لیتر) نسبت به مرزنجوش اروپایی داشت (شکل 2- C).

شکل 2: تاثیر تیمار با غلظت‌­های مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بر شاخص پایداری غشا (A)، میزان مالون دی­آلدئید (B) و مقدار پرولین (C) دو گونه مرزنجوش. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای آزمون دانکن در سطح 05/0 ≥p   است.

  نیز گزارشی مبنی بر افزایش مقدار پرولین در گیاه گندم تحت تیمار با نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم ارائه دادند (49). در پژوهشی دیگر، مقدار پرولین در گیاه جو (Hordeum vulgare L.) تحت تیمار با نانوذرات تیتانیوم افزایش و تحت تیمار با نانوذرات روی (ZnO) کاهش یافت (50). پرولین یکی از حساس­ترین اسمولیت­های تنشی است که با حفظ ساختار سلول و تثبیت فشار اسمزی، در پایداری پروتئین­ها، آنزیم­ها و نیز تنظیم pH سلول نقش دارد (51). لذا افزایش آن به‫عنوان بخشی از سیستم آنتی­اکسیدانت غیرآنزیمی طبیعی به‫نظر می­رسد.

پروتئین­کل و آنزیم­های آنتی­اکسیدانت

بررسی مقدار پروتئین­کل در پژوهش حاضر نشان داد که چه در شرایط شاهد و چه در شرایط تیمارشده با نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم، مرزنجوش مدیترانه­ای از مقدار قابل­توجه پروتئین نسبت به مرزنجوش اروپایی برخوردار است. به‫طوری که غلظت 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات، بهترین تاثیر را بر این افزایش داشت (شکل 3- A).

میانگین داده­های حاصل از بررسی فعالیت آنزیم پراکسیداز نشان داد که تا تیمار 60 میلی­گرم نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر هر دو گونه مرزنجوش، بیشترین میزان فعالیت و سپس روند کاهشی بر فعالیت این آنزیم وجود دارد. به­طوری­که افزایش فعالیت آنزیم مذکور در مرزنجوش مدیترانه­ای تیمارشده با 60 میلی­گرم نانوذرات نسبت به گیاه شاهد 4/4 برابر و نسبت به مرزنجوش اروپایی در همان تیمار، 7/2 برابر بود (شکل 3- B). ارزیابی فعالیت آنزیم آسکوربات­پراکسیداز نشان داد که بالاترین میزان فعالیت آنزیم در مرزنجوش مدیترانه­ای (در شرایط تیمار با 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات) 13 برابر شاهد است؛ ولیکن این افزایش فعالیت در مرزنجوش اروپایی مربوط به تیمار 10 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات و تنها 36/1 برابر شرایط شاهد است (شکل3- C). تاثیر مثبت تیمار نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر فعالیت آنزیم پلی­فنل اکسیداز مرزنجوش مدیترانه­ای شاخص­تر از مرزنجوش اروپایی بود؛ به­نحوی­که بیشترین فعالیت آنزیم مذکور در تیمار 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات بر مرزنجوش مدیترانه‫ای و در تیمار 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات بر مرزنجوش اروپایی مشاهده شد (شکل3- D). با بررسی نتایج داده­ها، هر چند تفاوت معنی­داری در میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در تیمارهای نانوذرات بر مرزنجوش مدیترانه­ای مشاهده نشد؛ اما بین اثر تیمارها بر فعالیت آنزیم کاتالاز مرزنجوش اروپایی تفاوت معنی­داری وجود داشت و با افزایش غلظت نانوذرات ، میزان فعالیت آنزیم با کاهش شدیدی مواجه شد؛ و کمترین فعالیت آنزیم در تیمار 120 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات (6/3 برابر کاهش نسبت به شاهد) بود (شکل 3-E). بیشترین میزان فعالیت آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون اس-ترانسفراز هر دو گونه مرزنجوش در تیمار 60 میلی­گرم در­لیتر نانوذرات مشاهده شد و بعد از آن فعالیت آنزیم­ها کاهش یافتند. شایان ذکر است که میزان فعالیت سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون اس-ترانسفراز مرزنجوش مدیترانه­ای نسبت به مرزنجوش اروپایی و در تیمار با 60 میلی­گرم در­لیتر به‫ترتیب 82/1 و 8/1 برابر بیشتر بود (شکل 3-F  وG).

شکل 3: تاثیر تیمار با غلظت‌­های مختلف نانوذرات دی­اکسید تیتانیوم بر میزان پروتئین­ محلول کل (A) و فعالیت ویژه آنزیم­های آنتی­اکسیدانت پراکسیداز (B)، آسکوربات­پراکسیداز (C)، پلی­فنل­اکسیداز (D)، کاتالاز (E)، سوپراکسیددیسموتاز (F) و گلوتاتیون اس­-ترانسفراز (G) دو گونه مرزنجوش. مقادیر میانگین سه تکرار ± SE است. حروف یکسان بیانگر عدم اختلاف معنی­دار بر مبنای آزمون دانکن در سطح 05/0 ≥p  است.

آنچه درنتایج پیش­رو قابل­توجه است، تاکید بر بیشترین تاثیر مثبت از سوی غلظت 60 میلی­گرم درلیتر نانوذرات بر مقدار پروتئین­کل، فعالیت پراکسیداز، آسکوربات­پراکسیداز، پلی­فنل­اکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون اس-ترانسفراز مرزنجوش مدیترانه­ای بود؛ در­حالی­که برای تغییرات صفات بیوشیمیایی ارزیابی شده مرزنجوش اروپایی نمی­توان به غلظت موثر مشترک دست یافت. بررسی پژوهش­های مشابه نشان داد که با تیمار غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم بر بادرنجبویه، بیشترین میزان فعالیت آنزیم­های گایاکول­پراکسیداز و آسکوربات­پراکسیداز در شرایط تیمار 100 میلی­گرم درلیتر و برای آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز در تیمار 200 میلی­گرم درلیتر نانوذرات مشاهده شد (34). با این حال، روند افزایشی فعالیت آنزیم­های پراکسیداز، آسکوربات­پراکسیداز، سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز گیاه آروندیناریا هم­راستا با افزایش غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم گزارش شد (44). غلظت نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم (01/0 الی 05/0 درصد) تیمارشده بر گیاه لوبیا سبز، هر چند فعالیت آنزیم­های پراکسیداز و کاتالاز را افزایش داد ولیکن فعالیت سوپراکسیددیسموتاز تا غلظت 03/0 درصد افزایش و بعد از آن کاهش یافت (13). در گزارشات دیگر نیز روند افزایشی-کاهشی برای فعالیت آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز و کاتالاز و روند افزایشی برای پراکسیداز عدسک آبی (Lemna minor L.) تیمار شده با نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم ارائه شد (45). فعالیت آنزیم پلی­فنل­اکسیداز در گیاه هیبرید سینگل کراس 70 ذرت دانه­ای (Corn 704 single cross) تحت تیمار با نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم افزایش و پراکسیداز نیز روند افزایشی-کاهشی داشت (52). هم­چنین(53)، گزارشی مبنی بر افزایش فعالیت آنزیم­های سوپراکسیددیسموتاز و گلوتاتیون اس-ترانسفراز تحت تیمار افزایشی نانوذرات نقره (AgNP) در لوبیا سبز را بیان نمودند.

افزایش میزان پروتئین تحت تیمار با غلظت بهینه نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم در پژوهش حاضر را می­توان به فعال­شدن آنزیم­های درگیر در سنتز پروتئین­ها نسبت داد؛ در حالی­که کاهش مقدار پروتئین در غلظت­های بیشتر نانوذرات می تواند مرتبط به واکنش و تخریب ساختار پروتئین­های درگیر با رادیکال­های آزاد، افزایش فعالیت آنزیم­های تجزیه­کننده پروتئین­ها، کاهش ســـنتز پروتئین­ها و هم­چنین تجمع اسیدهای آمینه آزاد ازجمله پرولین باشد (54). تجمع پرولین در گیاهان تحت تنش، به کاهش آسیب پروتئین­ها می­انجامد (55). بنابراین میزان بالای پروتئین در مرزنجوش مدیترانه­ای را می­توان به بالابودن مقدار پرولین در مقام مقایسه با گونه اروپایی نسبت داد. افزایش عملکرد آنتی­اکسیدانی که از مهم­ترین سازوکارهای دفاعی گیاهان دربرابر انواع تنش­ها می­باشد. آنزیم سوپراکسیددیسموتاز به عنوان یکی از عوامل اصلی درمقابل تنش اکسیداتیو،از یک سو با تبدیل آنیون سوپراکسید به پراکسید­هیدروژن، موجب حذف این آنیون شده واز سوی دیگر باتحریک آنزیم­های پراکسیداز،کاتالاز وآسکوربات پراکسیداز، سمیت H₂O₂ را کاهش می­دهد (56). در این پژوهش افزایش فعالیت پراکسیدازها من­جمله آسکوربات­پراکسیداز که در جاروب­کردن H₂O₂ نقش موثری دارند منطقی است. با توجه به افزایش قابل­توجه فعالیت آسکوربات­پراکسیداز در مرزنجوش مدیترانه­ای، شاید بتواندکم بودن سطح فعالیت آنزیم کاتالاز در حذف H₂O₂را جبران نماید. پژوهش­هانشان داده است که فعالیت آنزیم پلی­فنل اکسیداز نیز درعملکرد دفاعی گیاهان در برابر انواع تنش­ها افزایش می­یابد(57).H₂O₂ فعال­کننده قوی آنزیم گلوتاتیون اس-­ترانسفراز در برابر تنش­های فلزات، شوری و اسمزی است. مطالعات زیادی نقش این آنزیم در جاروب­کردن ROS و سمیت­زدایی H₂O₂ را تایید کرده­اند (58). هر چند فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان، اغلب در زمانی که سلول با سطح تنش مواجه می­شود طبیعی است (45) اما در غلظت­های بالای نانوذرات که در سلول H₂O₂ و سایر گونه­های ROS افزایش می­یابد،این فعالیت­ها احتمالابه دلیل غیرفعال­شدن آنزیم­ها، کاهش سنتز آنزیم­ها، فعال­شدن پروتئازهای پراکسیزومی و یا تغییر در ساختارآنزیم­ها توسطROS، کاهش می­یابد (59). هم­چنین تغییرات در فعالیت آنزیم­های آنتی­اکسیدان به غلظت و مدت زمان تیمار، گونه و سن گیاه وابسته است. البته این احتمال که نانوذرات به طور مستقیم با ازبین­بردن ROS و رادیکال­های آزاد، از افزایش فعالیت آنزیم جلوگیری کنند، نیز وجود دارد (39).

5- نتیجه گیری

مجموع نتایج پژوهش حاضرتاکید می­کند که تیمار با مقادیر بهینه نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم (60 میلی­گرم درلیتر)، سبب بهبود خصوصیات فیزیولوژیکی ازجمله افزایش رنگیزه های فتوسنتزی و به دنبال آن، سرعت فتوسنتز و در نهایت افزایش زیتوده گیاه دارویی مرزنجوش می­گردد. با این وجود، غلظت­های بیشتر از حد بهینه نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوممی­تواند منجر به فوران سطح ROSو در نتیجه تشدید تنش اکسیداتیو گردد که پیامد آن، کاهش عملکردگیاه است. بنابراین تعیین میزان بهینه این نوع تیمار الیسیتوری ازاهمیت بسزایی برخوردار است. قابل­تامل است که گونه مرزنجوش مدیترانه­ای به دلیل دارابودن سیستم آنزیمی قدرتمند و فعالیت بیشتر آنزیم­های آنتی­اکسیدان به طور خاص، به­عنوان گونه موفق تحت تیمار با نانوذرات دی­اکسیدتیتانیوم در این پژوهش معرفی می­گردد.

6- تشکر و قدردانی

نویسندگان این مقاله از معاونت پژوهشی دانشگاه فردوسی مشهد به جهت تامین هزینه­های این پژوهش (با کد طرح 53634/3) تشکر و قدردانی می­نمایند.