• مقدمه

    آویشن (Thymus vulgaris) به‫عنوان یکی از گونه­های مهم تیره نعناعیان، در نواحی مختلف آسیا و مدیترانه می‌روید و در مناطق مختلف جهان منجمله ایران کشت­وکار می‌شود. این گیاه دارویی حاوی 8/0 تا 6/2 درصد اسانس می­باشد که بخش بیشتر آن ‌را الکل‌ها، هیدروکربن‌ها و فنل‌ها تشکیل می‌دهند (1). اسانس آویشن در صنایع بهداشتی، آرایشی و دارویی و برگ‫های آن در فرآورده‌های غذایی مورد استفاده قرار می­گیرد. روغن این گیاه دارای خواصی نظیر تاخیردهنده پیری، نگه‫دارنده طبیعی غذا، آنتی‌اکسیدانت، خلط‌آور، ضدرماتیسم، ضدکرم، ضدعفونی­کننده، ضدباکتریایی، ضدقارچی، بادشکن و ضداسپاسم است (2). براساس پژوهش­های درون­پیکری و درون­شیشه­ای، این ویژگی­های درمانی به‫حضور برخی از ترکیبات فعال نظیر تیمول و کارواکرول نسبت داده می­شوند (1). با توجه به این موضوع، تحقیقات روز افزونی به‫سوی درک جنبه­های مولکولی تنظیم و بیوسنتز ایندول آلکالوئیدهای تیمول و کارواکرول متمایل شده­اند به‫طوری‫که طیف متنوعی از موضوعات، از شناسایی مسیر بیوسنتز و عوامل تنظیمی آن تا تعیین مکانیزم­های اثرگذاری درمانی، را در بر می­گیرند (2).

سنتز تیمول و کارواکرول نیازمند هفت واکنش آنزیمی مرتبط با هم است (شکل1). نخست، پیش­ماده ترپنوئیدها یعنی       دی‫ اکسی زایلوز 5-­فسفات (DXP) از طریق ترکیب پیروات و دی­گلسیر آلدهید 3-­فسفات با یکدیگر و پس از پشت­سرگذاری واکنش­های بیوشیمایی لازم تولید می­شود. ترکیب حد واسط بعدی یعنی 2 سی متیل اریتریتول 4-فسفات (MEP) توسط آنزیم 1 دی­اکسی زایلوز 5-فسفات ردکتوایزومراز (DXR) از سوبسترای DXP به‫وجود می­آید. در ادامه، ژرانیل 2-فسفات (GP) بعد از پشت­سرگذاری واکنش­های بیوشیمایی از MEP حاصل می­شود. گاماترپینن نیز توسط گاماترپینن سنتاز (GST) از ترکیب GP تولید می­شود. اکنون، تیمول و کارواکرول به‫کمک سیتوکروم­های P450 (CYP180 و CYP178) از پیش­ماده گاماترپینن ایجاد می­شوند (3).

شکل1: مسیر بیوسنتز تیمول و کارواکرول (3).

کاربرد الیسیتورها یکی از رویکردهای مهم بیوتکنولوژیست­ها جهت القای تولید متابولیت­های ثانویه و افزایش بازدهی این ترکیبات فعال و با ارزش تجاری می­باشد. الیسیتورها بر حسب ماهیت به دو دسته زیستی (اسیدهای چرب نام، گلیکوپروتئین‫ها، الیگوساکاریدها، ترکیبات پلی ساکاریدی دیواره سلولی و عصاره مخمر) و غیرزیستی (ترکیبات شیمیایی، پرتوهای فرابنفش و فلزات سنگین) تقسیم می­شوند (4). الیسیتورها از طریق فعال­سازی سازوکارهای دفاعی منجر به القای تولید ترکیبات فعال­زیستی و اعمال پاسخ­های دفاعی سلول­های گیاهی مثل سنتز فیتوالکسین­ها، تغییرات ساختاری در دیواره سلولی، بیان ژن­های دفاعی، تولید گونه­های فعال اکسیژن، افزایش جریانات یونی از غشای پلاسمایی و سنتز اسیدسالیسیک و اسید جاسمونیک به‏عنوان پیک­های ثانویه می‏‏شوند (5). الیسیتورها همچنین باعث افزایش طول و وزن ساقه و ریشه و متعاقبا رشد گیاه می­شوند (5). درنتیجه، تشخیص مولکولی الیسیتورها و برهمکنش آن‫ها با گیرنده‎های گیاه تا مکانیزم تاثیرگذاری آن‫ها بر مسیرهای بیوسنتزی و تجزیه­ای متابولیت­های ثانویه ازجمله زمینه­های تحقیقاتی جذاب در حوزه الیسیتورها و کشت ‫بافت گیاهی است (6).

اسیدجاسمونیک و مشتقات آن از جمله متیل­جاسمونات، به‫عنوان الیسیتور و تنظیم­کننده رشد گیاهی شناخته می­شوند که در نقش پیام‌رسان طی پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی ایفای نقش می‌کنند (7). تاثیر اسید جاسمونیک بر فرایندهای فیزیولوژیکی گیاهان وابسته به‫نوع مشتقات جاسمونات و غلظت ‌به‌کاررفته، گونه گیاهی و مرحله نموی می­باشد (8). تاکنون، مطالعات محدودی در حیطه محلول‌پاشی اسیدجاسمونیک و ردیابی اثرات آن بر ویژگی­های کیفی و کمی گیاهان دارویی صورت گرفته است (9). در یک مطالعه، Yang و همکاران (10) نشان دادند که کاربرد متیل­جاسمونات سبب افزایش تانشینون در گیاه داروییSalvia miltiorrhiza می‌شود. Chen و همکاران (11) نیز نشان دادند که اشعه UV-A به طور قابل ملاحظه­ای تجمع متابولیت­های ثانویه را افزایش می­دهد به‫طوری‫که محتوای آنتوسیانین و اسکوربیک اسید به‫ترتیب تا 40 و 80 درصد افزایش یافت (11). نویسندگان افزایش تولید این ترکیبات را به تحریک مسیرهای پیام­رسانی وابسته به رادیکال­های آزاد نسبت دادند. Mumivand  و همکاران (12) نیز مشاهده کردند که تیمار UV-A سبب افزایش محتوی لینالول در گیاه آویشن می­شود به‫طوری که مقدار این متابولیت تا 50 درصد افزایش یافت. علاوه بر ترکیبات شیمیایی نظیر اسید جاسمونیک، پژوهش­های سال­های گذشته گویای نقش اشعه UV-A در تنظیم ترکیب و نوع متابولیت­های متابولوم گیاهان است به‫طوری‫که محققان متوجه شده­اند که از 300 گونه گیاهی مورد مطالعه، حدود 50 درصد حساس، حدود 30 درصد حساسیت متوسط و مابقی غیرحساس به تابش UV-A هستند (13). در آزمایشی دیگر، Victório و همکاران (14) نشان دادند که کاربرد UV-A سبب افزایش ژرانین و الاژیک اسید در گیاه دارویی Phyllanthus tenellus می‌شود. Kim و همکاران (15) نیز نشان دادند استفاده از تیمار UV-A منجر به افزایش سطح متابولیت ثانویه رزماریک اسید در گیاه دارویی ریحان می­شود. نویسندگان پیشنهاد کردند که تابش UV-A با فعال‫سازی گیرنده غشائی اختصاصی و سپس به راه­انداختن آبشار پیام­رسانی وابسته به رادیکال­های آزاد منجر به افزایش سطح رزماریک اسید تا 2 برابر می­شوند. اگرچه اثرات اسید جاسمونیک و اشعه فرابنفش به‫طور مجزا بر تجمع ترکیبات فعال زیستی در گیاهان داروئی مورد ارزیابی قرار گرفته است (10،13 و 14)، با این‫حال پاسخ هم­ افزائی گیاهان به حضور هر دو این الیسیتورها هنوز مورد مطالعه قرار نگرفته ­است. 

بنابر آنچه گفته شد، اهمیت متابولیت­های تیمول و کارواکرول در گیاهان دارویی نظیر آویشن و نقش ژن‌های کلیدی DXR، GTS، CYP178 و CYP180 در تولید این دو ترکیب باارزش از یک سو، و پتانسیل متیل­جاسمونات و UV-A در القای تولید متابولیت­های ثانویه از سوی دیگر، ما را به این مطالعه رهنمود کرد که اثر هم­افزائی اشعه فرابنفش UV-A و متیل‌جاسمونات بر بیسونتز تیمول و کارواکرول را مورد ارزیابی قرار دهیم.

2-مواد و روش­ها

مواد گیاهی و تیمار آزمایشی: بذرهای آویشن تهیه­شده از مرکز ملی ذخایر ژنتیکی ایران تحت شرایط گلخانه­ای با رطوبت نسبی 60 درصد، فتوپریود 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی، دمای 25 درجه­سانتی­گراد روز، دمای 20 درجه­سانتی­گراد روز در گلدان­های پلاستیکی حاوی خاک­برگ، خاک، ماسه با نسبت 1:2:3 در قالب آزمایش فاکتوریل دوعاملی در زمان با سه تکرار کاشته شدند. در مرحله پنج­برگی، متیل‌جاسمونات با غلظت 1/0 میلی‌مولار بر روی برگ­های‌ آویشن محلول­پاشی شد (10). همزمان با تیمار متیل‌جاسمونات، اشعه فرابنفش از طریق در معرض قراردادن گیاهیچه­ها با لامپ­های UV-A (365 نانومتر) به‫مدت 20 دقیقه اعمال شد (14). جهت اطمینان از صحت تیمار اشعه، لامپ­های UV-A (365 نانومتر) 40 واتی در جعبه­های شیشه­ای در فاصله 30 سانتی­متری از گیاهچه­ها قرار گرفتند تا تعادل مابین پوشش گیاه‫چه و آسیب پرتوی رعایت شود. ضمنا، از برگ­های بالایی گیاه‫چه­ها برای نمونه­برداری استفاده شد تا از تیمار برگ با اشعه UV-A اطمینان حاصل شود. نمونه‌گیری در 24 و 48 ساعت بعد از اعمال تیمار انجام گرفت. گیاهان شاهد با تابش نور معمولی تحت تیمار و با آب مقطر استریل تحت محلول­پاشی قرار گفتند. نمونه‌های گیاهی از برگ جوان کاملا توسعه­یافته در دمای80– درجه سانتی‏گراد در فریزر نگه‏داری شدند تا متعاقبا اندازه­گیری­های بیان ژن بر روی آن‫ها انجام شود.

استخراج DNA و سنتز cDNA:  با استفاده از روش ترایزول، محتوی  RNAاز نمونه­های برگی آویشن استخراج شد (16). جهت نیل به این هدف، 1 میلی‌لیتر ترایزول به ازای 1/0 گرم بافت برگی استفاده شد. به منظور دسترسی به‏ RNA خالص و عاری از DNA، نمونه‏های RNA با آنزیم DNase1 تیمار شدند تا مولکول­های تجزیه DNA شوند. غلظت RNA به دست­آمده توسط دستگاه نانودراپ در طول موج‏های 280 و 260 نانومتر و کیفیت آن نیز به‫کمک ژل آگارز 2/1 درصد تعیین شد. از کیت سنتز cDNA (سیناژن) مطابق دستورالعمل شرکت در راستای سنتز DNA مکمل (cDNA) استفاده شد.

طراحی آغازگرها و Real-Time PCR: از اطلاعات ژنی NCBI و نرم‌افزار Primer3 برای طراحی آغازگرهای مربوط به ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 استفاده شد (جدول 1). سه نمونه RNA از هر تکرار بیولوژیکی باهم ادغام شدند تا خزانه RT-PCR را تشکیل دهند. برای هر خزانه نیز سه تکرار تکنیکی لحاظ شد و از میانگین آن‫ها برای برآورد فراوانی نسبی رونوشت­ها استفاده شد. واکنش RT-PCR شامل 3 میکرولیتر SYBR Green (5X)، 2 میکرولیتر cDNA (1 μg/μl)، 1 میکرولیتر Primer F (10 pmol/μl)، 1 میکرولیتر Primer R (10 pmol/μl) و 15 میکرولیتر ddH2O بود که بعد از رقیق­سازی به 100 میکرولیتر، از 5 میکرولیتر آن به‫عنوان الگو برای اجرای واکنش استفاده شد. جهت اندازه­گیری بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 از 18s-rRNA به‏عنوان کنترل داخلی یا ژن مرجع استفاده شد.

جدول 1: مشخصات آغازگرهای مورداستفاده جهت بررسی بیان ژن

• آنالیز داده­ها

   مقدار CT هر نمونه برای هر کدام از ژن­ها به‫وسیله نرم­افزار Line Gene K تعیین شد. تغییرات کمی بین نمونه­ها به‫کمک رویکرد کمی‌سازی نسبی DDCT تعیین شد (16). جهت تجزیه آماری داده‌ها بر مبنای آزمایش فاکتوریل دوعاملی در زمان، آنالیز واریانس و مقایسات میانگین بین تیمارها با آزمون دانکن در نرم­افزار SAS انجام شد. از برنامه Excel 2010 نیز به‫منظور ترسیم نمودار­های حاصل از آنالیز بیان ژن‏ها استفاده شد.

اندازه­گیری محتوی تیمول و کارواکرول:  جهت تعیین غلظت تیمول و کارواکرول در برگ­های آویشن، کروماتوگرافی مایع با کار آیی بالا HPLC انجام شد. جهت آماده­سازی برای عصاره­گیری، نخست نمونه­ها در دمای 25 درجه سانتی­گراد و تاریکی خشک شده و سپس 5/0 گرم بافت خشک خردشده با  25 میلی­لیتر اتانول 80 درصد ترکیب شد. بعد از فرایند استخراج در دمای  25 درجه سانتی­گراد به‫مدت  2 ساعت بر روی شیکر، محلول به‫دست­آمده با کاغذ صافی واتمن فیلتر شد. بعد از سانتریفیوژ با دور 400 rpm به‫مدت 5 دقیقه، محلول کاملا شفاف توسط دستگاه تبخیرکننده چرخان خشک شد. از هر نمونه، محلول استوک (1000پی پی ام) توسط حلال متانول تهیه شد که این محلول­ها برای سنجش غلظت تیمول و کارواکرول به‫کار گرفته شدند. در ادامه، 50 میکرولیتر از عصاره به دستگاه  HPLC (مجهز به آشکارساز  UV و ستون C18 با اندازه ذرات 5 میکرومتر، قطر  4 میلی­متر و طول250 میلی­متر) تزریق شد. سنجش کارواکرول و تیمول در طول موج 280 نانومتر صورت گرفت. برای آنالیز کمی ترکیبات، بعد از تزریق محلول­های استاندارد با غلظت­های مشخص و به حصول سطح زیر پیک هر کدام، منحنی کالیبراسیون هر ترکیب رسم شد و توسط معادله خطی منحنی کالیبراسیون، مقدار هر ترکیب در عصاره­های آویشن برآورد شد (10).

3-نتایج

بیان ژن DXR تحت تاثیر اشعه UV- A و هورمون متیل‌جاسمونات

   بیان ژن رمزگردان آنزیم DXR که در تولید متیل اریتریتول 4-فسفات (MEP) از دی­اکسی زایلوز 5-­فسفات (DXP) ایفای نقش می­کند، به‫طور معنی­داری بر اثر تیمار الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و UV-A افزایش یافت (شکل 2). بعد از 24 ساعت، بیان ژن DXR در تیمار متیل‌جاسمونات، UV-A و تیمار ترکیبی آن‫ها به‫ترتیب 2/2، 1/2 و 8/2 برابر نسبت به کنترل افزایش یافت. اما بیان این ژن بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار متیل‌جاسمونات، UV- A و تیمار ترکیبی آن‫ها به ترتیب 32، 48 و 39 درصد نسبت به روز قبل کاهش یافت.

شکل 2: بیان ژن DXR پس از اعمال اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

بیان ژن GTS تحت تاثیر اشعه UV- A و هورمون متیل‌جاسمونات

   بیان ژن گاماترپینن سنتاز (GST) که تولید گاماترپینن از ژرانیل 2-فسفات (GP) را کاتالیز می­کند، به‫طور معنی­داری بر اثر تیمار الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و تابشه اشعه UV-A افزایش یافت (شکل 3). در 24 ساعت پس از شروع تیمار، بیان این ژن توسط متیل‌جاسمونات و UV- A به‫ترتیب 6/2 و 9/2 برابر نسبت به کنترل افزایش یافت. با اینحال، بعد از گذشت 48 ساعت، بیان ژن GST توسط متیل‌جاسمونات و UV-A به ترتیب 34 و 45 درصد نسبت به روز قبل کاهش یافت. تیمار ترکیبی باعث افزایش بیان GST شد؛ با این‫حال، اختلاف معنی­داری مابین 24 و 48 ساعت پس از اعمال ترکیبی متیل‌جاسمونات و UV-A وجود نداشت.

شکل 3: بیان ژن GST پس از اعمال اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

بیان ژن CYP178 تحت تاثیر اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات

   بر اثر تیمار الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و UV-A، سطح رونوشت ژن CYP178 که واکنش تولید تیمول از گاماترپینن را کاتالیز می­کند، به طور معنی­داری افزایش یافت (شکل 4). بعد از گذشت 24 ساعت، بیان ژن CYP178 در تیمار متیل‌جاسمونات، UV-A و تیمار ترکیبی آن‫ها به‫ترتیب 6/1، 0/2 و 3/2 برابر نسبت به کنترل افزایش یافت. با این‫حال، بیان این ژن بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار متیل‌جاسمونات، UV-A و تیمار ترکیبی آن‫ها به‫ترتیب 33، 40 و 30 درصد نسبت به روز قبل کاهش یافت.

شکل 4: بیان ژن CYP178 پس از اعمال اشعه UV- A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

بیان ژن CYP180 تحت تاثیر اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات

بر اثر تیمار الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و UV-A، سطح رونوشت ژن CYP180 که واکنش تولید کارواکرول از گاماترپینن را کاتالیز می­کند، به‫طور معنی­داری افزایش یافت (شکل 5). بعد از گذشت 24 ساعت، بیان ژن CYP180 در تیمار متیل‌جاسمونات، UV- A  و تیمار ترکیبی آن‫ها به ترتیب 6/1، 0/2 و 3/2 برابر نسبت به کنترل افزایش یافت. با این‫حال، بیان این ژن بعد از گذشت 48 ساعت از تیمار متیل‌جاسمونات، UV- A و تیمار ترکیبی آن‫ها به‫ترتیب 33، 40 و 30 درصد نسبت به روز قبل کاهش یافت.

شکل 5: بیان ژن CYP180 پس از اعمال اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

غلظت ترکیبات تیمول و کارواکرول تحت تاثیر اشعه UV- A و هورمون متیل‌جاسمونات

   نتایج این آزمایش نشان داد که غلظت ترکیبات فنولی تیمول و کارواکرول به‫شدت متاثر از هم­افزائی دو الیسیتور غیزیستی UV-A و متیل‌جاسمونات قرار گرفت به‫گونه­ای که غلظت تیمول و کارواکرول در ترکیب تیماری بعد از گذشت 24 ساعت، به‫ترتیب 7/1 و 05/1 برابر نسبت به شاهد بود و بعد از 48 ساعت با کاهش همراه بود (شکل 6 و 7).

شکل 6: غلظت تیمول پس از اعمال اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

شکل 7: غلظت کارواکرول پس از اعمال اشعه UV-A و هورمون متیل‌جاسمونات. حروف یکسان گویای عدم تفاوت معنی‌دار در سطح احتمال 5 درصد با آزمون دانکن است.

همبستگی غلظت متابولیت­ها و بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول

   نتایج این آزمایش نشان داد که همبستگی معنی­داری مابین غلظت متابولیت­ها و بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول وجود دارد به‫طوری‫که بیان ژن­هایDXR  و GTS دارای رابطه مثبت و معنی­داری با غلظت تیمول و کارواکرول بودند. درحالی‫که، بیان ژنCYP178  فقط با غلظت تیمول رابطه مثبت معنی­داری داشت. به‫طور مشابهی، بیان ژنCYP180  فقط با غلظت کارواکرول رابطه مثبت معنی­داری داشت و با غلظت تیمول رابطه معنی­داری نشان نداد (جدول 2).

جدول 2: همبستگی غلظت متابولیت­ها و بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول

4-بحث

    تاکنون، تکنیک­های مختلفی به‫منظور افزایش تولید ترکیبات فعال و متابولیت­های ثانویه گیاهان دارویی اتخاذ شده است که در این میان، استفاده از الیسیتورهای زیستی و غیرزیستی به خاطر تنوع و سهولت به‫طور چشمگیری در کشت­ بافت و حتی در گلخانه و مزرعه مورد توجه قرار گرفته­اند (17). هرچند گزارشاتی در خصوص کاربرد جداگانه متیل‌جاسمونات و UV-A به‫منظور القای بیوسنتز ترکیباتی همچون ترپنوئیدها در گیاهان مختلف منتشر شده است (18، 19)، با این‫حال اثر هم­افزائی آن‫ها بر مسیرهای بیوسنتزی هنوز ناشناخته مانده است.

متیل‌جاسمونات‏ از کارآمدترین الیسیتور‏های شیمیایی به شمار می­رود که با مسیر پیام‏رسانی اختصاصی خود منجر به افزایش فعالیت آنزیم فنیل‏آلانین‏آمونیالیاز و متعاقبا القای مسیر فنیل‏پروپانوئیدی می‌شود که پیامد آن، افزایش محتوای متابولیت­های فنلی می­باشد (16 و 20). یک روز بعد از تیمار، بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 افزایش معنی­داری داشت و با گذشت زمان، روند کاهشی در پیش گرفت. با توجه به رابطه مستقیم بین بیان ژن‌های کلیدی یادشده و فرآورده­های حاصل از آن‫ها یعنی تیمول و کارواکرول، به‏نظر می‏رسد که زمان ایده­آل تیمار متیل‌جاسمونات جهت افزایش تولید این دو ترکیب، 24 ساعت بعد از اعمال تیمار متیل‌جاسمونات ‌باشد. همراستا با یافته­های ما، Ruiz-May و همکاران (21) نشان دادند که تیمار متیل‌جاسمونات در گیاه دارویی Catharanthus roseus سبب افزایش چشمگیر آلکالوئیدهای ایندول­ترپن می­شود (21). در پژوهشی دیگر، Gadzovska و همکاران (22) با به‫کارگیری متیل‌جاسمونات بر روی گیاه داروییHypericum perforatum نشان دادند که آلکالوئیدها و فنیل پروپانوئیدها به‫طور قابل­توجهی پس از اعمال تیمار در مقایسه با گیاهان شاهد افزایش پیدا کردند. با مقایسه مشاهدات ما با سایر محققان (23-30)، می­توان پیشنهاد کرد که تیمار متیل­جاسمونات سبب افزایش بیان ژن‏های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول خواهد شد که این امر به نوبه خود راه را برای افزایش تولید تیمول و کارواکرول فراهم می­کند. به‫نظر می­رسد که متیل‌جاسمونات با اتصال به پروتئین­های گیرنده واقع بر روی غشا و متعاقبا القای آبشار پیام‫رسانی وابسته به گونه­های فعال اکسیژن سبب فعالسازی فاکتورهای رونویسی می­شود که مسئولیت بیان ژن­های درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول را برعهده دارند (15).

 امواج نوری نظیر فرابنفش به‫طریق مختلف بر فرایندهای فیزیولوژیکی و بیوشیمیایی تاثیر می­گذارند. یکی از ساز وکارهای درگیر در تاثیر تابش فرابنفش بر متابولوم گیاهان، متاثرسازی نسبت­های هورمونی است. برای مثال، اکسین یکی از هورمون­های هدف اشعه فرابنفش است که که بر اثر تابش طولانی تخریب می­شود و بدین­ترتیب نسبت اکسین به سیتوکنین و متعاقبا برخی از ویژگی­های رشدی گیاه دچار تغییر می­شود (13). یکی دیگر از ساز وکارهای عمل فرابنفش، مشابهت رفتاری با نور آبی است. از آنجایی‫که گیرنده­های نور آبی و فرابنفش یکسان است، لذا فرابنفش در طول­موج نزدیک به آبی شبیه به آن عمل می­کند و بدین­ترتیب سبب افت رشد گیاه و افزایش متابولیت­های آن می­شود (14). به‫عنوان ساز وکار بعدی، حساسیت برخی آنزیم­ها (همچون انواع درگیر در تولید آنتوسیانین­ها) به فرابنفش را می­توان نام برد که به‫شدت و زمان اشعه فرابنفش پاسخ می­دهند و از این طریق بر سطح متابولیت­های گیاهان اثر می­گذارند (20). در تحقیق اخیر، اثر اشعه UV-A بر بیان ژن­های DXR، GTS، CYP178 و CYP180 مورد بررسی قرار گرفت و نتایج حاکی از این بود که سطح رونوشت آن‫ها به‫طور معنی­داری تحت تاثیر اشعه قرار گرفت. در توافق با یافته­های ما، Victório و همکاران (14) نشان دادند که کاربرد UV-A سبب افزایش ژرانین و الاژیک اسید در گیاه داروییPhyllanthus tenellus می‌شود (14). در تحقیق دیگر، Rai و همکاران (20) نشان دادند که استفاده از UV-A منجر به افزایش آرتیمیزین در گیاه آرتمیزیا می­شود. روی هم­رفته، مشاهدات ما در کنار گزارشات قبلی حاکی از نقش بالقوه اشعه UV-A در افزایش تولید تیمول و کارواکرول می­باشد. به‫نظر می­رسد که تابش اشعه UV-A سبب فعالسازی مسیرهای پیام­رسانی القا شونده باUV  می­شود که به‫نوبه خود فاکتورهای رونویسی دخیل در بیان ژن­های بیوسنتز تیمول و کارواکرول را فعال می­کنند (30، 31). البته هنوز مکانیزم­های دقیق درگیر در افزایش بیوسنتز متابولیت­های ثانویه با تابش UV-A معلوم نشده است.

 تاثیر هم­افزائی متیل‌جاسمونات و UV-A در افزایش سطح دو ترکیب فنلی مهم یعنی تیمول و کارواکرول گویای پتانسیل بالای مسیر پیام­رسانی متیل‌جاسمونات و مسیر پاسخ به آسیب­های ناشی از UV-A در القا و تولید متابولیت­هایی ثانویه­ای است که از گیاه به هنگام شرایط نامطلوب محیطی حفاظت به‫عمل می­آورند (10، 14). بنابراین از این پتانسیل می­توان به‫منظور افزایش بازدهی تولید ترکیبات فعال در گیاهان دارویی بهره برد.

در رابطه با مکانیزم­های پشت­پرده این تاثیرگذاری الیسیتورها بر محتوی ترکیبات فنولی می­توان گفت که الیسیتورها سبب بروز آرایه­ایی از واکنش­های دفاعی نظیر تجمع مجموعه­ای متنوعی از متابولیت­های ثانویه دفاعی در گیاه می‏شوند. هرچند مکانیسم دقیق این تاثیرگذاری به‫خوبی شناخته نشده است، بااین‫حال پیشنهاد شده است که مکانسیم­هایی مختلفی در این پدیده دخالت دارند. برخی محققان اعتقاد دارند که نخست الیسیتورهایی مثل جاسمونات به گیرنده­های غشای پلاسمایی متصل می‫شوند و سپس آبشارهای پیام‫رسانی­ را فعال می­کنند. در واقع، تحریک سلول با الیسیتور، شامل اتصال الیسیتور به گیرنده‫های غشای پلاسمایی، اسیدی­شدن محیط سیتوزول، تولید گونه­های فعال اکسیژن و درنهایت فعال‫سازی بیان ژن­های درگیر در فرآیندهای پاسخ دفاعی نظیر سنتز متابولیت­های ثانویه است (22-31).

5-نتیجه­گیری

    الیسیتورها به‫عنوان یکی از دستاوردهای مهم بیوتکنولوژیست­ها از پتانسیل قابل توجهی در القا  و تولید ترکیبات زیستی برخودار هستند. جدا از این اثرگذاری مثبت، تاثیر هم­افزائی آن‫ها می­تواند گویای ظرفیت بالای گیاهان در پاسخ به این الیسیتورها باشد. در راستای پاسخ به این سوال، مطالعه اخیر نشان داد که بیان ژن­های کلیدی درگیر در بیوسنتز تیمول و کارواکرول یعنی DXR، GTS، CYP178 و CYP180 به‫طور چشمگیری در تیمار ترکیبی نسبت به تیمارهای جداگانه افزایش یافت. از آنجایی‫که محتوی تیمول و کارواکرول مستقیما تحت تاثیر بیان این ژن‏ها قرار دارد، لذا استفاده از الیسیتورهای متیل‌جاسمونات و UV-C می­تواند راه‫کاری مناسب و ساده در تولید این ترکیبات بارزش تلقی شود.

6- تشکر و قدردانی

   کمال سپاسگزاری را از همکارانی داریم که ما را در اجرای این مطالعه مساعدت نمودند.