• مقدمه

   ناباروری یکی از مهم‫ترین مشکلات بهداشت جهانی است که حدود بیست درصد از زوج‫های جوان را در سراسر جهان تحت تاثیر قرار داده است و علاوه بر پیشرفت چشمگیر روش‫های درمانی و بهبود در بخش سلامت تولید مثل میزان ناباروری در طی دو دهه گذشته همچنان رو به افزایش است (1). از مهم‫ترین عوامل موثر بر ناباروری می‫تواند به  محیط زیست، استرس، سبک زندگی، عوامل هورمونی و فاکتورهای پاتوفیزیولوژیک اشاره کرد (2). افزایش استرس باعث تولید گونه‫های اکسیژن فعال (ROS) در سطح تخمدان‫ها می‫شود که خود یکی از عوامل حذف سلول‫های زایا از طریق القای آپوپتوزیس است (3و 4). تعداد زیادی از سلول‫های زایشی قبل از بلوغ از تخمدان حذف می‫شوند و در دوران بلوغ کمتر از 1 درصد از سلول‫های زایشی در تخمدان‫هایی که برای کل طول عمر تولید مثلی فرد لازم هستند باقی می‫ماند (5). آپوپتوزیس یا مرگ سلولی برنامه ریزی شده فرایندی برای حذف سلول‫های پیر و آسیب دیده از بافت‫ها است و در حیات فولیکول‫ها و تخمک‫های نارس نقش عمده‫ای دارد، اکثر سلول‫های زایشی معیوب و همچنین سلول‫های اضافی از طریق آپوپتوزیس از تخمدان‫ها حذف می‫شوند (6). افزایش سطح هورمون استرس و ROS ها نه تنها در سلول‫های گرانولوزا  بلکه در تخمک‫های فولیکولی نیز باعث بروز آپوپتوزیس می‫شود. آپوپتوزیس نقش عمده ای در تعیین کیفیت تخمک‫های فولیکولی بازی می‫کند و به‫طور مستقیم بر تولید مثل تاثیر می‫گذارد و تحریک آپوپتوزیس می‫تواند یکی از عوامل داخل سلولی حذف تخمک‫ها و  ایجاد ناباروری باشد (7).

   آتورواستاتین یکی از داروهای گروه استاتین‫ها است که به‫طور رایج برای کاهش کلسترول خون استفاده می‫شود، استاتین‫ها از طریق فعال کردن مسیر پروتئین NADPH  و  مهار هیدروکسی متیل گلوتاریل کوآنزیم A ردوکتاز (HMG-CoA) سطح سرمی کلسترول را کاهش می‫دهند (8). بر اساس گزارش‫های منتشر شده مصرف دوزهای پایین آتورواستاتین برای طولانی مدت بدون عوارض بوده و خطرات و آسیب‫های قلبی عروقی ناشی از هیپرکلسترمی را در بیمار کاهش می‫دهد و اثرات محافظتی بر روی سلول‫های جنسی دارد (9و10) به‫نظر می‫رسد بیشتر این اثرات به‫خاطر خاصیت مهارکنندگی ROS ها باشد، ولی مصرف دوزهای بالاتر می‫تواند با عوارضی از جمله عوارض قلبی برای فرد همراه باشد (11). علاوه بر کاهش میزان کلسترول اثرات متنوع دیگری از جمله اثرات ضد التهابی، آنتی اکسیدانتی و اثرات آنتی آپوپتوزی نیز برای آتورواستاتین گزارش شده است (12). با توجه به عملکرد آنتی اکسیدانتی آتورواستاتین و پتانسیل‫های مختلف آن و از طرفی روشن نبودن تاثیرات دقیق دوزهای مختلف آن بر عملکرد سلول‫های جنسی در این مطالعه ما تصمیم به بررسی تاثیر دوز mg/kg 2  آتورواستاتین بر میزان آپوپتوزیس تخمک‫های موش در محیط آزمایشگاهی گرفته شد.

• مواد و روش‌ها

جمع آوری و کشت تخمک: در این مطالعه مورد شاهدی از 200 تخمک استفاده شد که از 40  سر موش ماده نژاد ویستار، با سن 4 تا 5 هفته‫ای تهیه شدند، برای تهیه تخمک‫ها 24 ساعت بعد از تزریق PMSG موش‫ها با کشش گردنی معدوم شدند، تخمدان‫ها برداشته شدند در مرحله بعد تخمک‫های GV به‫دست آمده از تخمدان موش در دیش محیط کشت حاوی 10 میکرومول آتورواستاتین قرار داده شدند و نهایتا به انکوباتور 37 درجه سانتی‫گراد و CO₂، 5 درصد منتقل شدند.200 تخمک پس از استخراج و قرار گرفتن در محیط کشت 50 میکرو لیتری به‫دو گروه مساوی زیر تقسیم شدند، گروه کنترل: محیط کشت+ فاکتور رشد. گروه آتورواستاتین: محیط کشت + فاکتور رشد + 2 میکرو مولار آتورواستاتین.  تخمک‌ها در هر گروه 24 ساعت داخل انکوباتور قرار گرفتند.

بررسی میزان آپوپتوزیس: برای بررسی آپوپتوزیس با استفاده از میکروسکوپ اینورت (XDS-2ITALY) تخمک‌هایی که میوز اول را طی کرده و دارای جسم قطبی اول و بالغ شده بودند شمارش و عکس‌برداری شدند، در مرحله بعد میزان آپوپتوزیس تخمک‫ها با استفاده از رنگ آمیزی تانل در دو گروه کنترل و گروه آتورواستاتین بررسی شدند (شکل 1و 2)، جهت انجام آزمایش تانل از کیت تشخیص تانلIn situ cell death detection kit(Germany, Roche)  استفاده شد، برای این منظور پس از شستشو نمونه‫ها با PBS نمونه‫ها با سوبسترای DAB انکوبه شدند و جهت رنگ آمیزی نهائی از تولوئیدن بلو استفاده شد. در نهایت لام‫ها با میکروسکوپ نوری جهت تشخیص سلول‫های آپوپتوتیک تغییر رنگ یافته مورد بررسی قرار گرفتند. 

شکل 1: رنگ آمیزی تانل در تخمک‫های کشت داده شده با آتورواستاتین (بزرگنمائی برابر با  x300).A : رنگ آمیزی تانل برای نشان دادن شکست DNA ، B: رنگ آمیزی PI برای رنگ زمینه اووسیت، C: تصویر تلفیقی A و B، که DNA شکسته شده به رنگ سبز مایل به زرد مشاهده می‫شود.

شکل 2: رنگ آمیزی تانل تخمک های گروه کنترل. A: رنگ آمیزی تانل برای نشان دادن شکست DNA ، B: رنگ آمیزی PI برای رنگ زمینه اووسیت، C: تصویر تلفیقی A و B، که DNA شکسته شده به رنگ سبز مایل به زرد مشاهده می‫شود (بزرگنمائی برابر با  x300).

3-آنالیز آماری

   به‫منظور آنالیز آماری تصاویر دو گروه با استفاده از نرم‌افزار image j  آنالیز شد و داده‌های دو گروه توسط تست کای دو و نرم افزار spss12  آنالیز آماری شد، داده‫ها حاصل از گروه‫ها توسط آزمون Way- One ANOVA بین گروه‫ها مورد مقایسه قرارگرفت، در تمامی محاسبات 05/0p≤  معنی‫دار در نظر گرفته شد.

• نتایج

میزان آپوپتوزیس تخمک‫ها

  برای بررسی میزان آپوپتوز تخمک‫ها رنگ‫آمیزی تانل بر روی 100 تخمک بالغ از هر گروه انجام شد، تصاویر 1و2 توسط میکروسکوپ فلئورسانس تانل مثبت و منفی را نشان می‫دهد. از بین 100 تخمک گروه کنترل در 22 تخمک آپوپتوزیس مشاهده شد (22 درصد)  از 100 تخمک گروه آتورواستاتین آپوپتوزیس در 24 تخمک مشاهده شد (24 درصد). میزان آپوپتوزیس در گروه کنترل و گروه آتورواستاتین به‫ترتیب برابر 22 و 24 درصد بود که نشان می‫داد آتورواستاتین با غلطت 2 میکروگرم بر کیلوگرم باعث افزایش 2 درصدی میزان آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود که این افزایش در مقایسه با گروه کنترل از لحاظ آماری معنی‫دار نبود (11/0 p =) (شکل 1).

شکل1: نمودار میزان آپوپتوزیس و بلوغ تخمک‫ها در دو گروه کنترل و  آتورواستاتین  24 ساعت پس از کشت آزمایشگاهی

• بحث

در این مطالعه به بررسی تاثیر غلظت mg/kg 2 داروی آتورواستاتین در آپوپتوزیس تخمک‫های موش در محیط آزمایشگاهی پرداخته شد. نتایج این مطالعه نشان داد که آتورواستاتین در غلظت پائین باعث افزایش جزئی آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود. میزان تکوین تخمک‫های نارس در محیط‫های خارج رحم یکی از فاکتورهای کلیدی در میزان موفقیت تکنیک های باروری خارج رحمی (IVF) است، عدم وجود فاکتورهای رشد کافی در طی مراحل رشد و تقسیمات اولیه تخمک و به‫خصوص در مرحله پروفاز1 سبب فعال شدن اولین موج آپوپتوزیس در اووسیت‫ها می‫شود، دومین موج آپوپتوزی وقتی که تخمک‫ها به بلوک دیپلوتن می‫رسند و در هنگام تشکیل اولین جسم قطبی رخ می‫دهد (13-15). آتورواستاتین در غلطت‫های بالای دارای عوارض جانبی برای قلب و کلیه‫ها است ولی در غلظت پایین دارای اثرات آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی برای سلول‫ها است و عوارض جانبی برای آن گزارش نشده است (16-18). Sathyapalan و همکاران (19) گزارش کردند که مصرف آتورواستاتین در بیماران مبتلا به تخمدان پلی کیستیک و هیپراندروژنمی بعد از 12 هفته باعث کاهش التهاب و پارامترهای متابولیک در تخمدان‫ها می‫شود. التهاب یک فرآیند فیزیولوژیکی بسیار مهم در تخمک‫گذاری، قاعدگی و لانه گزینی است و التهاب کنترل نشده اثرات نا‫مطلوبی  بر تولید هورمون های جنسی و تخمک‫گذاری دارد (20). از طرف دیگر، در تخمدان‫ها  افزایش ROS در طی تخمک گذاری و بلوغ تخمک و رشد جنین بسیار مهم است، ROS با پراکسیداسیون لیپیدها و القای آپوپتوزیس باعث عملکرد نامطلوب تخمدان‫ها می‫شود (21-23). Hamzeh و همکاران (24) گزارش کردند که آتورواستاتین در غلظت mg/kg 10 در برابر آسیب تخمدانی ناشی از سیس پلاتین خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد التهابی قوی ایفا می‫کند و باعث کاهش آپوپتوزیس در تخمک‫های موش می‫شود و همچنین گزارش کردند که این اثر می‫تواند از طریق افزایش میزان استروژن و پروژسترون سرمی القا شده توسط آتورواستاتین باشد. ما در مطالعه حاضر در غلظت mg/kg 2  آتورواستاتین شاهد افزایش جزئی در آپوپتوزیس تخمک‫ها بودیم که این یافته‫ها با یافته‫های حمزه  و همکاران (24) هم راستا نبود که به‫نظر می‫رسد دلیل آن استفاده از غلظت پائین‫تر آتورواستاتین در مطالعه ما باشد. در مطالعه‫ای دیگر Doustar و همکاران (25) گزارش کردند که دوز پائین (mg/kg 10) آتورواستاتین باعث کاهش میزان آپوپتوزیس در سلول‫های عضلانی قلب موش می‫شود  که این نتایج با نتایج ما بر روی تخمک‫های نارس هم راستا نبود.  Aprigliano و همکاران (26) بـه اثـرات آتورواسـتاتین در القـای آپوپتوزیس  بر روی سـلول‫هـای میوفیبروبلاست (HSCs) از طریق فعال کردن مسـیر کاسـپاز3 و 9 اشاره کردند. آن‫ها در مطالعه خود برای اولین بار اثرات وابسته به دوز آتورواستاتین را گزارش کردند و با اندازه‫گیری میزان آتورواسـتاتین در سـرم خـون بـه ایـن نتیجـه رسیدند که دوز lit/mol 10-3 بیشترین اثرآپوپتوتیک را دارد که این یافته‫ها با یافته‫های مطالعه ما هم راستا بود، طبق یافته‫های ما و یافته‫های Aprigliano داروی آتورواستاین همواره اثرات آنتی اپوپتوتیک ندارد و در موراردی باعث القای آپوپتوزیس می‫شود که این نشانگر اثرات وابسته به دوز این دارو است. بنابراین در مصرف آتورواستاتین باید به‫میزان دوز دقیق مصرف دقت شود به‫طوری‫که به‫نظر می‫رسد آتورواستاتین در دوزهای پائین تر از  mg/kg 5 به‫صورت یک داروی القا کننده آپوپتوزیس اثر می‫کند و در دوزهای بالاتر از این مقدار به‫صورت یک داروی آنتی آپوپتوتیک اثر می‫کند که دلیل این امر نیاز به بررسی‫های سلولی و مولکولی بیشتری دارد.

خصوصیات سطحی به‫وسیله کوت کردن با پلاسما استفاده شد و سلول‫های بنیادی چربی انسانی روی آن کاشته شد.

• نتیجه­گیری

   در یک نتیجه گیری کلی بر اساس یافته‫های ما بر خلاف شناخته شدن آتورواستاتین به‫عنوان یک داروی آنتی آپوپتوتیک آتورواستاتین در دوز پایین می‫تواند باعث القای آپوپتوزیس تخمک‫های موش شود و آتورواستاتین به‫صورت یک داروی وابسته به دوز اثرات متفاوتی دارد.

• تشکر و قدردانی

   در این قسمت از مرکز تحقیقات سلولی مولکولی دانشگاه علوم پزشکی قزوین به‫خاطر فراهم کردن امکانات این مطالعه صمیمانه تشکر می‫شود.