چکیده
هدف: بررسی اثر ویتامین E بر روی پارامترهای اسپرم رت های بالغ تیمار شده با پارا نونایل فنل هدف این پژوهش بود. مواد و روش ها: رت های بالغ به چهار گروه تقسیم شدند: کنترل، پارا نونایل فنل، ویتامین E و پارا نونایل فنل+ ویتامین E. تیمارها بصورت دهانی به مدت 56 روز انجام گرفت. در پایان دوره تیمار، وزن بدن و بیضه چپ ثبت و ناحیه دمی اپی دیدیم چپ در محیط کشت به قطعات کوچکی بریده شد. اسپرم های آزاد شده جهت بررسی پارامترهای اسپرم از جمله تعداد، قابلیت حیات، مورفولوژی و قابیلت تحرک مورد استفاده قرار گرفت. بررسی کیفیت کروماتین از طریق رنگ آمیزی هسته بوسیله آکریدین اورنژ و آنیلین بلو انجام شد. نتایج: وزن بدن، وزن بیضه چپ و مورفولوژی اسپرم طبیعی هیچگونه تغییر معنی داری در چهار گروه مورد آزمایش نشان نداد. کاهش معنی داری در تعداد اسپرم، قابلیت حیات و قابلیت تحرک اسپرم ها در رت های تیمار شده با پارانونایل فنل در مقایسه با گروه کنترل مشاهده گردید که این کاهش در گروه پارا نونایل فنل+ ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل فنل بطور معنی داری توسط ویتامین E جبران شد. کاربرد ویتامین E به تنهایی توانست قابلیت حیات و قابلیت تحرک اسپرم را در مقایسه با گروه کنترل بطور معنی داری افزایش دهد. در این دوره زمانی تیمار و با غلظت بکار رفته پارا نونایل فنل نتوانست تغییر معنی داری در تمامیت DNA و همچنین جایگزینی پروتامین بجای هیستون در مقایسه با گروه کنترل ایجاد نماید. نتیجه گیری: ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی قادر است اثر محافظتی در مقابل اثرات مخرب پارا نونایل فنل بر روی برخی از پارامترهای اسپرم رت بالغ اعمال نماید.
کلیدواژه‌ها
عنوان مقاله [English]
Protective Effect of Vitamin E on Sperm Parameters in Adult Rat Treated with Para-nonylphenol
چکیده [English]
Aim: The aim of this study was to investigate the effect of vitamin E on sperm parameters in adult rat treated with para-nonylphenol.
Material and methods: Adult male rats were divided into four groups: Control, para-nonylphenol, vitamin E and para-nonylphenl+vitamin E. Oral treatments were performed till 56 days. At the end of treatments, body and left testis weight were recorded and left caudal epididymis was cut in a medium. Released spermatozoa were used to analyze sperm parameters such as sperm number, viability, morphology and motility. Sperm chromatin quality was assessed by nuclear staining using acridine orange and aniline blue.
Results: Body and testis weight as well as normal sperm morphology showed no significant change in four groups. A significant decrease in the number, viability and motility of the sperm was found in rats treated by para-nonylphenol compared to the control. This decrease was significantly compensated by vitamin E in para-nonylphenol+vitamin E group compared to para-nonylphenol group. The application of vitamin E alone could significantly increase sperm viability and motility as comared with the control. Para-nonylphenol had no effect on sperm DNA integrity and histon-protamine replacement compared to the control.
Conclusion: Vitamin E, as a potent antioxidant, could protect the adverse effect of para-nonylphenol on certain sperm parameters in adult rats.
کلیدواژه‌ها [English]
- Para-Nonylphenol
- Sperm parameters
- DNA integrity
- histon-protamine replacement
مقدمه
مطالعات نشان میدهد که تعداد اسپرمها در مردان امروزی به مراتب کمتر از تعداد اسپرم مردانی است که 50 سال گذشته زندگی میکردند (1). به همین دلیل ناباروری مردان یکی از معضلات جوامع بشری امروزی و بخصوص افرادی است که در جوامع صنعتی زندگی می کنند. ناباروری مردان می تواند از تغییرات متعددی که در سلامت تولید مثلی آنها ایجاد شده است ناشی گردد. مشکلاتی در تولید، بلوغ، تحرک و قابلیت لقاح اسپرم از جمله دلایل عمده ناباروری مردان محسوب می گردد. یکی از مشکلات ایجاد شده در دستگاه تولید مثل نر ممکن است ناشی از در معرض قرار گرفتن آلاینده های زیست محیطی محسوب می‌شود. نونایل فنل یکی از این آلاینده ها می باشد که بطور گسترده در ترکیباتی از جمله شویندهها، رنگها، علف کشها، حشره‌کش‌ها و لوازم آرایشی مورد استفاده قرار می‌گیرد (2). این ماده همچنین در پلی وینیل کلراید (PVC) که در ظروف پلاستیکی برای بسته بندی مواد غذایی بکار میرود یافت می‌شود (3). مشخص شده است که نونایل‌فنل در محیط های آبی از جمله رودخانه‌ها و دریاچه‌ها یافت می‌شود (4). علاوه بر این مطالعات متعددی حضور نونایل‌فنل را در آب آشامیدنی گزارش نموده‌اند(5و6). بنابراین انسان نه تنها از طریق مواد غذایی آلوده و آب آشامیدنی، بلکه از طریق جذب پوستی و تنفس در معرض این آلاینده قرار دارد (3، 5و7).
تحقیقات نشان میدهد که نونایل‌فنل قادر است ناهنجاری‌هایی در سیستم تناسلی جانور نر بوجود آورد. بعنوان مثال، نسل اول رت‌های نری که در طی دوره جنینی، شیرخوارگی و بعد از شیرخوارگی مورد تاثیر پارا نونایل‌فنل قرار گرفته بودند کاهشی در وزن بیضه و تعداد اسپرم (8و9)، حرکات اسپرم (8)، وزن اپی‌دیدیم و قطر لوله های سمی نیفر (9) نشان دادند. همچنین گزارش‌هایی مبنی بر کاهش تعداد اسپرم و وزن اپی‌دیدیم در رت های بالغ در معرض این آلاینده وجود دارد (10و11). مکانیسمهای مختلفی برای عملکرد این آلاینده زیست محیطی مطرح است. بعنوان مثال نونایل‌فنل می‌تواند بعنوان یک بر هم زننده سیستم درون ریز در تغییر غلظت هورمون‌هایی از جمله هورمون محرک فولیکولی (Follicle Stimulating Hormone, FSH) (8,11)، هورمون لوتینی (Luteinizing Hormone, LH)، تستوسترون (11و12) و استروژن (8) در جانور نر عمل نماید. علاوه بر این، مطالعات نشان می دهد که نونایل‌فنل اثرات سمی و مخرب خود را بر روی بافت لولههای سمی نیفر بیضه (11)، سلول های سرتولی بیضه (13) و یا اختلال در سیستم آنتی اکسیدانتی اسپرم‌های اپی‌دیدیمی (14) از طریق القا استرس اکسیداتیو اعمال می نماید.
ویتامین E (توکوفرول) یک آنتی اکسیدانت غیرآنزیمی قوی محسوب می‌شود که قادر است واکنش پراکسیداسیون لیپید را در غشاهای سلولی بوسیله محدود نمودن عمل رادیکال‌های آزاد مهار و بدین ترتیب غشاهای سلولی را از آسیب القا شده بوسیله آنها محافظت نماید (15). در دستگاه تناسلی نر، نقش آنتی اکسیدانتی این ویتامین در مهار نمودن اثرات مخرب رادیکال‌های آزاد در بیضه (16) و اسپرم (17و19) گزارش شده است. علاوه بر این، ویتامین E با قابلیت ذکر شده قادر است سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی سلول‌های بیضه و اسپرم را تقویت نماید (20). با توجه به اثرات سمی نونایل‌فنل مبنی بر القا استرس اکسیداتیو در دستگاه تناسلی نر، و نقش ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی (20) این طور میتوان فرض کرد که این ویتامین قادر باشد اثرات مخرب این آلاینده زیست محیطی را خنثی نماید. بنابراین این پژوهش با هدف بررسی نقش ویتامین E بر اثرات پارا نونایل‌فنل بر روی فاکتورهای اسپرم رت بالغ طراحی شد.
مواد و روش‌ها
حیوان و تیمارها:در این پژوهش تجربی از رت‌های نر بالغ نژاد ویستار با میانگین وزنی 10±220 گرم که از انستیتو پاستور ایران خریداری شده بودند استفاده شد. حیوانها در قفس های پلاستیکی در اتاق حیوانات با درجه حرارت 2 ±22 درجه سانتیگراد و نور کنترل شده 12 ساعت تاریکی، 12 ساعت روشنایی با دسترسی کامل به آب و غذای کافی نگهداری شدند. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوان های آزمایشگاهی رعایت شده است.
رت‌های بالغ در 4 گروه تقسیم شدند (در هر گروه 6 حیوان): گروه کنترل (که روغن ذرت دریافت کردند)، گروه پارا نونایل‌فنل (250 میلیگرم بر کیلوگرم، مرک، آلمان) گروه ویتامین E (100 میلیگرم بر کیلوگرم، سیگما، آمریکا) و گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E (250 میلیگرم بر کیلوگرم+100 میلیگرم بر کیلوگرم). تیمارها بصورت دهانی و بوسیله گاواژ روزانه به مدت56 روز انجام شد.
وزن بدن و بیضه:در پایان دوره تیمار، حیوان ها وزن، بوسیله اتر بی هوش و سرانجام کشته شدند. پس از خروج بیضه چپ، این اندام از چربی تمیز و وزن آن ثبت گردید. سپس ناحیه دمی اپی‌دیدیم چپ جدا شد تا جهت آنالیزهای اسپرم که در زیر به آن اشاره شده است مورد استفاده قرار گیرد.
شمارش اسپرم:اپی‌دیدیم خارج شده از هر حیوان به پلیت حاوی 5 میلی لیتر محیط کشت Ham's Fl0 انتقال یافت و به منظور خروج اسپرمها به درون محیط کشت به قطعات کوچکی بریده شد. پس از گذشت 10 دقیقه، یک میلیلیتر از مخلوط محیط کشت و اسپرم با 9 میلی لیتر فرمالین 2 درصد رقیق و فیکس شد. شمارش سرهای اسپرم با استفاده از هموسیتومتر نئوبار انجام گرفت و سپس تعداد اسپرمها در میلی لیتر محاسبه گردید. شمارش اسپرم بر اساس دستورالعمل ارائه شده از طرف سازمانی جهانی بهداشت (World Health Organization, WHO) (21) انجام شد.
قابلیت حیات اسپرم: به منظور بررسی قابلیت حیات اسپرم‌های هر گروه بر اساس دستورالعمل ارائه شده توسط WHO (21)، رنگ آمیزی ائوزین-نگروزین انجام شد. بطور خلاصه، ائوزین (1 درصد، مرک، آلمان) و نگروزین (10 درصد، مرک، آلمان) در آب مقطر آماده شد. ابتدا یک حجم مخلوط محیط کشت و اسپرم با دو حجم ائوزین مخلوط و پس از گذشت زمان 30 ثانیه نگهداری در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد، حجم مساوی از نگروزین به مخلوط ساخته شده (اسپرم و ائوزین) اضافه گردید. سپس گسترشهای نازکی از مخلوط تهیه و پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه توسط میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی ×1000 تعداد 100 اسپرم شمارش و نسبت درصد اسپرم در گروههای مختلف محاسبه گردید. در این رنگ آمیزی سر اسپرم های زنده به رنگ سفید، در حالی که سر اسپرم های مرده به رنگ قرمز ظاهر می شوند.
مورفولوژی اسپرم: لاملهای رنگ آمیزی شده بوسیله ائوزین - نگروزین جهت ارزیابی مورفولوژی اسپرم ها مورد استفاده قرار گرفتند. برای هر نمونه تعداد 100 اسپرم با بزرگنمایی ×1000 میکروسکوپ نوری بررسی و میزان ناهنجاری اسپرم بصورت درصد بیان شد.
قابلیت تحرک اسپرم:سنجش حرکات اسپرم بر اساس دستورالعمل ارائه شده توسط WHO (21) انجام شد. بطور خلاصه 10 میکرولیتر مخلوط محیط کشت و اسپرم بر روی لام مخصوص ارزیابی حرکات اسپرم قرار گرفت. حداقل 5 میدان میکروسکوپی جهت ارزیابی حرکت حداقل 200 اسپرم از هر نمونه مورد بررسی قرار گرفت. سپس درصد سه نوع طرح حرکتی در اسپرم شامل اسپرم‌های با حرکت پیش رونده، اسپرمها با حرکات درجا و اسپرم‌های غیرمتحرکت محاسبه گردید.
کیفیت کروماتین اسپرم:ابتدا از مخلوط محیط کشت و اسپرم گسترشهای نازکی بر روی لام تهیه و در درجه حرارت اتاق خشک شدند. جهت ارزیابی تمامیت DNA (DNA integrity)، گسترشهای اسپرم بوسیله آکریدین اورنژ رنگ آمیزی شدند (22). بطور خلاصه گسترشها در محلول فیکساتور متانول (3 قسمت)/ اسید استیک گلاسیال (1 قسمت) به مدت 14 ساعت در 4 درجه سانتیگراد تثبیت و سپس با محلول آکریدین اورنژ (19/0 درصد در بافر سیترات فسفاته، 5/2=pH) برای 10 دقیقه رنگ آمیزی شدند. لامها بوسیله آب مقطر برای 5 دقیقه به آرامی شستشو و سپس در دمای آزمایشگاه خشک شدند. سپس لامهای رنگ آمیزی شده بوسیله میکروسکوپ فلورسنس با بزرگنمایی ×1000 مورد بررسی قرار گرفتند. سه طرح رنگ آمیزی شده در سرهای اسپرم مورد توجه قرار گرفت: اسپرم‌های با سر سبز بیانگر DNA دو رشتهای یا سالم double – stranded DNA)) و اسپرم های با سر زرد و قرمز (بیانگر DNA تک رشتهای یا دناتوره شده (single – stranded DNA). در هر لام حداقل 100 اسپرم شمارش شد تا درصد اسپرم‌های دو رشتهای و تک رشتهای تعیین گردد.
نمونه کنترل مثبت: به منظور کنترل روش مذکور از نمونههای کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور نمونههای اسپرم از حیوان سالم و بالغ گرفته شد و سپسDNA این اسپرمها تحت تاثیر حرارت بالا (90 درجه سانتیگراد) دناتوره شد. پس از تهیه گسترش، نمونهها به روش اشاره شده در فوق رنگ آمیزی شدند.
جهت تعیین میزان جایگزینی پروتامین بجای هیستون، گسترشهای اسپرم با آنیلین بلو رنگ آمیزی شدند (23). بطور خلاصه گسترشهای اسپرم بوسیله محلول فرمالین 4 درصد برای 5 دقیقه تثبیت و پس از شستشو با آب مقطر، لام ها با آنیلین بلو (آنیلین بلو 5 درصد در اسید استیک 4 درصد، 5/3=pH) رنگ آمیزی گردیدند. سپس لام ها برای 5 دقیقه در آب مقطر شستشو و سرانجام با محلول ائوزین 5/0 درصد برای یک دقیقه رنگ آمیزی شدند. پس از خشک شدن، لامها توسط میکروسکوپ معمولی با بزرگنمایی ×1000 مورد ارزیابی قرار گرفتند. در این روش سر اسپرم‌های نابالغ (واجد مقادیر زیاد هیستون) بصورت آبی پررنگ، در حالی که اسپرم های بالغ (واجد پروتامین) به رنگ قرمز-صورتی ظاهر میشوند. حداقل 100 اسپرم در هر لام شمارش تا درصد اسپرم‌های بالغ و نابالغ تعیین گردد.
نمونه کنترل مثبت: به منظور کنترل روش مذکور از نمونههای کنترل مثبت استفاده شد. بدین منظور نمونههای اسپرم از بیضه حیوان نابالغ گرفته شد و پس از تهیه گسترش به روش اشاره شده در فوق رنگ آمیزی شد.
آنالیز آماری: نتایج بصورت میانگین ± انحراف استاندارد برای نمونه های موجود در هر گروه بیان شد. جهت آنالیز آماری از آنالیز واریانس یک طرفه همراه شده با تست توکی استفاده و 05/0p< بعنوان مرز معنی دار بودن نتایج در نظر گرفته شد.
نتایج
وزن بدن و وزن بیضه چپ
میانگین دادههای مربوط به وزن بدن رت ها، ٥٦ روز بعد از تیمار با پارا نونایل‌فنل بین هیچ یک از گروههای چهارگانه اختلاف معنیداری نشان نداد (جدول1). میانگین داده های مربوط به وزن بیضه چپ رتها، فقط در گروه تیمار شده با ویتامین E نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری (01/0p<) داشت (جدول ١).
جدول ١: مقایسه میانگین وزن بدن و بیضه رت در گروه های مختلف. پارا نونایل‌فنل (250 میلیگرم بر کیلوگرم). ویتامین E (100 میلی گرم بر کیلو گرم). مقادیر بصورت mean±SD بیان شده است. a) در مقایسه با کنترل. (01/0p<**).
|
وزن |
کنترل |
پارا نونایل‌فنل |
ویتامین E |
پارا نونایل‌فنل+ویتامین E |
|
وزن رت در پایان تیمار (گرم) |
16/304±23 |
50/315±9 |
٣٢٧/٥٠±32 |
٣٢٥±32 |
|
وزن بیضه (گرم) |
35/1±06/ |
35/1±08/ |
46/1±05/**a |
38/1±03/ |
بررسی تعداد اسپرم
از مقایسه میانگین تعداد اسپرم در گروه پارا نونایل‌فنل نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری(001/0p<) مشاهده شد. میانگین تعداد اسپرم در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل افزایش معنیداری (01/0p<) نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل را در خصوص کاهش تعداد اسپرم در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل به طور معنی داری جبران نماید (جدول2).
ارزیابی قابلیت حیات اسپرم
میانگین درصد اسپرم‌های زنده که معادل قابلیت حیات اسپرم می باشد در گروه تیمار شده با پارا نونایل‌فنل در مقایسه با گروه کنترل کاهش معنیداری (01/0p<) یافت. از طرفی قابلیت حیات اسپرم در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل افزایش معنیداری (001/0p<) را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل را درخصوص قابلیت حیات اسپرم در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل به طور معنیداری جبران نماید و آن را حتی بالا تر از حد گروه کنترل افزایش دهد. علاوه بر آن تیمار حیوانات با ویتامین E به تنهایی موجب افزایش معنیدار (001/0p<) در قابلیت حیات اسپرم نسبت به گروه کنترل شد (جدول 2).
بررسی مورفولوژی اسپرم
میانگین درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم در رت های مورد آزمایش بین هیچ یک از گروههای چهارگانه اختلاف معنیداری نشان نداد (جدول 2).
جدول2: مقایسه میانگین پارامترهای اسپرمی (تعداد، قابلیت حیات و مورفولوژی طبیعی اسپرم) در گروه های مختلف. پارا نونایل‌فنل (250 میلیگرم بر کیلوگرم). ویتامین E (100 میلیگرم بر کیلوگرم). مقادیر بصورت mean±SD بیان شده است. a: در مقایسه با کنترل، b: در مقایسه با پارا نونایل‌فنل (01/0p<** و 001/0p<***).
|
پارامترهای اسپرم |
کنترل |
پارا نونایل‌فنل |
ویتامین E |
پارا نونایل‌فنل+ویتامین E |
|
تعداد (106) |
٣١±٧/٨ |
١٤±٣/٨***a |
٣٢±٧/٨ |
٢٦±٣/٣**b |
|
قابلیت حیات (درصد) |
93/62±04/2 |
91/56±20/4**a |
78/70±47/1***a |
26/65±97/1***b |
|
مورفولوژی طبیعی (درصد) |
71/87±32/2 |
89/83±91/3 |
04/88±24/3 |
86/87±42/2 |
ارزیابی قابلیت تحرک اسپرم
میانگین درصد اسپرم‌های دارای حرکت جلو رونده در گروه پارا نونایل‌فنل نسبت به گروه کنترل کاهش معنیداری (001/0p<) یافت. از طرفی میانگین درصد اسپرم های دارای حرکت جلورونده در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E نسبت به گروه پارا نونایل‌فنل افزایش معنیداری (001/0p<) را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل را در خصوص درصد اسپرم‌های جلورونده در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل به طور معنیداری جبران نماید و آن را تقریبا به حد گروه کنترل برساند. بعلاوه، تیمار حیوان ها با ویتامین E به تنهایی، موجب افزایش معنی داری (001/0p<) در درصد اسپرم های جلو رونده نسبت به گروه کنترل شد بطوری که این میزان از درصد اسپرم‌های ساکن گروه کنترل بیشتر بود (جدول 3).
میانگین درصد اسپرم‌های دارای حرکات درجا (01/0p<) و ساکن (001/0p<) در گروه پارا نونایل‌فنل نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری یافت. از طرفی میانگین درصد اسپرم‌های دارای حرکات درجا (001/0p<) و ساکن (001/0p<) در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل کاهش معنیداری را نشان داد. به عبارت دیگر در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E، ویتامین E توانست اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل را در خصوص افزایش درصد اسپرم‌های دارای حرکات درجا و ساکن در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل به طور معنیداری (001/0>p) جبران نماید و آن را تقریبا به حد گروه کنترل برساند. علاوه بر آن تیمار حیوانها با ویتامین E به تنهایی، موجب کاهش معنیداری (001/0p<) در درصد اسپرم‌های ساکن نسبت به گروه کنترل شد بطوری که این میزان از درصد اسپرم‌های ساکن گروه کنترل نیز کمتر بود (جدول3).
ارزیابی تمامیت DNA
رنگ آمیزی گسترشها ی اسپرم با آکریدین اورنژ نشان داد که تیمار رتها با پارا نونایل‌فنل در مقایسه با گروه کنترل تاثیری روی دناتوره شدن ساختمان دو رشته ای DNA اسپرم نداشت، بطوری که سر اسپرم‌های گرفته شده از رت‌های تیمار شده با پارا نونایل‌فنل به رنگ سبز نمایان بودند (شکل a1). بر عکس نمونههای کنترل مثبت شامل اسپرم هایی کهDNA آنها توسط حرارت بالا دناتوره شده بودند به رنگ نارنجی ظاهر شدند (شکل b1).
جدول3: مقایسه میانگین قابلیت تحرک اسپرم در گروههای مختلف. پارا نونایل‌فنل (250 میلیگرم بر کیلوگرم). ویتامین E (100 میلیگرم بر کیلوگرم). مقادیر بصورت mean±SD می باشد. a: در مقایسه با گروه کنترل، b: در مقایسه باگروهپارا نونایل‌فنل. (01/0p<** و 001/0p<***).
|
قابلیت تحرک اسپرم (درصد) |
کنترل |
پارا نونایل‌فنل |
ویتامین E |
پارا نونایل‌فنل + ویتامین E |
|
جلو رونده |
30/57±67/2 |
76/37±74/1***a |
86/67±92/3***a |
61/56±39/3***b |
|
درجا |
88/18±63/1 |
15/24±65/2**a |
62/18±16/3 |
27/17±11/2***b |
|
ساکن |
81/23±74/1 |
08/38±39/3***a |
51/13±74/4***a |
11/26±22/3***b |
شکل 1: ارزیابی تمامیت DNA در اسپرم های رت. a) اسپرم های با سر سبز رنگ نشان دهنده DNA طبیعی و دست نخورده در گروه تیمار شده با پارا نونایل‌فنل (250میلیگرم برکیلوگرم به مدت) می‌باشد. b) نمونه کنترل مثبت. اسپرم های با سر نارنجی بیانگر اسپرمهایی است که DNA آن ها توسط حرارت بالا دناتوره شده است. رنگ آمیزی آکریدین اورانژ، بزرگنمایی X1000.
شکل 2: ارزیابی جایگزینی پروتامین بجای هیستون در کروماتین اسپرم رت a)اسپرم های با سر قرمز- صورتی (red-pink)بیانگراسپرم های بالغ واجد پروتامین هسته ای به رنگ در گروه تیمار شده با پارا نونایل‌فنل(250 میلیگرم بر کیلوگرم)می‌باشد. b) نمونه های کنترل مثبت شامل اسپرم‌های گرفته شده از حیوان نابالغ که سر اسپرم به دلیل وجود هیستون زیاد در کروماتین، به رنگ آبی دیده می شود. رنگ آمیزی آنیلین بلو، بزرگنمایی X1000.
ارزیابی جایگزینی پروتامین بجای هیستون در کروماتین
سرهای قرمز-صورتی اسپرم ها در رنگ آمیزی گسترشهای اسپرمی با آنیلین بلو بیانگر این بود که تیمار رت ها با پارا نونایل‌فنل در مقایسه با کنترل تاثیری بر روی جایگزینی پروتامین به جای هیستون در هسته طی فرایند بلوغ اسپرم نداشت (شکل a2). بر عکس، نمونههای اسپرم کنترل مثبت که از حیوان نا بالغ (حاوی مقدار زیادی پروتئین هیستون) گرفته شده بود به رنگ آبی ظاهر شدند (شکل b2).
بحث
این مطالعه بیانگر اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل بر روی برخی از پارامترهای اسپرم در رت‌های بالغ بود. علاوه بر این، ویتامین E توانست اثر سمی پارا نونایل‌فنل را بر روی تعداد اسپرم، قابلیت حیات و تحرک اسپرم محافظت نماید.
تیمار حیوانها با پارا نونایل‌فنل 56 روز انجام شد تا اثرات این آلاینده زیست محیطی در یک دوره کامل اسپرماتوژنز که در رت حدود 52 روز طول می کشد مورد ارزیابی قرار گیرد. چنانچه نتایج پژوهش حاضر نشان داد میانگین وزن رتها در پایان دوره تیمار در گروه پارا نونایل‌فنل نسبت به گروه کنترل تغییر معنیداری نشان نداد. این امر نشان دهنده این است که احتمالا شرایط متابولیکی عمومی در حیوانها در محدوده طبیعی بوده و این آلاینده با این دوز و در این دوره زمانی تاثیری در اشتها و مصرف مواد غذایی حیوان ها نداشته است. نتایج ما با نتایج برخی مطالعات در این زمینه که بر روی رت‌های بالغ صورت گرفته است مطابقت دارد (11، 14و24). از آنجا که در بسیاری از مطالعات که این آلاینده زیست محیطی (با دوز مشابه مطالعه حاضر) در طی دوره شیرخوارگی و پس از تولد تا سن بلوغ بکار برده شده موجب کاهش معنیداری در وزن بدن رتها شده است (8، 9و24) ، بنابراین این احتمال وجود دارد که طول دوره تیمار با پارا نونایل‌فنل می‌تواند عامل تعیین کنندهای در تغییرات وزن باشد.
در مطالعه حاضر تغییر معنیداری در وزن بیضه در گروه تیمار شده با پارا نونایل‌فنل مشاهده نشد. Dejager و همکاران (10) نشان دادند که تیمار رت‌های بالغ با دوز 100 تا 250 میلیگرم بر کیلوگرم به صورت دهانی تغییری در وزن بیضه نداشته است، در حالی که دوز 400 میلیگرم بر کیلوگرم موجب کاهش معنی دار وزن بیضه شده است. از طرفی در مطالعه قبلی ما (8) که تیمار رتها با دوز 250 میلی گرم بر کیلوگرم پارا نونایل‌فنل از روز هفتم حاملگی آغاز و نوزادان متولد شده از این مادران نیز تا 90 روزگی تحت این تیمار بودند، کاهش معنیداری در وزن بیضه مشاهده شد. این شواهد می‌تواند بیانگر این مطلب باشد که دوز مصرفی و همچنین طول دوره تیمار با پارا نونایل‌فنل احتمالا در تغییرات وزن بیضه رت‌های در معرض پارا نونایل‌فنل دخیل است. در پژوهش حاضر وزن بیضه در گروه تیمار شده با ویتامین E به تنهایی نسبت به گروه کنترل افزایش معنیداری را نشان داد. مشخص شده است که ویتامین E قادر است موجب افزایش اپی‌تلیوم ژرمینال و همچنین افزایش اسپرماتوگونیها و اسپرماتوسیتها شود (25). از آنجا که ویتامین E بطور سنتی بعنوان یک ویتامین ضد ناباروری مطرح است (26)، بنابراین این احتمال وجود دارد که این ویتامین با تاثیر مثبت بر رشد اندامهای تناسلی از جمله بیضه و همچنین افزایش ضخامت اپلی‌تلیوم زایشی لولههای سمی نیفر و غشا پایه موجب افزایش وزن بیضه شده باشد.
در توافق با پژوهشهای صورت گرفته (10و11)، نتایج بررسی حاضر نشان دهنده کاهش معنیدار تعداد اسپرم‌های اپی‌دیدیمی در رت‌های تیمار شده با پارا نونایل‌فنل در مقایسه با گروه کنترل بود. در این خصوص چندین فرضیه محتمل به نظر میرسد: 1- احتمال اینکه نونایل‌فنل بعنوان یک مخرب سیستم اندوکرین توانسته است با تغییر در هورمون های دخیل در تولید مثل موجب کاهش تعداد اسپرم در این پژوهش شده باشد. در این خصوص تحقیقات نشان می دهد که پارا نونایل فنل باعث تغییر در غلظت هورمون های از جمله تستوسترون، FSH و LH می‌شود (27). 2- القا آپوپتوزیس و یا سایر انواع مرگ سلولی بر روی سلول‌های زایشی و سرتولی بیضه در اثر القا استرس اکسیداتیو توسط پارا نونایل‌فنل احتمال دیگری در خصوص کاهش تعداد اسپرم‌های اپی‌دیدیمی در این پژوهش می‌باشد. در این خصوص گزارش‌هایی دال بر ایجاد آپوپتوزیس در سلول های زایشی بیضه که توسط این آلاینده زیست محیطی ایجاد شده است وجود دارد (11و28). علی رغم کاهش تعداد اسپرم‌های اپی‌دیدیمی، همانطور که در بالا اشاره شد، وزن بیضه بدون تغییر ماند. بنابراین این نتیجه می تواند پیشنهاد کند که کاهش تعداد اسپرم‌های اپی‌دیدیمی ممکن است بعلت آسیب و یا تخریب بافت بیضه ناشی از پارا نونایل‌فنل نبوده باشد. بررسی هیستولوژیکی بافت بیضه رت‌های تیمار شده با این آلاینده زیست محیطی می‌تواند این فرضیه را ثابت یا رد نماید. 3- مشخص شده است که پارا نونایل‌فنل قادر است در تولید رادیکال‌های آزاد که به نوبه خود موجب پراکسیداسیون لیپید در اسپرم می‌شود نقش مهمی بازی نماید (14). بنابراین این احتمال وجود دارد که پارا نونایل فنل با القا استرس اکسیداتیو بر روند تولید اسپرم و یا اسپرم‌های تولید شده اثر گذاشته و بدین ترتیب موجب کاهش تعداد اسپرم‌های اپی‌دیدیمی شده باشد. اگر این احتمال درست باشد، ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی که قادر است آسیبهای ایجاد شده بوسیله رادیکال های آزاد در غشاء سلول ها را مهار نماید (29) بایستی میتوانست اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل را در خصوص کاهش تعداد اسپرم بهبود بخشد. در این خصوص نتایج حاضر نشان داد که ویتامین E در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E بطور معنیداری کاهش تعداد اسپرم القا شده بوسیله پارا نونایل‌فنل را جبران نمود.
قابلیت تحرک و قابلیت حیات اسپرم بعنوان مهمترین پارامترهای اسپرم برای سنجش توانایی لقاح و همچنین تمامیت غشا اسپرم محسوب میشوند. غشاهای اسپرم پستانداران حاوی مقادیر زیادی اسیدهای چرب غیراشباع می باشند که نسبت به پراکسیداسیون لیپیدی حاصل از استرس اکسیداتیو که موجب از دست رفتن سریع ATP داخل سلولی و بنابراین کاهش حرکات و قابلیت حیات اسپرم می‌شود حساس میباشند (30). بنابراین این احتمال وجود دارد که تغییرات ایجاد شده در طرح حرکتی و همچنین کاهش قابلیت حیات اسپرمها در رت‌های تحت تاثیر پارا نونایل‌فنل ناشی از قابلیت این آلاینده زیست محیطی در القا استرس اکسیداتیو بوسیله پراکسیداسیون لیپیدی غشاهای اسپرم باشد. برای حمایت از این ایده، در پژوهش حاضر نشان داده شد که ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E، بطور معنیداری از اثرات مخرب پارا نونایل‌فنل بر روی طرح های حرکت و همچنین قابلیت حیات اسپرم ممانعت نمود. در همین خصوص، نشان داده شده است که یک آنالوگ محلول در آب ویتامین E تحت عنوان ترولوکس Trolox موجب ارتقا حرکت اسپرم و همچنین حفظ تمامیت غشا میتوکندریهای آن می شود (31). علاوه بر این، نقش این ویتامین در خصوص ارتقا کیفیت و باروری در اسپرم انسان گزارش شده است (17).
یکی از نتایج قابل توجه پژوهش حاضر این بود که کاربرد ویتامین E به تنهایی توانست بطور معنیداری نسبت به گروه کنترل درصد اسپرم‌های جلو رونده را افزایش و درصد اسپرم‌های ساکن را کاهش دهد. علاوه بر این ویتامین E به تنهایی موجب افزایش معنیدار درصد قابلیت حیات اسپرم در مقایسه با گروه کنترل شد. این اثر ویتامین E نیز ممکن است ناشی از نقش آنتی اکسیدانتی آن باشد. بدین ترتیب این احتمال وجود دارد که این ویتامین با ارتقا فعالیت سیستم دفاعی آنتی اکسیدانتی اسپرم Sperm defense antioxidant system شامل سوپراکسیداز دسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز نقش خود را در افزایش قابلیت تحرک و حیات اسپرم اعمال نموده باشد. این اثر ویتامین E ممکن است همچنین توجیه کننده نقش حفاظتی این ویتامین در جبران قابلیت حیات و تغییرات طرحهای حرکتی اسپرم در گروه پارا نونایل‌فنل+ویتامین E در مقایسه با گروه پارا نونایل‌فنل باشد.
در بررسی مورفولوژی اسپرمها، درصد مورفولوژی طبیعی اسپرم در گروه تیمار شده با پارا نونایل‌فنل کاهش یافته بود (که موید افزایش درصد ناهنجاریهای اسپرم است)، اما این کاهش نسبت به گروه کنترل معنیدار نبود. این احتمال وجود دارد که تغییرات این پارامتر اسپرمی در این پژوهش بستگی مستقیم به دوز مصرفی پارا نونایل‌فنل و دوره زمانی تیمار حیوانات با این آلاینده زیست محیطی داشته باشد.
رنگ‌آمیزی آکریدین اورنژ و آنیلین بلو روشهایی هستند که به ترتیب برای تعیین تمامیت DNA (DNA دو رشته ای در مقابل DNA تک رشته ای) (22) و جایگزین شدن پروتامین بجای هیستون (32) بکار می رود. اگرچه ناهمگون بودن رنگ آمیزی گسترشها، طولانی بودن زمان تثبیت (در مورد رنگ آمیزی آکریدین اورنژ) و خطای مشاهده گر در مطالعه میکروسکوپی ممکن است از محدودیتهای این سنجش محسوب گردد، اما این روشهای ساده و ارزان هنوز به عنوان روشهای مفید برای ارزیابی ساختمان کروماتین در طیف وسیعی از مطالعات پایه و کلینیکی مورد استفاده قرار می گیرد (33و34). با استفاده از رنگ آمیزی آکریدین اورنژ و آنیلین بلو نشان داده شد که اسپرم‌های گرفته شده از رت‌های تیمار شده با پارا نونایل‌فنل در مقایسه با گروه کنترل تغییر معنیداری را به ترتیب روی دناتوره شدن ساختمان دو رشته ای DNA (تمامیت DNA) و جایگزین شدن پروتامین بجای هیستون (که در طی بلوغ اسپرم اتفاق می‌افتد) نشان نداد. تا کنون در هیچ مطالعهای تاثیر پارا نونایل‌فنل بر روی تمامیت DNA و همچنین جایگزینی پروتامین بجای هیستون گزارش نشده است. به نظر میرسد که این اثر پارا نونایل‌فنل به دوز مصرفی و دوره تیمار وابسته باشد.
تفسیر نتایج کسب شده از این پژوهش بر اساس پیش فرضهایی ازجمله اثر القا کننده استرس اکسیداتیو توسط پارا نونایل‌فنل و اثر آنتی اکسیدانتی ویتامین E به عنوان یک احتمال و فرضیه مطرح شده است. بدیهی است اثبات این فرضیه منوط به اندازهگیری شاخصهای استرس اکسیداتیو از قبیل مالوندیآلدهید (MDA) و توانایی آنتی اکسیدانتی/احیا کنندگی آهن سه ظرفیتی Ferric Reducing/Antioxidant Power (FRAP) در نمونههای اشاره شده در این پژوهش می‌باشد. لذا اندازه گیری این شاخصها در تحقیقهای آینده پیشنهاد می شود تا بتواند در خصوص اثبات یا عدم اثبات این فرضیه کمک نماید.
نتیجه گیری
پارا نونایل‌فنل بعنوان یک آلاینده زیست محیطی احتمالا با القا استرس اکسیداتیو قادر است ناهنجاری‌هایی را در برخی از پارامترهای اسپرمی از قبیل تعداد، قابلیت حیات، قابلیت تحرک اسپرم بوجود آورد و ویتامین E بعنوان یک آنتی اکسیدانت قوی قادر است اثرات مخرب این آلاینده را بر این پارامترهای اسپرم محافظت نماید. بنابراین استفاده از مواد غذایی و میوههای واجد آنتی اکسیدانتهای طبیعی می‌تواند استراتژی مناسبی برای کاهش رادیکال‌های آزاد و بنابراین جلوگیری از آسیب های وارده به سیستم تناسلی در افرادی که بیشتر در معرض آلاینده های زیست محیطی القا کننده استرس اکسیداتیو هستند، به شمار آید.
تشکر و قدردانی
نویسندگان بر خود لازم میدانند تا از کمک‌های ارزشمند خانم نجمه اسکندری و آقای مهدی نوده فراهانی در این پژوهش تشکر و سپاسگزاری نمایند.
)