مقدمه

بیماری‌های قلبی-عروقی یکی ازمهم‏ترین علل مرگ‌ و میر در انسان، به‏خصوص در کشورهای صنعتی می‏باشند. علی‏رغم پیشرفت در تحقیقات و یافته‏های جدید، وجود محیط‏های آلوده امروزی، مراقبت‏های پیشگیرانه و درمان بیماری­های قلب و عروق را با چالش رو برو کرده است.

 امروزه استفاده از ارگانوفسفره‏های حشره‏کش به‏منظور افزایش محصولات کشاورزی رو به افزایش است و باقیمانده این حشره‏کش‏ها به‏طور ناخواسته از طریق خاک، آب و محصولات کشاورزی به بدن انسان وارد می‏شود. با وجود این‏که مهار فعالیت استیل کولین استراز پلاسما به‏عنوان مکانیسم اصلی سمیت ارگانوفسفره‏ها بر بدن پیشنهاد شده است،  با این حال محققین نشان داده‏اند که این مکانیسم بیان‏گر تمام اثرات سمی ارگانوفسفره‏ها نمی­باشد (1و2). در طول چند سال گذشته، مطالعات روی موجودات زنده و محیط غیرزنده نشان می­دهد که بعضی ارگانوفسفره‌ها با تولید رادیکال‌های آزاد باعث استرس اکسیداتیو می­شوند (1، 3). مالاتیون جزء رایج‏ترین آفت‏کش­های ارگانوفسفره بوده که به‏طور عمده در کشاورزی، دامپزشکی و حتی به‏منظور خودکشی مورد استفاده قرار می­گیرد (4). اثرات مضر مالاتیون بر روی برخی اندام‏های بدن و ازجمله کبد، شش، ماهیچه‏ها، مغز و دستگاه قلبی- عروقی گزارش شده است (2، 4، 5). تجویز خوراکی مالاتیون به موش صحرایی، موجب تغییر فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانت و افزایش پراکسیداسیون لیپیدها در اریتروسیت، بزاق و پلاسما می­شود (6). 

 استرس اکسیداتیو با عدم تعادل بین رادیکال‌های آزاد (اکسیدانت‏ها) و سیستم‌های آنتی‏اکسیدانتی ایجاد می‏شود. نقش استرس اکسیداتیو در بیماری‏های قلبی عروقی، آلزایمر، پارکینسون ، دیابت ، سرطان ، اختلالات روانی و همچنین پیر شدن مغز ثابت شده است (7). اثرات استرس اکسیداتیو از طریق سنجش میزان فعالیت آنزیم‏های آنتی‏اکسیدانت در بدن قابل سنجش است (7). پروسه اثرات نامناسب ارگانوفسفره‏ها بر بروز استرس اکسیداتیو، می­تواند توسط آنتی اکسیدانت‏های مختلف متوقف شود (8).

مطالعات تاریخی و اپیدمیولوژیک نشان می‏دهد که برنامه رژیم غذایی حاوی فلاونوئیدها و از جمله میوه­های درختی با داشتن کورستین دارای مزایای سلامتی مثبت، به‏ویژه در قلب است (9). کوئرستین ترکیبی پلی‏فنولیک بوده که در بسیاری از میوه­ها و سبزیجات یافت می­شود و به‏عنوان یکی از مکمل­های غذایی محافظت کننده بالقوه در برابر بیماری عروق کرونر قلب است. از دیگر مزایای کوئرستین می‏توان به بهبود عملکرد قلب از طریق افزایش جریان کرونر، افزایش انقباض میوکارد و بهبود ارتفاع قطعه ST اشاره کرد (10).کوئرستین دارای مزایای مهم  روی قلب و دستگاه عروقی به‏عنوان مهار اکسیداسیون LDL (Low-Density Lipoproteins) اثرات وازودیلاتور مستقل اندوتلیوم، کاهش مولکول‏های چسبندگی و دیگر نشانگرهای التهابی، اثر محافظتی بر روی اکسید نیتریک و عملکرد اندوتلیال در شرایط استرس اکسیداتیو، جلوگیری از آسیب‏های اکسیداتیو و التهابی نورون و اثرات ضد تجمعی روی پلاکت‏ها می­باشد (9و11) .تیمار با کوئرستین موجب کاهش مقدار کورتیکوسترون خون در رت‏های تحت استرس مزمن می­شود (12). این آنتی‌اکسیدانت همچنین  با مهار تولید(Nitric Oxide) NO در قلب و به‏دنبال آن کاهش رادیکال‌های آزاد، از آسیب  ناشی از استرس اکسیداتیو جلوگیری می‌کند (13). همچنین گزارش شده که کوئرستین در کاهش فشار خون و به ‏دنبال آن کاهش خطر بیماری‌های قلبی و سکته موثر است (14).

استفاده گسترده از سموم کشاورزی به‏منظور رشد سریع انواع محصولات کشاورزی در تامین نیازهای جمعیت آدمی در قرن اخیر، ضرورت می­طلبد بخشی از تحقیقات به‏منظور خنثی سازی این سموم صورت گیرد. با توجه به گزارشات متعدد مبنی بر نقش سم مالاتیون در القا بحران کولینرژیک و استرس اکسیداتیو و نیز اهمیت بررسی اثر مواد خنثی کننده آثار سمی مالاتیون و در عین حال بنا به فواید و اهمیت کوئرستین در کاهش اثرات استرس اکسیداتیو و نیز پیشنهاد محققین قبلی مبنی بر  استفاده آتی از کورستین برای درمان بیماری‏های قلبی (9و15)، همچنین با توجه به نبود پیشینه مطالعاتی در مورد برهم کنش اثرات این دو ماده بر پاتولوژی قلب تاکنون، در این پژوهش اثر سمیت تزریق داخل صفاقی مالاتیون بر تغییرات بیوشیمیایی و مورفولوژی بافت میوکارد قلب رت‏ها و نیز اثرات حفاظتی احتمال تزریق داخل صفاقی کوئرستین بر این تغییرات در قلب رت­های مسموم شده با مالاتیون مطالعه شد.

مواد و روش‌ها

مقاله حاضر حاصل طرح پایان نامه دوره کارشناسی ارشد می­باشد که زمان اجرای طرح و پیگیری آن به‏مدت 14 ماه و از تیر ماه 95 تا شهریور 96 صورت گرفته است. در این مطالعه بنیادی از موش­های رت نر نژاد ویستار، تهیه شده از انستیتو پاستور تهران در محدوده وزنی­ 200 تا250 گرم استفاده شد. به‏منظور کاهش استرس و عادت به‏شرایط آزمایشگاه فیزیولوژی جانوری در دانشکده علوم طبیعی دانشگاه تبریز، جانوران به‏مدت دو هفته در گروه‏های 8‎ تایی در شرایط دمای ثابت محیطی (2±23 درجه سانتی‫گراد) و تنظیم نور با دوره­ی تاریکی­_روشنایی ­12ساعته (روشنایی از ساعت­­ 7­صبح) نگه‫داری می­شدند. هنگام کار با رت­ها موازین اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شد (6 و15). مبنای انتخاب موش‏های نر ، ساده‏تر بودن سیستم هورمونی و نیز تداخل کمتر هورمون‏های جنسی با داروها بود.

 داروهای مورد بررسی در این پژوهش عبارت بودند از: مالاتیون (خریداری شده از مجتمع صنعتی رجا شیمی)، مالاتیون مایع امولسیون شونده مورد استفاده از فرمولاسیون شرکت اکسیر کشاورزی: EC­ 57 درصد تهیه شده است ­(16). پودر کوئرستین (از شرکتSigma-Aldrich)، عصاره کوئرستینی مورد استفاده در         آزمایش‫ها با حل­کردن پودر آن در اتانول 1 درصد و تخلیص آن صورت گرفت (16).

42 سر رت نر بالغ در گروه‏های آزمایشی6‎ تایی انتخاب شدند: دوزهای دارویی مورد استفاده در این تحقیق، یا مشابه با دوزهای دارویی استفاده شده توسط محققین قبلی بود و یا بر اساس پاسخ دوزی داروها بوده است (2 و 17). تمام تزریق‏های دارویی به‏صورت درون صفاقی و به‏مدت یک هفته صورت می­گرفت. گروه کنترل که هیچ تزریق دارویی صورت نگرفت، دو گروه آزمایشی که دریافت کننده دوزهای مختلف عصاره­ی کوئرستین (100­و­50 میلی‏گرم بر کیلوگرم) بودند.­ دو گروه آزمایشی دیگر که دوزهای مختلف مالاتیون (200 و 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم) دریافت کردند و دو گروه آزمایشی دیگرکه دوز بی‏اثر 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم کوئرستین را سه روز پس از تزریق  دوزهای 200 و ­100 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون به‏مدت یک هفته دریافت کردند.

24 ساعت بعد از ­آخرین تزریق، موش‏ها با پنبه­ی آغشته به کلروفرم معدوم می‏شدند. سپس قلب جدا شده و بلافاصله در نیتروژن مایع80- درجه سانتی‫گراد به‏صورت فریزر نگه‏داری می­شد. به‏منظور تهیه هموژن بافتی از قلب، روی هر یک از نمونه‏ها محلول سرد  KCl 015/ 0 با نسبت (­1:10)­ اضافه شد. هموژن بافتی با استفاده از هموژنایزر مکانیکی تهیه شد. بعد از سانتریفیوژ کردن در دور  RPM3000 به‏مدت 10 دقیقه در دمای­4 درجه سانتی‫گراد، محلول شفاف رویی از رسوب زیرین جدا شد تا برای آنالیزهای بیوشیمیایی مورد استفاده قرار گیرد (18).

نحوه آماده‏سازی بافتی و مراحل بافت‏شناسی: پس از فیکس شدن بافت‌ها در فرمالدئید 10 درصد، نمونه‌ها به تفکیک شماره‌گذاری و داخل کاست بافتی گذاشته شده و سپس هر کدام به‏ترتیب در اتانول 60، 70، 90، 96 و 100 درصد به‏مدت 90 دقیقه قرار گرفتند. نمونه‌ها به‏مدت 90 دقیقه در محلول گزیلل قرار گرفتند و بلوک‏های آلومینیومی به پارافین مذاب منتقل شدند. در ادامه نمونه‏ها به تفکیک گروه و نوع بافت شماره‌گذاری شدند. سپس از بلوک‌های بافتی مقاطع بافتی به‏وسیله میکروتوم به‏دست آمد و با تکنیک هماتوکسیلن­ـائوزین رنگ‌آمیزی شده و با میکروسکوپ نوری با بزرگنمایی 40 مورد بررسی و ارزیابی قرار گرفتند.

مطالعات بیوشیمیایی:

سنجش پراکسیداسیون لیپیدی: پراکسیداسیون لیپیدی با سنجش میزان مالون‏دی‏آلدئید MDA               (Malondialdehyde)در بافت هموژنیزه قلب مورد بررسی قرار می­گیرد. به‏طور خلاصه بافت هموژن قلب با محلول 20 درصد تری‏کلرواستیک اسید و محلول 8 درصد تیوباربیتوریک اسید مخلوط و برای مدت 60 دقیقه در آب داغ می­جوشد. پراکسیداسیون لیپیدی بر پایه میزان واکنش MDA با تیوباربیتوریک اسید و ایجاد TBARS ( Thiobarbituric acid reactive substance) در بافت هموژن شده اندازه‏گیری شد. میزان واکنش با                 TBARSدر محلول رویی توسط دستگاه اسپکتروفتومتر در طول موجnm  532 تعیین شد. نتایج به‏صورت نانومول در میلی‏گرم پروتئین بیان شد (19). سنجش آنزیم گلوتاتیون پروکسیدازGlutathione Peroxidase) GPx): فعالیت آنزیم GPx با استفاده از روشPaglia  و Valentine اندازه‏گیری شد. اساس این روش بر پایه اکسیداسیون NADPH در حضور H₂O₂ است.  فعالیت این آنزیم بر روی محلول رویی تهیه شده از بافت هموژن، در طول موج 340 نانومتر و در درجه حرارت 37 درجه سانتی‏گراد، توسط دستگاه اسپکتروفتومتری اندازه­گیری شد. مقادیر به‏دست آمده به‏صورت واحد در میلی‏گرم پروتئین بیان شدند (19). سنجش مقدار MDA و میزان فعالیت آنزیم آنتی‏اکسیدانتی GPx در بین گروه‏های مختلف به‏کمک آزمون ANOVA یک‏طرفه استفاده می‏شد. بعد از معنی‏دار بودن تفاوت­ها، برای مقایسه تفاوت گروه‌های آزمایشی از آزمون post hoc Tukey استفاده می‌شد. برای معنی‌دار بودن تفاوت گروه‌ها مقدار معنی‌دار 05/0p< ملاک قرار می‌گرفت. نمودارهای مربوطه از طریق نرم افزار 2016Excel  رسم شد.

نتایج

نتایج آسیب بافتی مربوط به تاثیر کوئرستین در قلب رت‏های مسموم شده با مالاتیون

در بررسی مقاطع بافت قلبی در گروه کنترل، میوفیبریل‌های عضلانی مشخص و در بین فیبرها مقدار جزئی بافت پیوندی مشاهده شد. نمای هسته‌های میوسیت‌های عضله قلبی بیضی شکل بوده و به‏صورت مرکزی در میان میوسیت‌ها قرار داشتند (شکل1). درگروه‌ تیمار شده با دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون در مقایسه با گروه کنترل، نشانه‌های آسیب‌ میوسیتی به‏صورت نکروز و التهاب بافتی به‏طور چشم‌گیر مشاهده شد. به‏طوری‏که آرایش میوفیبریل‌های عضله قلبی به‏شدت نظام گسیخته و به‏هم خورده بودند. همچنین بافت میوکاردی با افزایش وسعت بین فیبری همراه بود، و فضای اطراف سلول‌های میوکاردیال به‏صورت اسکارهای فیبروتیک منتشر و تجمع مقدار زیادی از عناصر بافت همبندی مشهود بود. در بخش‌هایی از نواحی بین فیبری عضله قلبی، خونریزی به‏صورت موضعی و منتشر به‏همراه احتقان عروق خونی مشاهده شد.

شکل1: تصویر میکروسکوپی بافت میوکاردی گروه دریافت کننده دوز 200    میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون (الف- افزایش خونریزی، التهاب و احتقان بافتی؛ ب-افزایش فضای بین میوفیبرها و افزایش بافت پیوندی ؛ ج- بی‏نظمی آرایش میوفیبرها و افزایش تراکم هسته سلول‏ها) (بزرگنمایی ×40)

شکل 2 در نمای میکروسکوپی مقاطع بافتی عضله قلبی از قلب رت‏های تحت تیمار با کوئرستین و مالاتیون را نشان داد که  تزریق دوز 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم کوئرستین موجب کاهش اثر نامناسب  دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون بر بافت مورد نظر می­شود. به‏طوری‏که میزان التهاب بافتی کاهش یافت. همچنین آسیب سلول‌های میوکاردی در مقایسه با گروه‏های مالاتیون کاهش یافته بود و آرایش میوفیبریل­ها بی‌نظمی ‌نسبی داشت.

شکل 2: تصویر میکروسکوپی بافت میوکاردی گروه دریافت کننده دوز­ 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون + دوز 50 میلی‏گرم بر کیلو گرم کوئرستین (الف-کاهش التهاب، خونریزی و احتقان بافتی؛ ب-کاهش بی‏نظمی آرایش میوفیبرها) (بزرگنمایی (بزرگنمایی ×40)

سنجش پارامترهای استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدی

 نتایج تحلیل واریانس یک‌طرفه نشان می‌دهد که تزریق درون صفاقی دوزهای 50 و 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم کوئرستین تغییری معنی‏دار در میزان پراکسیداسیون لیپیدی (نمودار 1) و فعالیت آنزیم آنتی‏اکسیدانتی گلوتاتیون پراکسیداز (نمودار 2) در بافت قلبی ایجاد نمی‏کند. نتایج بیانگر عدم تاثیر دوزهای به‏کار رفته کوئرستین به‏صورت درون صفاقی بر استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدی در بافت میوکاردیوم قلبی در موش صحرایی نر است. تحلیل واریانس یک‌طرفه و تست post hoc Tukey نشان داد که تزریق درون صفاقی دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون موجب افزایش MDA (نمودار 1،  01/0>p) و کاهش  گلوتاتیون پراکسیداز (نمودار 2، 001/0>p) نسبت به گروه کنترل شد. نتایج نشان داد که دوز بالای مالاتیون در این تحقیق به‏صورت درون صفاقی موجب استرس اکسیداتیو و پراکسیداسیون لیپیدی در بافت میوکاردیوم قلبی می­شود. نتایچ ترکیب تزریق داروها نشان داد که تزریق درون صفاقی دوز بی‏اثر 50 میلی‏گرم بر کیلو گرم کوئرستین موجب توقف پاسخ دوز درون صفاقی 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون بر مقدار MDA (نمودار 1، ­001/0>p) و گلوتاتیون پراکسیداز (نمودار 2، 05/0>p) می­شود، اما به‫کارگیری دوز بی‏اثر 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم کوئرستین اثری معنی‏دار بر پاسخ ناشی از دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون روی پراکسیداسیون لیپیدی (نمودار 1) و فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز (نمودار 2) ندارد. نتایج بیانگر اثر آنتاگونیستی تزریق­ دوز بی‏اثر کوئرستین بر پاسخ ناشی از مالاتیون روی پراکسیداسیون لیپیدی و استرس اکسیداتیو  است که  این اثر با کاهش مقدار MDA و افزایش فعالیت آنزیم گلوتاتیون پراکسیداز دربافت میوکاردیوم قلبی نشان داده شده است.

نمودار 1: اثر تزریق درون صفاقی دوزهای  mg/kg100 و 50 کوئرستین و دوزهای 200 و­100 میلی‏گرم بر کیلوگرم مالاتیون نسبت به گروه کنترل و نیز  برهم کنش اثر دوز بی‏اثر 50 میلی‏گرم بر کیلوگرم کوئرستین بر دوز مؤثر  مالاتیون (200 میلی‏گرم بر کیلو گرم) روی میزان پراکسیداسیون لیپیدی (MDA) بافت قلبی در موش بزرگ آزمایشگاهی     ( 01/0>p ** در مقایسه با گروه کنترل و 001/0>p +++  در مقایسه با گروه دریافت کننده دوز  مالاتیون ­200 میلی‏گرم بر کیلوگرم).

نمودار2: اثر تزریق درون صفاقی دوز های mg/kg100و 50 کوئرستین  و دوزهای ­ mg/kg 200 و­100 مالاتیون نسبت به گروه کنترل و نیز  برهم کنش اثر دوز بی اثر mg/kg50 کوئرستین بر دوز مؤثر  مالاتیون (mg/kg 200) روی فعالیت آنزیم آنتی اکسیدانی گلوتاتیون پراکسیداز در موش بزرگ آزمایشگاهی ( 001/0>p *** در مقایسه با گروه کنترل و05/0>p +  در مقایسه با گروه دریافت کننده دوز  مالاتیون mg/kg ­200)