مقدمه

سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان سلول‌های پرتوانی است که به‏راحتی استخراج، تخلیص و تکثیر شده و توانایی تمایز به انواعی ازسلول‌ها نظیر سلول‌های استخوانی، غضروفی و چربی را دارا می‏باشند و می‌توان از آن‌ها درپیوندهای اتولوگ استفاده کرد. این سلو‌ل‌ها علاوه بر مغز استخوان در بافت‌هایی نظیر بافت چربی، پرده سینوویال و عضله اسکلتی نیز یافت می‏شوند (2-1). ازآنجایی‌که سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان در تماس مستقیم با خون محیطی بوده و همچنین به‏علت داشتن پتانسیل بالای تمایزی و توان تکثیر برای مدت طولانی، این رده از سلول‌های بنیادی، می‌تواند یک انتخاب مناسب برای بررسی اثرمواد سمی و آلاینده‌‌ها برروی خواص بنیادین، میزان تکثیر و تمایز سلولی محسوب شود (3).

از سوی دیگر امروزه در جوامع صنعتی، انسان و دیگر موجودات زنده به‌طورمستقیم و غیرمستقیم در معرض آلاینده‌های زیست محیطی بسیاری قرار دارند. یکی از مهم‌ترین این آلاینده‌های محیطی، بیسفنول A می‌باشد که ورود آن به چرخه‌های غذایی طی30 سال اخیر به‌طور فزاینده‌ای افزایش یافته است (4).

بیسفنول  Aیا 2-2، بیس‌هیدروکسی‌فنل‌پروپان، مهم‌ترین الیل‌فنلی است که امروزه در صنایع بسته‌بندی غذایی کاربرد دارد (5). این آلاینده صنعتی به‌عنوان یک زنواستروژن محیطی شناخته می‌شود و به‏دلیل داشتن اثرات استروژنیک روی سیستم تولیدمثل، جزء مخرب‌های اندوکرینی نیز طبقه‌بندی می‌شد (6). بیسفنولA به‏طور وسیع در تولید انواع مواد و وسایل پزشکی از جمله لنزهای چشمی و کامپوزیت‌های دندانپزشکی و همچنین ظروف یک‌بار مصرف،پوشش داخلی قوطی‌های کنسرو، بطری‌ آب معدنی، شیشه‌ تغذیه اطفال، پلاستیک‌های(polyvinyl chloride) PVC ، پلی‌کربنات‌ها و غیره استفاده می‌شود (8-7) و می‌تواند از طریق آب، هوا و غذا وارد زنجیره غذایی انسان ‌شد (12-9).

طبق مطالعات صورت گرفته توسط Yang و همکارانش، اثرسیتوتوکسیسیتی بیسفنولA بر تمایزسلول‌های بنیادی جنینی انسان به‏سلول‌های اپی‌تلیال بررسی شده (13) ولی باوجود اهمیت سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان به‏عنوان یک ذخیره با ارزش در جایگزینی سلول‌های استخوانی به‏هنگام صدمات بافتی، تاکنون اثر این آلاینده زیست محیطی بر تمایز این سلول‌ها به استئوبلاست گزارش نشده است.

بنابراین با توجه به ‏کاربرد گسترده بیسفنولA در محیط زیست و ورود آن به زنجیره غذائی طی 30 سال اخیر و تهدید سلامت انسان، این مطالعه با هدف بررسی اثر سمیت بیسفنول A بر میزان تمایز استئوژنیک در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت بالغ به‏عنوان یک مدل آزمایشگاهی طراحی شد.

مواد و روش‌ها

جداسازی وکشت سلول‌های مغز استخوان: در این مطالعه تجربی از رت‌های نژاد Wistar با سن 50 روز و وزن 20±140 گرم استفاده شد. حیوانات مورد استفاده در این پژوهش پس از خریداری از انستیتو پاستور ایران در خانه حیوانات دانشگاه اراک در شرایط استاندارد دمائی 3±27 درجه سانتی‏گراد و با دسترسی آزاد به ‏غذا و آب در قفس‏های پلی‏اتیلین نگه‫داری شد. در این پژوهش کلیه اصول اخلاقی کار با حیوانات آزمایشگاهی رعایت شده است. رت­ها به‏کمک دی‏اتیلن‏اتر بی‫هوش شده، استخوان‌های ران و ساق پای آن‌ها جدا و سپس بافت‌های پیوندی اطراف استخوان‌ها به‏طورکامل پاک شد. استخوان‌ها در محیط کشت  DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium ، Gibco، Germany) حاوی 15 درصد سرمFBS  (Fetal Bovine Serum، Gibco، Germany) و پنی‌سیلین-استرپتومایسین (تهیه شده از شرکت Gibco، Germany) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد قرار گرفته و به زیر هود لامینار منتقل شد. دو سر استخوان با قیچی استریل قطع و مغز استخوان با عمل فلاشینگ خارج و به داخل لوله فالکون حاوی محیط کشت کامل هدایت و سپس به‏مدت 5 دقیقه در  rpm1200 سانتریفیوژ شد. محیط رویی خارج و رسوب سلولی در یک میلی‌لیتر محیط کشت تازه معلق شد و در فلاسک کشت T25 و در انکوباتور CO₂‌دار (دمای 37 درجه سانتی‫گراد و 5 درصد CO₂) انکوبه شد. پس از 24ساعت محیط رویی که حاوی سلول‌های غیرچسبنده بود، خارج و شستشوی سلول‌ها با PBS انجام شد.سپس به‏مدت دو هفته، هر سه روز یک‫بار محیط کشت سلول‌ها تعویض شد. زمانی‏که کف فلاسک به تراکم بالایی ازسلول رسید، سلول‌ها با کمک Trypsin/EDTA (تهیه شده از شرکت Sigma-Aldrich) ازکف فلاسک جدا و به فلاسک‏های جدید منتقل شدند. برای به‫دست ‏آوردن خلوص بالایی از این سلول‌ها سه مرحله پاساژ تکرار شد.

کشت سلول‌ها در غلظت‌های مختلف بیسفنول A و اندازه‏گیری میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی: سلول‌های پاساژ سوم به‏تعداد10³×5 سلول در هر خانه‌ی پلیت 24 خانه ای به‏مدت 24 ساعت کشت و پس از چسبیدن این سلول‌ها به کف در حضور گروه‌کنترل (محیط استئوژنیک: محیط DMEM حاوی 10 درصد سرم گاوی، 10 میلی‫مولار بتاگلیسرول فسفات،10 نانومولار دگزامتازون و 50 میکروگرم در میلی‌لیتر آسکوربیک 3-فسفات) و غلظت‌های 1، 5، 10، 50، 100، 250، 500، 1000، 2000 و 4000 نانومولار بیسفنول A (تهیه شده از شرکت Sigma-Aldrich) در محیط استئوژنیک کشت شد (14). پس از 21 روز، میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی سلول‌ها با روش کمی و کیفی آلیزارین‌رد ارزیابی شد.  برای انجام این روش محیط کشت رویی برداشته و سلول‌ها با فرمالین 10 درصد فیکس شد و سپس با محلول رنگی آلیزارین‏رد(Sigma, St. Louis, MO, USA)  رنگ‌آمیزی شد. سلول‌ها با آب‏مقطر شستشو و سپس اسیداستیک 10 درصد به سلول‌ها افزوده و بدین ترتیب رنگ قرمز آلیزارین‌رد از ماتریکس استخوانی استخراج شد و با استفاده از میکروسکوپ نوری عکس‌برداری نمونه‌ها انجام شد. در پایان جذب محلول‌های قرمز رنگ حاصل در طول موج 405 نانومتر با دستگاه اسپکتروفوتومتر(PGplus-Germany) ثبت شد (14).

انتخاب غلظت موثر و بررسی‌های بیشتر: با توجه به‏نتایج به‏دست آمده از تکنیک رنگ‌آمیزی آلیزارین‌رد، 250 نانومولار بیسفنولA  به‏عنوان غلظت موثر انتخاب شد و مطالعه با دو گروه کنترل و تیمار با بیسفنول A (250 نانومولار) ادامه یافت.

بررسی میزان رسوب کلسیم خارج سلولی (وان کوزا): رنگ‌آمیزی و انکوزا با استفاده از نیترات نقره میزان رسوبات کلسیم ماتریکس خارج سلولی را نشان می‌دهد. جهت اندازه‌گیری میزان کلسیم موجود در ماتریکس خارج سلولی، سلول‌های بنیادی مزانشیم تمایز نیافته‌ی پاساژ سوم به‏تعداد 10⁴×1 در هر ویال پلیت 24 خانه، با کمک فرمالدئید 10 درصد به‏مدت 10 دقیقه فیکس شدند و پس از شستشو با PBS، 500 میکرولیتر نیترات نقره (Sigma Chemical) 1/0 درصد به سلول‌ها اضافه شد و در انتها، بررسی سلول‌ها با میکروسکوپ فلورسانس (Olympus, IX70) انجام شد (15).

بررسی سنتز پروتئین‌های استئوکلسین و استئوپونتین به‏روش ایمونوسیتوشیمی:ابتدا 10⁴×1 سلول در هر خانه از پلیت 12 خانه ریخته و به‏مدت 21 روز سلول‌ها در گروه­های مذکور، تیمار شد. پس از 21 روز سلول‌ها در پارافرمالدهید فیکس و پس از شستشو با PBS، جهت افزایش نفوذپذیری، سلول‌ها با 10 دقیقه با Triton-x100 (T8532, Sigma) 25درصد انکوبه شد. سپس سلول‌ها با سرم آلبومین گاوی (BSABovine Serum Albumin) 1 درصد در PBST (1/0 درصد PBS-Tween) ( Phosphate Buffered Saline Tween) به‏مدت 30 دقیقه انکوبه شد. در ادامه آنتی بادی اولیه رقیق شده در BSA 1 درصد و PBST (آنتی‌بادیپلی‌‍‌کلونال استئوپونتین از شرکت (ab8448, ABCAM  با رقت 1:250 و آنتی‌بادی مونوکلونال موشی استئوکلسین (شرکت ab13418, ABCAM و با رقت 1:1000) به‏مدت 4 ساعت، روی سلول‌ها قرار داده شد و پس از آن آنتی بادی ثانویه خرگوش (هر دو نوع آنتی‌بادی 555Alexa Fluor®-United Kingdom و با رقت 1:500) در دمای 4 درجه سانتی‌گراد روی سلول‌ها ریخته شد. سپس رنگ­آمیزی هوخست u/μl) 1-1/0) صورت گرفت (16) و با میکروسکوپ فلورسانس عکس‌برداری انجام شد.

استخراج RNA و آنالیزRT-PCR

کشت سلولی و جداسازیRNA: در این مرحله سلول‌ها به‏تعداد 10²×5 در فلاسک‌های T شکل ‫Cm²25 کشت و به‏مدت 21 روز با محیط استئوژنیک و غلظت 250 نانومولار بیسفنولA کشت و تیمار شدند و سپس با کمک اسکالپر، سلول‌ها از کف فلاسک تراشیده و به اپندورف منتقل شدند. سلول‌ها در ازت مایع به فریزر80- درجه سانتی‌گراد انتقال یافتند. جهت جداسازی RNAاز این سلول‌ها از کیتRNeasy mini kit (Qiagen)  و بر طبق دستوالعمل کارخانه سازنده استفاده شد و به‏منظور سنجش میزان RNA استخراج شده از دستگاه اسپکتروفتومتر استفاده شد و پس از صفر کردن دستگاه توسط آب دیونیزه به‏عنوان blank، 3 میکرولیتراز نمونه با 97 میکرولیتر آب دیونیزه رقیق و پس از وارد کردن ضریب رقت، مقدار RNA  استخراج شده و همچنین نسبت بین جذب در طول موج‏های 260 و 280 ثبت شد. تمامی مراحل در زیر هود لامینار صورت گرفت.

سنتز (reverse transcription reaction) c-DNA: ابتدا 2 میکرولیتر از عصاره سلولی حاوی RNA (با غلظتμg/μl  5/0) برداشته شد. به‏هرکدام از اپندورف‌ها 1 میکرولیتر پرایمر oligo dT₁₈ اضافه و حدود 3-5 ثانیه نمونه را ورتکس شد. سپس نمونه‌ها به‏مدت 5 دقیقه در 70 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد و پس از آن روی یخ نگه‏داشته شد. در ادامه 4 میکرولیتر 5x reaction buffer، 1 میکرولیتر مهارکنندهu/μl) 20) RNase Ribo Lock، 1 میکرولیتر از مخلوط dNTP به‏نمونه‌ها اضافه شد. پس از یک ورتکس کوتاه، 2 میکرولیتر آنزیم رونویسی معکوس u/μl) 20) M-MuLV به اپندورف‌ها اضافه و به‏مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‌گراد قرار داشته شد و جهت متوقف کردن واکنش، نمونه‌ها در دمای 70 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد. در پایان نیز اپندورف‌ها در دمای 20- درجه سانتی‌گراد نگه‏داری شد.

واکنش زنجیره پلی‌مراز (PCR):واکنش RT-PCR در حجم 25 میکرولیتر و با دمای آنیلینگ برابر با 58 درجه سانتی‌گراد، در 35 سیکل صورت گرفت و از ژنGAPDH  (Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase) به‏عنوان کنترل داخلی استفاده شد. توالی پرایمر ژن‏های مورد نظر در جدول 1 آورده شده است.

جدول 1: توالی پرایمرهای استفاده شده در این مطالعه

آنالیز آماری

داده‌های به‏دست آمده با استفاده از آزمون آماری One-Way ANOVA، تست Tukey و همچنینT-Test ، تجزیه و تحلیل و تفاوت میانگین‌ها در سطح 05/0>p معنی‌دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی سلول­ها و انتخاب غلظت موثر

از مقایسه روند میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغزاستخوان تیمارشده با غلظت‌های مختلف بیسفنول A، پس از‌ 21 روز، در شرایط وابسته به غلظت، نسبت به گروه کنترل، کاهش معنی‌داری مشاهده شد (05/0>p) (نمودار 1) (شکل1، C-D).

نمودار 1: میانگین میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت پس ازتیمار با غلظت‌های مختلف بیسفنول A در روز 21.

میانگین‌های با کد حرف‌های مختلف دارای تفاوت معنی‌دار هستند (one way ANOVA,Tukey^,s test, p<0.05).

با توجه به نتایج حاصل از میزان معدنی شدن ماتریکس استخوانی سلول‌ها، غلظت 250 نانومولار بیسفنولA طی 21 روز، به‌عنوان غلظت موثر انتخاب شد و مطالعه با دو گروه کنترل و تیمار با بیسفنول A (250 نانومولار) ادامه یافت.

بررسی رسوب کلسیم به روش وان­کوزا  (Von Kossa)

مقایسه تصاویر حاصل از بررسی میزان رسوب کلسیم ماتریکس خارج سلولی توسط رنگ­آمیزیVon Kossa  پس از 21 روز در گروه سلول‌های تیمار شده با 250 نانومولار بیسفنولA، کاهش قابل توجه سطح رسوب کلسیم را نسبت به‏گروه کنترل نشان داد (شکل1،A-B ). (در رنگ‌آمیزی آلیزارین ‌رد، رنگ قرمز نشان‏دهنده معدنی شدن ماتریکس استخوانی در سلول‌های تمایز یافته به استئوبلاست و در رنگ‌آمیزی وان‌کوزا، ندول‌های قهوه‌ای رنگ، نشان‌دهنده رسوبات فسفات کلسیم حاصل از معدنی شدن ماتریکس خارج سلولی درسلول‌های تمایز یافته می‌باشند).

شکل1: رنگ‌آمیزی سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت با نیترات نقره (وان‌کوزا) (AوB) (بزرگنماییx200) و رنگ آلیزارین‌رد (C, D) (بزرگنمایی10x).A, C) گروه سلول‌های کنترل. B, D) سلول‌های تیمارشده با 250 نانومولار بیسفنول A.

ایمنوسیتوشیمی

از مقایسه رنگ‌آمیزی ایمنوسیتوشیمی،کاهش قابل توجهی در میزان سنتز پروتئین‌های استئوکلسین و 

استئوپونتین درگروه سلول‌های تیمارشده بابیسفنولA  نسبت به گروه کنترل مشاهده شد (شکل2).

شکل2: ایمنوسیتوشیمی، ]پروتئین‌های استئوکلسین A). گروه کنترل B). گروه سلول‌های تیمارشده با 250 نانومولار بیسفنولA . به‌مدت 21 روز، (بزرگنماییx400)[ و ]استئوپونتینC ) گروه کنترل D) گروه سلول‌های تیمارشده با بیسفنولA، (بزرگنماییx200) [چنانچه مشاهده می‌شود از مقایسه میزان سنتز پروتئین‌های مذکور در گروه سلول‌های تیمارشده با بیسفنول A نسبت به گروه کنترل، کاهش قابل توجهی دیده شد.

آنالیز کیفی سطح بیان ژن‌های استئوکلسین و استئوپونتین

بررسی میزان سطح بیان ژن‌های استئوکلسین و استئوپونتین توسط آنالیزRT-PCR در گروه سلول‌های   تیمار شده با بیسفنولA نسبت به گروه کنترل، کاهش قابل توجهی را نشان داد (شکل3).

شکل3: آنالیزکیفی سطح بیان ژن‌‍‌های استئوکلسین و استئوپونتین در سلول‌های بنیادی مزانشیم مغز استخوان رت، 21 روز پس از تیمار با بیسفنول A با استفاده از تکنیک RT-PCR. A) گروه کنترل. B)گروه سلول‌های تیمارشده با بیسفنول A (250 نانومولار)، نشان‌دهنده کاهش قابل توجه سطح بیان ژن‌های مذکور نسبت به گروه کنترل می‌باشد. ژن GAPDH به‏عنوان کنترل داخلی در نظر گرفته شده است.