مقدمه

شناخت جنبه‏های ژنتیکی و ژن‏های عمده تاثیرگذار بر تولید گوشت اخیرا مورد توجه محققان ژنتیک و اصلاح نژاد قرار گرفته است. مطالعات برای یافتن ژن‏های به‏وجود آورنده ماهیچه مضاعف در گاوهای گوشتی منجر به کشف ژن میوستاتین شد که به‏عنوان ژن کاندیدا برای صفت تولید گوشت بررسی و نقش آن در نژادهای مختلف دام و طیور و حتی انسان شناخته شده است.

مطالعات مولکولی ژن میوستاتین نشان داده که این ژن چند شکل می‏باشد (1و2و3). میوستاتین مهار کننده رشد ماهیچه‏های اسکلتی می‏باشد و اگر جهشی در ژن کد کننده میوستاتین اتفاق افتد، باعث تغییر نقش مهاری آن و افزایش عضله می‏شود (1و4و5). با استفاده از تعیین نقشه فیزیکی کلون‏های یاک مشخص شد که ژن میوستاتین گاو نزدیک سانترومر کروموزوم شماره 2 قرار دارد و جایگاه آن در گونه‏های مطالعه شده از جمله خوک، گاومیش، مرغ و موش خانگی مشخص شده است (6). ژن میوستاتین گاوی دارای 3 اگزون و 2 اینترون می‏باشد. میوستاتین باعث میانجیگری بیان ژن در کنترل شکل فیبری ماهیچه است و با جلوگیری از تکثیر میوبلاست‏ها، عملا رشد عضلانی را متوقف می‏کند. این عمل میوستاتین به‏طور عمده به رشد ماهیچه‏ها پیش از تولد، یعنی زمان تکثیر و تمایز میوبلاست‏ها برمی‏گردد و انتظار می‏رود چنانچه جهشی بتواند باعث کاهش mRNA میوستاتین گردد، رشد عضلانی بیشتری در حیوان مشاهده شود (1). علائم مختلفی برای تشخیص بین حیوانات با فنوتیپ ماهیچه مضاعف و حیوانات طبیعی مورد استفاده قرار گرفته است، از جمله DM یا D ,N یا DM ,N. فنوتیپ DM با هایپرتروفی ماهیچه‏ها مشخص شده است. در این حیوانات اندام‏های خلفی به‏صورت گرد و برجسته هستند و ماهیچه‏ها حالت بیرون زدگی دارند و خطوط آشکاری در زیر پوست قابل دیدن است. از دیگر مشخصه‏های فیزیکی آشکار می‏توان به استخوان‏های ظریف، دستگاه تناسلی نابالغ و زبان بزرگ در گوساله‏های تازه متولد شده اشاره کرد. حیوانات با فنوتیپ ماهیچه مضاعف دارای استخوان و چربی کمتر و ماهیچه بیشتری هستند و نسبت قسمت‏های ارزشمند گوشت بیشتری هستند و نسبت قسمت‏های ارزشمند گوشت بیشتر است. از معایب ماهیچه مضاعف می‏توان به کاهش باروری، کاهش بقای گوساله‏ها، افزایش حساسیت به استرس و بیماری‏های تنفسی اشاره نمود (7). علی‏رغم آنچه گفته شد ماهیچه مضاعف ارتباطی با دو برابر شدن ماهیچه‏ها ندارد، اما به نسبت یک افزایش در تعداد فیبرهای ماهیچه‏ای (هیپرپلازی) و طویل شدن فیبرها (هایپرتروفی) را ایجاد می‏کند. در گاوهای ماهیچه مضاعف تعداد فیبرهای ماهیچه‏ای در زمان تولد دو برابر گاوهای عادی است. گاوهای ماهیچه مضاعف دارای درصد بیشتری از فیبرهای ماهیچه‏ای سفید هستند و مقدار کلاژن کمتری دارند. همچنین گزارش شده که گاوهای با ماهیچه مضاعف دارای بافت‏های همبند کمتری هستند که می‏تواند به افزایش تردی گوشت کمک کند. این نکته را باید متذکر شد که علاوه بر نژاد، تغذیه و جنس نیز فنوتیپ ماهیچه مضاعف را تحت تاثیر قرار می‏دهند (8). حیوانات ماهیچه مضاعف گوشت ظریف‏تر و ترد تری تولید می‏کنند. همچنین گوشت حیوانات ماهیچه مضاعف به‏طور معنی‏داری حاوی مقدار چربی کمتری است. این ویژگی‏ها به‏طور زیادی منطبق با استانداردهای سلامتی است (9). ژن میوستاتین بیشتر در گاو مورد مطالعه قرار گرفته است و در گوسفند کمتر مورد بررسی قرار گرفته است. تحقیقی (10) در گوسفند نژاد تکسل انجام شد. در این تحقیق ناحیه ژن میوستاتین بر روی کروموزم شماره 2 گوسفند جهت شناسایی ژن کاندیدا برای صفات لاشه مورد بررسی قرار گرفت. در این پژوهش از 8 نشانگر میکروساتلایت جهت تعیین ژنوتیپ استفاده شده و در نهایت آنالیز آماری بر روی داده‏ها صورت گرفت. نشانه‏ای از ژن کاندیدا برای سرعت رشد یا صفات لاشه به‏دست نیامد. اما، در مورد صفت چربی و ماهیچه ران وجود ژن کاندیدا برای افراد هتروزیگوت واقع بین نشانگرهای BULGE20 , BM81124 ثابت شد ولی در مورد افراد هموزیگوت چنین چیزی مشاهده نشد. بر روی گوسفندان بلوچی ایستگاه عباس آباد مشهد با استفاده از تکنیک PCR-SSCP چند شکلی ژن میوستاتین را بررسی کردند (1). 11 جفت آغازگر جهت انجام واکنش‏های PCR با استفاده از توالی ژن میوستاتین گاو و بخشی از آن در گوسفند طراحی شد. این 11 آغازگر تقریبا تمامی طول ژن میوستاتین گوسفند را پوشش می‏دادند. نتایج حاصل از تکثیر 6 آغازگر نشان داد که توالی ژن میوستاتین در این جمعیت بسیار حفاظت شده می‏باشد، در مورد 2 آغازگر دیگر و دقت در الگوی باندی آن‏ها به این نکته اشاره شد که جهشی تک نوکلئوتیدی و یا حذف و اضافه در یک محدوده معین ژن اتفاق افتاده است. گوسفند فراهانی یکی از توده‏های دو منظوره تولید پشم و گوشت می باشد و اکثرا به‏صورت سنتی پرورش داده می شوند. مناطق پرورشی همان‏طوری که از اسم گوسفند فراهانی برمی آید، در اکثر نقاط استان مرکزی و به‏ویژه منطقه فراهان، محلات، خمین، شازند (سربند)، دلیجان و ساوه می‏باشد. به‏طور کلی آمار موجود گوسفندان استان مرکزی در حدود 2 میلیون راس می باشد که 30 درصد آن‏ها گوسفند فراهانی است (11).

مشخصات نژادی اندازه‏گیری‏ها در سال 1388 توسط معاونت امور دام و با مشارکت بخش خصوصی تعیین و ثبت گردیده است: رنگ بدن این گوسفندان سفید نخودی است، پوزه‏ها و دور چشم ها و 4 قلم پا دارای لکه سیاه رنگ است، روی بینی در میش صاف و در قوچ دارای انحنا می‏باشد، جنس ماده فاقد شاخ است، دنبه‏ها در انتها گردو دارای شکاف کوچک به‏همراه دنبالچه در راس می باشد. پشم به حالت کوفته و ضخیم و مناسب قالیبافی است. نوع بهره این دام پشم و گوشت است نسبت بره‏زایی 97 درصد می‏باشد. هدف از انجام تحقیق حاضر شناسایی ژنوتیپ‏های ژن میوستاتین و فراوانی آلل‏های آن برای اولین بار در گوسفند نژاد فراهانی به‏کمک روش PCR- RFLP و تعیین میزان چند شکلی در جمعیت گوسفندان فراهانی بود.

مواد و روش‏ها

جهت انجام تحقیق، نمونه‏های خون از 86 راس گوسفند فراهانی در سطح استان مرکزی به‏دست آمد. پس از ریختن نمونه‏های خون تام در لوله‏های حاوی ضد انعقادEDTA ، لوله‏ها به‏مدت 3 تا 4 روز در دمای 2 تا 8 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند تا دیواره گلبول‏های سفید برای استخراج بهتر DNA نازک گردند. استخراج DNA پس از تغییر و بهینه‏سازی روش استخراج نمکی (12) به‏شرح زیر انجام شد؛ 4 میلی‏لیتر خون کامل داخل لوله‏ای پلاستیکی موسوم به فالکون ریخته شد. دو برابر حجم خون، بافر جدا کنندهx-100 1%, 10mM Tris-HCI pH = 7.5, 5mM) MgCl₂, 0.32 M Sucrose, Triton) اضافه گردید و سپس ورتکس شد. محلول فوق به‏مدت 5 دقیقه با سرعت 7000 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی به آرامی جدا و رسوب حاصله نگه داشته شد. 3 میلی‏لیتر بافر جدا کننده به رسوب حاصله اضافه و عمل سانتریفوژ و جداسازی رسوب تکرار شد تا زمانی‏که یک رسوب کاملا سفید حاصل شد. 3 میلی‏لیتر بافر لیز کننده (pH = 8.2- 400 mM NaCl, 2mM Na₂EDTA, 10mM Tris-Hcl به رسوب اضافه و به‏خوبی ورتکس شد. مقدار 200 میکرولیتر  SDS (Sodium Dodecyl Sulfate)ده درصد و 350 میکرولیتر آنزیم پروتئیناز- k (با غلظت 50 میکروگرم بر میلی‏لیتر) به محلول حاصله اضافه شد و در دمای 37 درجه سانتی‏گراد در حمام آب گرم قرار داده شد تا هضم محتویات هسته گلبول‏های سفید کامل گردد. یک میلی‏لیتر محلول NaCI  اشباع (حدود 6 مولار) به محلول اضافه گردید و سپس محلول به‏مدت 15 ثانیه به‏شدت تکان داده شد. محلول مزبور به مدت 15 دقیقه با سرعت 2500 دور در دقیقه سانتریفوژ شد. مایع رویی به یک لوله پلاستیکی استریل دیگر انتقال داده شد. در این مرحله پروتئین‏های اتصالی به اسیدهای نوکلئیک همراه با نمک در انتهای لوله رسوب سفید رنگی تشکیل دادند. هم حجم محلول، کلروفرم اضافه شد. و با تکان دادن با محلول مخلوط شد. سپس به‏مدت 10 دقیقه در 3000 دور در دقیقه سانتریفیوژ گردید. آلودگی‏ها و پروتئین اضافی در این مرحله جدا شدند. فاز آبی که در بالا تشکیل شد حاوی DNA بود که با احتیاط جدا و به لوله پلاستیکی جدیدی انتقال داده شد. برای متراکم‏ترنمودن رشته‏های DNA، به اندازه 1/0 حجم محلول استات سدیم 3 مولار (2/5 = pH) اضافه شد. دو برابر حجم محلول به‏دست آمده، اتانول مطلق اضافه شد و لوله به آهستگی چند بار وارونه شد تا رشته‏های DNA ظاهر شدند. کلاف DNA با میله شیشه‏ای که دارای بار مثبت می‏باشد جمع آوری شد و به‏مدت حدود 5 تا 10 دقیقه در مجاورت هوا خشک شد. DNA حاصله دو بار با اتانول 70 درصد شستشو داده شد و نهایتا در 100 تا 200 میکرولیتر از بافر TE (pH = 7.5- Na₂EDTA 10 mM TrisHCL, 0.2mM) حل گردید. تیوب‏های حاوی DNA‏، به‏مدت 2 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند تا DNA به‏خوبی حل شود. سپس در دمای 20- درجه سانتی‏گراد ذخیره شدند.

تعیین کیفیت و کمیت DNA:با استفاده از روش الکتروفورز مقایسه‏ای بر روی ژل آگارز  با استفاده از مقادیر مشخصی DNA فاژ لامبدا انجام شد. جهت انجام واکنش زنجیره‏ای پلیمر از کیت PCR Master (شرکت سینا ژن) در حجم نهایی 25 میکرولیتر و یک جفت پرایمر با توالی زیر استفاده گردید (13).

5' – CCGGAGAGACTTTGG GCTTGA-3'

5' – TCATGAGCACCCACAGCGGTC-3'

واکنش زنجیره‏ای پلیمراز با برنامه حرارتی زیر در دستگاه ترموسایکلر انجام شد؛ واسرشت سازی اولیه DNA به‏مدت 1 دقیقه و 94 درجه سانتی‏گراد، انجام 33 سیکل با واسرشت سازی DNA طی 30 ثانیه و 94 درجه سانتی‏گراد، اتصال آغازگر به DNA طی 60 ثانیه و 58 درجه سانتی‏گراد و بسط آغازگر طی 2 دقیقه و 72 درجه سانتی‏گراد و بسط انتهایی 2 دقیقه و 72 درجه سانتی‏گراد. جهت مشاهده محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز، از ژل آگارز 1 درصد ولتاژ 80 ولت به‏مدت 1 ساعت استفاده شد و رنگ‏آمیزی ژل با اتیدیوم بروماید انجام گرفت. سپس محصولات واکنش زنجیره‏ای پلیمراز به‏کمک آنزیم برشی HaeIII مورد هضم آنزیمی قرار گرفتند.

برای مشاهده قطعات هضم شده از ژل آکریل‏آمید 8 درصد و ولتاژ 200 به‏مدت 2 ساعت استفاده شد و بعد از رنگ‏آمیزی با اتیدیوم بروماید، ژل اسکن شد و خواندن آلل با استفاده از نرم افزارUvdoc  صورت گرفت. برای برآورد فراوانی آلل‏ها، محاسبه هتروزیگو‏سیتی و آزمون مربع کا (X²) از نرم افزار POP Gene 3.2 استفاده گردید.

نتایج

استفاده از روش استخراج نمکی جهت استخراج DNA از نمونه خون برتری خوبی را از لحاظ کمیت و کیفیت و صرف زمان لازم در استحصال DNA نشان داد (شکل 1). تکثیر قطعه 337 جفت بازی از ژن میوستاتین به‏کمک واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای اختصاصی به‏خوبی صورت گرفت و در نتیجه استفاده از برنامه حرارتی مناسب، آغازگرهای اختصاصی و شرایط خوب آزمایشگاهی که فراهم شد قطعه 337 جفت بازی بدون قطعات غیراختصاصی به‏دست آمد (شکل2) که با نتایجی که بر روی انسان، گاو، گوسفند و بز مطابقت داشت (13).

شکل 1: نمونه­های تصادفی DNA (چاهک‏های شماره 1 تا 7)  استخراج شده بر روی ژل آگارز از خون گوسفند نژاد فراهانی

شکل 2: نمونه‏ای از محصولات PCR  بر روی ژل آگارز. M مارکر وزن مولکولی و چاهک‏های شماره 1 تا 10 محصولات واکنش PCR از 10 نمونه تصادفی است.

شکل3: نمونه‏ای از محصول هضم آنزیمی بر روی ژل آکریل‏آمید. M الل غالب و m الل مغلوب است. MM معرف فرد هموزیگوت غالب، mm فرد هموزیگوت مغلوب و Mm فرد هتروزیگوت است. چاهک سمت چپ: مارکر وزن مولکولی. 

گوسفندان با ژنوتیپ هتروزیگوت (Mm) دارای قطعات 83، 123، 131 و قطعه برش نخورده 337 جفت بازی بودند (شکل 3). در هموزیگوت غالب (MM) قطعه 337 جفت بازی بدون برش باقی ماند. در هموزیگوت مغلوب (mm) نیز قطعات 83، 123و 131 جفت بازی مشاهده شد (شکل 3). بعد از برآورد فراوانی آلل‏ها، محاسبه هتروزیگوسیتی و آزمون مربع کا (X²) با استفاده از نرم افزار PopGene مشخص گردید که آلل m دارای بیشترین فراوانی (89/0) و آلل M دارای کمترین فراوانی (11/0) بودند (جدول 1).

جدول 1: فراوانی‏های ژنی و ژنوتیپی و تعادل هاردی- وینبرگ. M الل غالب و m الل مغلوب است. MM معرف فرد هموزیگوت غالب، mm فرد هموزیگوت مغلوب و Mm فرد هتروزیگوت.