Document Type : Research - Scientific
Authors
1 PhD student. Department of Biotechnology, University Campus 2 - University of Guilan ,Khalij Fars highway (5th kilo meter of Ghazvin road, Rasht, Iran
2 2. Faculty of Agricultural Sciences, University of Guilan, Khalij Fars highway (5th kilo meter of Ghazvin road(, Rasht, Iran
3 Department of Biotechnology,Institute of Sciences and High Technology and Environmental Sciences, Graduate University of Advanced Technology, End of Haft Bagh-e-Alavi Highway, Kerman, Iran.
4 Faculty of basic sciences, Department of plant biology, University of jiroft. km 8 Bandar Abbas Road, kerman , Iran.
Abstract
Aims: This study was aimed to investigate the anti-proliferative effects of hydroalcoholic extract of Blepharis persica seed and its synergy effect with doxorubicin on human breast cancer and prostate cancer cell lines.
Materials and Methods: hydroalcoholic extract of seed was prepared using maceration, and ethanol%70. Eight concentrations of extract and four concentrations of combined with doxorubicin (125, 62.5ngr/ml) and extract (0.625, 0.315mg/ml) were prepared. MCF7, LNCaP and SKM cell lines were cultured .Cell viability was evaluated by MTT assay after 24h. To show apoptosis inductionof breast and prostate cancer cell death by extracts, Annexin/PI test were performed. BCL2 gene expression was analyzed using Real-Time RT-qPCRfor 24,48h.
Results: The highest effects of growth inhibition were observed in the prostate, breast and fibroblast cell lines with extract, respectively. The combined effect of doxorubicin with extract in three cell lines in comparison with control did not show any significant difference. The results of Annexin / PI indicated that the percentage of initial apoptosis, delayed apoptosis and necrosis in treated cells increased compared to control. BCL2 expression in cell lines decreased significantly over 24 and 48 h compares to control(p < 0.01).
Conclusion: hydroalcoholic extract of B.persica seed has ability to inhibit the proliferation of cancer cell lines as well as the induction of apoptosis in cancer cells, compared with using it with doxorubicin, although the extract did not have any synergy effect with doxorubicin at lower concentrations, it can be a substituted for this kind of drug with fewer side effects.
Highlights
-
Keywords
مقدمه
سرطان بهعنوان یکی از کشندهترین عوامل مرگ و میر در دنیا، سالیانه بیش از 5/7 میلیون نفر را در به کام مرگ میکشاند (1). بر اساس پیشبینی سازمان بهداشت جهانی بروز سرطان در ایران تقریبا 86000 نفر در سال 1399 شمسی خواهد بود که میزان مرگ و میر ناشی از آن حدود 63000 مورد خواهد رسید (2 و 3). درکشورهای در حال توسعه سرطان پستان از جمله شایعترین سرطانها در بین زنان است (4). این سرطان از عوامل اصلی به خطر انداختن سلامتی در میان زنان است و اولین عامل مرگ و میر بر اثر سرطان در بین زنان محسوب میشود (5). بر اساس آمار وزارت بهداشت، درمان و آموزش پزشکی در سال 1392 بیش از 40000 نفر در ایران دچار این بیماری شدهاند و بر این تعداد هر ساله افزوده میشود (6). از سوی دیگر پروستات یکی از غدد مهم دستگاه تولید مثل در مردان است و بیماریهای ناشی از آن دارای اهمیت فراوانی هستند (7). سرطان پروستات شایعترین سرطان بدخیم در میان مردان است، بیشترین مورد بروز سرطان در مردان (حدود 28 درصد) و دومین عامل مرگومیر (حدود11 درصد) را بهخود اختصاص داده است. فاکتورهای ژنی و عوامل محیطی از مهمترین فاکتورهای هستند که در بروز سرطان سینه و پروستات نقش دارند، از طرف دیگر عواملی محیطی مانند رژیم غذایی، نحوه زندگی، شرایط جغرافیایی، عوامل استرسزا، سن و چاقی در بروز این بیماری دخیل هستند (11-8). متخصصین بالینی از روشهای متعددی در تشخیص و درمان انواع سرطانها استفاده میکنند که شیمی درمانی، پرتو درمانی، جراحی و هورمون درمانی عمدهترین آنها هستند ولی مهمترین روش مبارزه با سرطان، شیمیدرمانی است که عوارض جانبی زیادی از جمله خستگی، حالت تهوع و ریزش مو و غیره را برای بیمار ایجاد میکند، این عوارض میتواند بر روی کیفیت زندگی بیمار تاثیر زیادی داشته باشد (12و13). داروی دوکسوروبیسین با نام تجاری آدریامایسیین یکی از قویترین و اصلیترین داروهای شیمی درمانی گروه آنتراسیکلین است. این دارو در درمان بسیاری از سرطانها نظیر معده، پستان، ریه، تخمدان، استخوان، بیماری هوچکین و سرطان خون مورد استفاده قرار میگیرد، این دارو همانند دیگر داروهای شیمی درمانی دارای عوارض جانبی بسیار زیادی است که میتوان به تب، مسمومیت قلبی و غیره اشاره کرد (16-14). چندین مکانیسم برای اعمال خاصیت سمیت این دارو در نظر گرفته میشود که مهمترین آنها آسیب به DNA میباشد. دوکسوروبیسین با پایداری اتصال کمپلکس آنزیم توپوایزومراز II به DNA از اتصال مجدد رشتههای شکسته شده جلوگیری میکند. آسیب به DNA بهعنوان یک محرک سلولی باعث فعال شدن پروتئینهای مسیر آپوپتوزیس میشود (17). پروتئینهای خانواده BCL2، یک گروه از تنظیم کنندههای داخل سلولی آپوپتوزیس یا مرگ برنامهریزی شده سلول هستند. تعدادی از پروتئینها خانوادهBCL2، پروآپوپتوتیک هستند یعنی آپوپتوزیس بهوسیله افزایش بیان این پروتئینها راه اندازی میشود و BAX جز این گروه است. تعداد دیگری از پروتئینهای خانواده BCL2آنتیآپوپتوتیک هستند یعنی آپوپتوزیس بهوسیله مهار آزادسازی این پروتئینها بازداری میشود مانندBCL2 که بهطور گسترده در سطح غشا خارجی میتوکندری وER غشا هسته واقع شدهاند و تمامیت غشا را حفظ میکنند (20-18). تحقیقات زیادی در مدت بیش از بیست سال بر روی مرگ برنامهریزی شده سلول یا آپوپتوزیس پوپتورصورت گرفته است و در نتیجه این تحقیقات ثابت شده است که مرگ برنامه ریزی شده سلول بهعنوان یک مانع طبیعی رشد سرطان میباشد، ترکیبات طبیعی موجود در گیاهان با تاثیر بر روی مسیر آپوپتوزیس سلولهای سرطانی میتوانند بهعنوان یک ترکیب ضد توموری شناخته شوند (21).
جنس Blepharis دارای 100 گونه گیاهی است که در مناطق گرمسیری و نیمه گرمسیری رشد میکند. گیاه خارسنبل از جنس Blepharisبا نام علمی Blepharis persica شناخته میشود (22). گونه مشابه این گیاه، B.edulis است که در بیابانهای خاورمیانه و آفریقا رشد میکند (23). خارسنبل گیاهی است چندساله و کم ارتفاع، دارای برگ بیضی و میوه کپسولی است. ریشه آن مدر است و برگهای آن دارای خاصیت بند آوردن خون هستند. در حال حاضر تحقیقات زیادی بر روی این گیاه انجام نشده است و اطلاعات کمی از خواص و فواید دارویی این گیاه وجود دارد (24). با توجه به آنکه گیاهان دارای اثرات ضد توموری از جمله القای آپوپتوزیس و مرگ سلولهای سرطانی هستند و عوارض جانبی از استفاده آنها کمتر است و همچنین این گیاه در مناطق بومی جنبه دارویی دارد، در این تحقیق بر آن شدیم که در ابتدا اثرات ضدسرطانی عصاره بذر گیاه خارسنبل با کمک تست MTT (Dimethylthiazol-2-yl-2,5-diphenyltetrazolium bromide) بر روی ردههای سلولهای سرطانی سینه (MCF-7) و پروستات (LNCaP) سنجیده شود و با رده سلولی نرمال فیبروبلاست (SKM) بهعنوان گروه کنترل مقایسه شود و همچنین میزان القا آپوپتوزیس در ردههای سلولی با کمک روش فلوسایتومتری سنجش شود. ترکیب دارو دوکسوروبیسین و عصاره نیز مورد سنجش قرار گرفت و در پایان بیان ژن Bcl2 با کمک روش quantitative RT-PCR Real-Time برای هر یک از گروههای مورد مطالعه مورد سنجش قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
تهیه نمونه گیاهی:این تحقیق یک تحقیق بنیادی، کاربردی است. گیاه خارسنبل از مناطق جنوبی و گرمسیر استان کرمان در فصل بهار در سال 1396 از منطقه کهنوج با طول جغرافیایی 57 و عرض جغرافیایی 27 درجه و ارتفاع از سطح دریا 508 متر جمع آوری شد و بعد از تائید استاد گیاه شناسی ، گیاه در سایه و دمای محیط خشک شد و سپس بذرهای گیاه جدا شدند و تا زمان عصارهگیری در دمایی اتاق نگهداری شدند.
تهیه عصاره گیاهی: برای تهیه عصاره هیدروالکی از روش خیساندن (Macerate) و اتانول 70 درصد استفاده شد (25). ابتدا 40 گرم از بذر بهکمک دستگاه آسیاب کاملا پودر شد. پودر حاصل در 300 میلیلیتر الکل 70 درصد حل شد و بهمدت 72 ساعت روی دستگاه شیکر با دور متوسط در دمایی اتاق قرار داده شد. در مرحله بعدی کار با کمک کاغذ صافی واتمن 1 در مدت 30 دقیقه عصارههای صاف شد و جداسازی الکل با کمک دستگاه روتاری در خلا در دمای 45 درجه سانتیگراد و مدت 45 دقیقه صورت گرفت. در نهایت برای جداسازی کامل حلال از عصاره در داخل آون بهمدت 48ساعت در دمایی 45 درجه سانتیگراد قرار داده شدند. عصاره حاصل تا فرایند آزمایشگاهی در فریزر 20- سانتیگراد نگهداری شد .
تهیه غلظتهای مختلف عصاره و دارو: در این تحقیق از 8 غلظت عصاره هیدروالکلی بذر خارسنبل و 4 غلظت دارویی دوکسوروبیسین استفاده شد. بهمنظور تهیه 10 میلیلیتر استوک10 میلیگرم برمیلیلیتر عصاره هیدرو الکلی، ابتدا میزان 100 میلیگرم از عصاره نیاز است که این مقدار در 400 میکرو لیتر Dimethyl sulfoxide (DMSO) (4 درصد) حل شد، در ابتدا 1 میلیلیتر محیط کشت فاقد سرم اضافه شد و بعد از آن مابقی محیط کشت اضافه تا کاملا در عصاره حل شود. غلظتهای دیگر بهترتیب 5/7، 5 ، 5/2، 25/1، 625/0 ، 315/0و 156/0 میلیگرم بر میلیلیتر از استوک اصلی با کمک فرمول m1c1=m2c2 بهدست آمد. در این تحقیق از دارو دوکسوروبیسین 50 میلیگرم بر 25میلی لیتر بهصورت محلول با نام تجاریEbedoxo استفاده شد. ابتدا برای تهیه 7 میلیلیتر از استوک نانوگرم بر میلی لیتر 500 از این دارو 25/1 میکرولیتر از آن را در 400 میکرولیتر DMSOو محیط کشت بدون سرم بهصورت کم کم اضافه شد تا حجم محلول 7 میلیلیتر شود و از استوک به دست آمده غلطتهای 250 ، 125 و 5/62 نانوگرم بر میلیلیتر دارو تهیه شد. عصاره موجود و دارو را قبل از رقت سازی با فیلتر سررنگی 22/0میکرومتر فیلتر شدند. در این تحقیق همچنین اثر ترکیبی دارو دوکسوروبیسین در غلظتهای کم (125و 5/62 نانوگرم برمیلی لیتر با غلظتهای کم عصاره (625/0 و 315/0 میلی گرم بر میلی لیتر) مورد سنجش قرار گرفت .
کشت سلولی : در این پژوهش، سه رده سلولهای سرطانی سینه (MCF7)، پروستات (LNCaP) و فیبروبلاست ((SKM در داخل فلاسک 25 سانتیمتر مربع بهصورت کشت شده از انستیتو پاستور ایران خریداری شدند. سلولهای سرطانی در محیط کشت 1640 RPMI و سرم جنینی گاو FBS 10 درصد بههمراه 1 درصد آنتی بیوتیکهای استرپتومایسین و پنیسیلین کشت داده شدند و هر سه رده سلولی را در انکوباتور 5 درصد CO2 و دمای 37 درجه سانتیگراد کشت داده شدند. سلولهای نرمال فیبروبلاست در محیط کشتDMEM حاوی 10 درصد سرم FBS کشت داده شدند. سلولهای سرطانی سینه و پروستات بعد از ده مرحله پاساژ منظم و سلولهای فیبروبلاست بعد از 5 مرحله پاساژ آماده تیمار با غلظتهای مختلف عصاره، دارو و ترکیب غلظت کمدارو و عصاره شدند.
تست تترازولیومMTT: ردههای سلولی در فلاسک 25 سانتیمتر مربع به صورت مجزا کشت داده شدند و بعد از چند پاساژ به فلاسک 75 سانتیمتر مربع انتقال داده شدند و در انکوباتور 5 درصد CO2 و دمای 37 درجه سانتی گراد کشت داده شدند. بعد از شمارش سلولی به میزان 100 میکرولیتر شامل تقریبا 7000 سلول از سوسپانسیون سلولی در پلیتهای 96 خانه ریخته شدند و بهمدت 24 ساعت در انکوباتور حاویCO2 و دمای 37 درجه سانتیگراد بهمنظور چسبیدن و رشد سلولها به کف پلیت قرار داده شدند. سپس محیط کشت رویی سلولها خارج شد و محیط حاوی غلظتهای عصاره، دارو و ترکیب دارو با عصاره و همچنین محیط کشت فاقد سرم بهعنوان کنترل به سلولها اضافه شدند. بعد از 24 ساعت بههر یک از چاهکها به میزان 10میکرولیتر MTT(MELFORD ساخت اتگلستان ) اضافه شد و بعد از آنکه 4 ساعت در انکوباتور نگهداری شدند به هریک از چاهکها 150 میکرولیترDMSO اضافه شد و بعد از 30 دقیقه جذب سلولها توسط دستگاه الیزا ریدر در طیف جذب 490 و 630 خوانده شد و بر حسب فرمول مربوطه میزان زندهمانی محاسبه شد.
100 ×میانگین جذب سلول های تحت اثر ماده توکسیک- 1= درصد مهارکنندگی رشد
میانگین جذب کنترل منفی
درصد مهارکنندگی رشد -100= درصد بقا یا زندهمانی
بررسی مرگ برنامهریزی شده سلول توسط دستگاه فلوسایتومتری:جهت سنجش میزان آپوپتوزیس در رده سلولهای سینه، پروستات و سلولهای فیبروبلاست عصاره هیدروالکلی با غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر انتخاب شد و سلولهای تیمار شده و بدون تیمار (کنترل) از روش Annexin/PI با کیت تشخیصیKit I Pharmingen™, USA) (BD و با کمک دستگاه فلوسایتومتری (CYFlow شرکت partec G mbH ساخت آلمان) انجام گرفت. آزمایش به این صورت انجام شد که سلولهای سرطانی و فیبروبلاست با عصاره هیدروالکی 25/1 میلیگرم برمیلی لیتر در مدت 24 ساعت تیمار داده شدند و برای هر کدام از ردههای سلولی یک کنترل در نظر گرفته شد. سلولها با محلول نمکِ فسفات با خاصیت بافری (PBS) شستشو داده شدند. بعد از سانتریفیوژ سلولها، به رسوب حاصل بافر بایندینگ اضافه شد. سپس 5 میکرولیتر از رنگ annexin V اضافه میشود و بهمدت 15 دقیقه در دمای اتاق انکوبه شد و سلولها در مرحله بعدی با محلول بایندینگ شستشو داده شدند و در 10 ماکرولیتر رنگ PI به سلولها اضافه شد و در پایان کار آنالیز توسط دستگاه انجام شد.
بررسی بیان ژن BCL2: فرایند استخراجRNA کل از سلولهای سرطانی پستان، پروستات و سلولهای فیبروبلاست بدون تیمار و تحت تیمار عصاره هیدروالکلی 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر بذر خارسنبل بهمدت 24 و 48 ساعت و همچنین تحت تیمار ترکیب عصاره 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر با دارو 5/62 نانوگرم بر میلیلیتر انجام پذیرفت. ابتدا سلولهای تحت تیمار و کنترل از کف فلاسکهای 25 سانتیمتر مربع با کمک آنزیم تریپسین جدا شدند و برای مراحل استخراج آماده شدند. استخراجRNA با RNA-X PLUS انجام شد. بعد از استخراج کمیت و کیفیت RNA موجود با دستگاه اسپکتوفتومتری و ژل الکتروفورز مورد سنجش قرار گرفت.cDNA با کمک کیت سنتز (Takara ساخت ژاپن) با دستگاه Biometra GmbH) PCR ساخت آلمان (ساخته شد و توالی پرایمر رفت و برگشت ژنBCL2 و ژن کنترل داخلی بتااکتین با استفاده از نرمافزار Primer3 طراحی شده و بهمنظور اطمینان بیشتر از درصدGC ، دمای Tm و نداشتن دایمر با همدیگر، پرایمرها با برنامه ( Gene Runner نسخه 3.50 ( Hasting Software, Inc بررسی شدند (جدول1).
|
Primer |
Tm) C°) |
Primer sequence |
Product size (bp) |
|
β- actin |
64 |
F:GGACATCCGCAAAGACCTGTA R:ACATCTGCTGGAAGGTGGACA |
189 |
|
BCL2 |
61 |
F:GTGGATGACTGAGTACCTGA R:AGCCAGGAGAAATCAAACAGA |
119 |
جدول 1: توالی و طول محصولات آغازگرهای مورد استفاده
پس از طراحی، پرایمرها برای سنتز به شرکت FAZA Biotechسفارش داده شدند .محلولCYBR Green مخصوص فرایند Real time-qPCR از شرکت یکتا تجهیز آزما تهیه شد و بیان ژنهای مورد نظر بعد از تیمار با کمک دستگاه rotor-Gene RG-3000 )ساخت استرالیا و شرکت CORBETT Research) مورد سنجش قرار گرفت.
آنالیز آماری
با توجه با آنکه برای هر تیمار و کنترل در تستMTT ، 3 تکرار وجود داشت. ابتدا دادهها وارد اکسل شدند و سپس توسط نرمافزار SPSS 20 در طرح کاملا تصادفی آنالیزها انجام گرفت و از آزمون ANOVAیکطرفه برای مقایسه گروهها و آزمون دانکن برای آزمون تفاوت بین گروهها استفاده شد. تستهای مربوط به ژن BCL2 و ژن داخلی بتا اکتین برای هر نمونه سه تکرار در دستگاه rotor-Gene RG-3000 گذاشته شد و نتایج حاصل از بیان ژن برای بررسی اختصاصیت محصول تکثیر شده، منحنی ذوب مورد بررسی قرار گرفت و دادههای خام بهصورت Ct از دستگاه استخراج شد و با کمک فرمول ct ΔΔ نمونههای شاهد و تیمار بهدست آورده و نسبت ژن هدف به ژن مرجع بتااکتین را از طریق ct ΔΔ -2 محاسبه شد . نتایج حاصل از ct ΔΔ -2 برای سه تکرار به اکسل منتقل شد و با نرمافزار SPSS در سطح 5 و یک درصد میزان معنیدار شدن بیان ژن هدف مورد بررسی قرار گرفت.
نتایج
تست MTT
در این تحقیق تاثیر عصاره هیدروالکلی خارسنبل با 8 غلظت مختلف، 4 دوز دارو دوکسوروبیسین و ترکیب غلظت پایین عصاره با غلظت پایین دارو دوکسو روبیسین روی ردههای سلولهای سرطانی سینه، پروستات و سلول فیبروبلاست مورد بررسی قرار گرفت. نتابج با کمک روش MTT در سه تکرار به این شکل بود در هر سه رده سلولی تاثیر عصاره بر روی زندهمانی سلولها در سطح 1درصد و 5 درصد معنیدار بود. بهطوری که عصاره هیدروالکلی بذر گیاه خارسنبل در غلظتهای 10و 5/7 میلیگرم بر میلیلیتر به ترتیب بر روی ردههای سلولی پروستات و سینه و فبیروبلاست بیشترین تاثیر را داشت (شکل1)، غلظت 10 و 5/7 میلیگرم بر میلیلیتر در پروستات 64/85 و 29/82 درصد سمیت سلولی، در سرطان سینه 03/83 و 20/77 و در فیبروبلاست 68/74و 62/72 بازدارندگی رشد ایجاد کرده بود.
شکل 1: (a) سلول کنترل یا بدون تیمار فیبروبلاست، (b) سلول تحت تیمار فیبروبلاست غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر، (c) سلول کنترل یا بدون تیمار پستان، (d) سلول پستان تحت تیمار با غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر، (e) سلول کنترل یا بدون تیمار پروستات، (f) سلول پروستات تحت تیمار با 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر در 24 ساعت (بزرگنمایی x 100 ردههای سلولی )
میزان سمیت سلولی در غلظتهای بالا (10، 5/7، 5 ، 5/2 و 25/1) تفاوت معنیداری در سطح 1 درصد بر روی ردههای سلولهای سرطانی و فیبروبلاست نسبت به کنترل آنها وجود داشت. غلظت 15/0میلیگرم بر میلیلیتر هیچگونه سمیت سلولی نداشت ولی غلظت 315/0 و 625/0 میلیگرم بر میلیلیتر بر روی پستان، فیبروبلاست و پروستات با آنکه افزایش میزان سمیت سلولی مشاهده میشد ولی تفاوت معنیداری در سطح 5 درصد میزان سمیت سلولی تیمارها با کنترل دیده نشد (شکل 2).
شکل2: میزان سمیت سلولی غلظتهای مختلف(mg/ml) عصاره هیدروالکلی بذر خارسنبل بر روی ردههای سلولی سرطان پروستات (رنگ سبز)، فیبروبلاست (رنگ آبی) و سینه (قرمز) و تفاوت معنیدار در سطح 1درصد در اثر افزایش غلظت عصاره
نتایج نشان میدهد که با افزایش غلظت عصاره هیدروالکلی درصد زندهمانی هر سه رده سلولی کاهش یافته است. نتایج تست MTT در 4 غلظت دارویی دوکسوروبیسین بر روی دو رده سلولهای سرطانی سینه و پروستات دارای اثرات سمیت سلولی بوده و بقای سلولی را کاهش میدهد ، دوزهای500 و 250 نانوگرم بر میلیلیتر دارو در سرطان سینه و دوز 500 نانوگرم بر میلی لیتر در سرطان پروستات اثرات سمیت قابل توجهی داشتند، بهطوریکه بیش از 50 درصد سلولها را کشته بودند ولی اثر ترکیبی غلظت 125و 5/62 نانوگرم بر میلیلیتر دارو دوکسوروبیسین با دو غلظت 315/0و
625/0 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره بذر گیاه در هر سه رده سلولی با کنترل آنها هیچگونه تفاوت معنیداری را نشان نداد (شکل 3).
شکل3:DOX :تاثیر دوزهای مختلف داروی دوکسوروبیسین ، BPE: تاثیرغلظت کم اثر عصاره خارسنبل بر روی سرطان پستان و پروستات. BPE+DOX: اثرترکیبی غلظت کم عصاره خارسنبل و دوز پایین دارو بر روی دو رده سلولهای سرطانی
تست فلوسایتومتری
نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری در رده سلولهای پستان، پروستات و فیبروبلاست تیمار شده با عصاره هیدروالکلی با غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر و کنترل (بدون تیمار) بعد از 24 روز مورد سنجش قرار گرفتند. سلولهای کنترل پروستات، سینه و فیبروبلاست، بهترتیب میزان زندهمانی سلولها 46/84، 18/90، 28/92 و مقدار آپوپتوزیس اولیه 24/7، 57/4، 97/3 و درصد آپوپتوزیس تاخیری 14/5 ،32/4 ، 14/2 و درصد نکروزیس در سلولهای کنترل 15/1 ، 93/0و 61/1 نشان داده شد (شکل4).
شکل4: نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری :Q1= درصد میزان نکروز، Q2= درصد آپوپتوزیس تاخیری، Q3= درصد میزان سلولهای زنده، Q4= درصد سلولهای که وارد آپوپتوزیس اولیه شدند. سلولهای کنترل یا بدون تیمار (a) فیبرویلاست، (b) پستان و (c) پروستات، سلولهای تحت تیمار با غلظت 25/1 میلی گرم بر میلیلیتر در (d) فیبروبلاست، (e) پستان و(f) پروستات
باتوجه به آنکه سلولها تحت تیمار قرار نگرفته بودند میزان آپوپتوزیس و نکروزیس دیده شده در ردههای سلولی قابل قبول بودند. درصد زندهمانی سلولهای تحت تیمار با غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره هیدروالکلی خارسنبل در ردههای سلولی پروستات، پستان، فیبروبلاست بهترتیب 10/71 ،23/74 ،02/82 و میزان آپوپتوزیس اولیه 37/24، 20/15 ، 27/13، درصد آپوپتوزیس ثانویه بهترتیب 47/3 ، 28/7 و 48/3 و همچنین درصد نکروز در سلولهای تحت تیمار بهترتیب 06/1، 28/3 و 23/1 مشخص شد. نتایج نشان داد میزان درصد آپوپتوزیس اولیه، آپوپتوزیس تاخیری، مجموع کل آپوپتوزیس و نکروزیس دیده شده در ردههای سلولی تیمار شده نسبت به ردههای سلولی بدون تیمار افزایش داشته است.
نتایج بیان ژن BCL2 : استخراج RNA کل از سه رده سلولهای SKM، LNCaPو MCF-7 تحت تیمار در مدت 24 و 48 ساعت و ترکیبی عصاره هیدروالکلی 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر با دارو در مدت 24 ساعت و همچنین استخراج از سلولهای بدون تیمار یا کنترل انجام گرفت. کیفیت RNAهای نمونهها روی ژل آگاروز 5/1 درصد بررسی شد. دو باند مربوط بهS 18و S28بهوضوح قابل تشخیص بودند که نشان دهنده کیفیت بالای RNA استخراجی بود (شکل 5).
شکل 5: RNA کل استخراج شده ردههای سلولی در مدت 24 ساعت، شماره 1: تحت تیمار پروستات ،2: تحت تیمار پستان 3: مربوط بهترکیبی دارو و عصاره، 4: کنترل پروستات ، 5: کنترل فیبروبلاست، 6: کنترل پستان 7: تحت تیمار فیبروبلاست و 8: نردبان ملکولی یا Ladder 1kbp روی ژل اگاروز 5/1 درصد
بررسی تغییر بیان ژن آپوپتوزیسیBCL2 نسبت به ژن کننرل بتا اکتین در ردههای سلولیMCF7 و LNCaP در غلطت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره و ترکیب این غلطت با غلظت کمدارو با روش qPCR-Realtime در مدت 24 و 48 ساعت بدینشکل بود که در مدت 24 و 48 ساعت بیان ژنBCL2 در تمامی ردههای سلولی کاهش یافته بود و این کاهش بیان در مدت 24 و 48 ساعت نسبت به ژن کنترل در سطح 1 درصد معنیدار بود. بیشترین کاهش بیان بهترتیب در سلولهای سرطانی پروستات، سینه نشان داده شد (شکل 6).
شکل 6: مقایسه بیان ژن BCL2 نسبت به ژن کنترل داخلی بتااکتین در مدت زمان 24 و 48 ساعت در رده سلولهای سرطانی LNCap و MCF-7
تفاوت معنیداری در سطح 1 درصد بین دو تیمار غلظت 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره و اثر ترکیبی آن با دارو مشاهده نشد و کاهش چشمگیری در بیان
ژن BCL2 بین این دو تیمار مشاهده نشد. بهمنظور اطمینان از تک باند بودن پرایمرهای موجود، محصولات حاصل از Realtime-qPCR را روی ژل آگاروز 2 درصد بارگذاری شدند (شکل 7).
شکل 7: محصول Realtime-PCR – سمت راست چاهک اول نردبان ملکولی 1kbp ( Ladder) و بقیه مربوط به ژن Bcl2 با طول 119 bp در رده سلولی روی ژل آگاروز 2درصد
بحث
سرطان بهعنوان یک بیماری کشنده در جهان شناخته میشود و هر ساله تعداد زیادی از افراد جدید درگیر این بیماری میشوند، در کشورهای در حال توسعه مانند ایران این بیماری عامل اصلی مرگ و میر انسان
هاست. سرطان سینه در زنان ایرانی و سرطان پروستات در مردان ایرانی بهعنوان شایعترین سرطانها مطرح است و در دهههای اخیر شیوع آن افزایش یافته است (27و 26). بیشتر گیاهان و سبزیجاتی مورد استفاده قرار میگیرند و در طبیعت وجود دارند دارای خاصیت دارویی هستند. این گیاهان بهدلیل داشتن ترکیبات دارویی و خاصیت آنتی اکسیدانتی میتوانند بهعنوان یک عامل ضد سرطانی عمل کنند (28). خاصیت دارویی گیاهان بهدلیل وجود متابولیتهای ثانویه است. این ترکیبات برای رشد و نمو گیاهان ضروری نیستند ولی برای حیات و بقا گیاهان ضروری هستند و همچنین دارای پیچیدگیهای بیشتری نسبت به متابولیتهای اولیه هستند (29). در این تحقیق از گیاه خارسنبلBelepharis persica ، گیاه بومی مناطق جنوبی ایران استفاده شد تا اثرات ضد سرطانی آن مورد سنجش قرار گیرد. گیاه خارسنبل دارای خواص دارویی است و در مناطق بومی از قسمتهای مختلف آن استفاده میکنند. از ترکیبات شیمیایی موجود در گیاه خارسنبل میتوان آلانتوان، کاتچول، تانن، ساپونین و گلوکز را نام برد (25). ساپونین یک متابولیت ثانویه است که در بسیاری از گیاهان دارویی و حتی جانوران دیده شده است. این ترکیب دارای طیف وسیعی از خواص دارویی از جمله: ضد آسم، ضد التهاب، ضد باکتریایی، مفید برای قلب، تقویت کننده سیستم ایمنی، ضد قارچ و ضدسرطان است (31و30). با توجه به آنکه این گیاه دارای متابولیت ثانویه متعددی از جمله ساپونین است میتوان گفت این گیاه دارای خواص ضد سرطانی میباشد. در این تحقیق با روش خیساندن، عصاره هیدروالکلی این گیاه طی مدت 72 ساعت تهیه شد. نتایج حاصل از تست MTT این عصاره بذر خارسنبل نشان داد که تفاوت معنیداری در اثر سمیت سلولی این عصاره در غلظتهای مختلف با کنترل آن وجود دارد. غلطتهای 10و 5/7 میلیگرم بر میلیلیتر این عصاره با آنکه در هر سه رده سلولی بالای 50 درصد مهار رشد سلولها را داشت ولی کمترین بازدارندگی رشد را بر روی سلولهای فیبروبلاست داشته است. در تحقیقBaskar و همکاران (32) اثر عصارههای مختلف قسمت هوایی گیاه maderaspatensisBlepharisهمخانوادهBlepharis persica بر روی ردههای سلولهای سرطانی MCF7 وAGS مورد مطالعه قرار گرفت و نتایج نشان داد که غلظتهای مختلف عصاره الکلی این گیاه در 24، 48 و 72 ساعت بر روی ردههای سلولی معده و سینه دارای اثر مهار کنندگی رشد دارد و با افزایش غلظت و زمان، میزان تاثیر گزاری عصاره بیشتر شده است. همتا و پروینی (33) به بررسی اثرات سمیت عصاره گیاه رزماری روی ردههای سلولهای سرطانیMCF7 القا شده توسط DMBA در رتهای نژاد SD پرداختند، نتایج نشان داد که عصاره الکلی رزماری بر روی سلولهای MCF7 دارای اثرات سمی قابل توجهی بوده است ولی عصاره آبی خواص ضد سرطانی بسیار ضعیفی داشت. اثر عصاره هیدروالکلی میوه خارخسک بر تکثیر سلولهای سرطان پروستات و روده بزرگ انسان در شرایط آزمایشگاهی توسط Yaghoobi و همکاران (34) انجام شد. نتایج نشانداد افزایش غلظت عصاره هیدروالکلی میوه خارخسک باعث افزایش اثر بازدارندگی رشد بر روی ردههای سلولهایLNCaP شده است و عصاره موجود بر روی سلولهای فیبروبلاست اثر کمتری داشته است. در تحقیق Ashour (35) در مصر صورت گرفت با کمک تست radical DPPH اثبات شد که قسمتهای هوایی گیاه blepharis edulis خاصیت آنتی اکسیدانتی و ضد سرطانی دارند و همچنین نتایج حاصل از تحقیق Mahboubi و همکاران (36) در ایران نشان داد گیاه blepharis edulisیا خارسنبل بومی ایران در قسمت های هوایی این گیاه ترکیبات فنولی زیادی وجود دارد که این ترکیبات دارای خواص آنتی اکسیدانتی و ضد میکروبی هستند، نتایج این تحقیقات یههمراه نتایج حاصل از این تحقیق دال بر این مطلب است که عصاره گیاه خارسنبل دارای خواص آنتی اکسیدانتی و ضد سرطانی است. در این مطالعه بیان ژن BCL2 با کمک Realtime-PCR نیز مورد سنجش قرار گرفت و نتایج نشان داد بیان این پروتین بهصورت معنیداری تحت تیمار عصاره 25/1 میلیگرم بر میلیلیتر در مدت 24 و 48 ساعت کاهش یافته است. این نشان دهنده این است که عصاره هیدروالکلی تاثیر بر روی مسیر آپوپتوزیسی گذاشته است. احمدی و همکاران (37) تاثیر عصاره هیدروالکلی برگ گیاه سدر (Ziziphus spina-christi) بر زندهمانیMCF7 و بیان ژنهای BAX و BCL2 مورد بررسی قرار دادند. نتایج به این شکل بود که با افزایش غلظت عصاره زندهمانی سلولی نسبت به کنترل کاهش معنیداری پیدا کرد و همچنین در غلظت 1/0 میلیگرم بر میلیلیتر عصاره گیاه، بیان ژن BCL2 دچار کاهش معنیداری (01/0p<) شده است. از عوامل دیگری که میتواند در کاهش بیان BCL2موثر باشد ساپونین است، ساپونین بهعنوان یک متابولیت ثانویه میتواند یک عامل موثر در آپوپتوزیس سلولهای سرطانی و کاهش دهنده بیان ژن BCL2باشد (38). نتایج این تحقیق نیز نشان داد که عصاره هیدروالکلی این گیاه کاهش دهنده بیان BCL2 است که میتوان بهدلیل وجود ساپونین در این گیاه نسبت داد. نتایج حاصل از دستگاه فلوسایتومتری نشاندهنده همین مطلب بود که سلولهای سرطانی رو به آپوپتوزیس آوردهاند و عصاره حاصل بر روی مسیر آپوپتوزیس سلولهای سرطانی سینه و پروستات تاثیر داشته است.
نتیجه گیری
نتایج این تحقیق حاکی از اثر بالقوه عصاره عصاره هیدروالکلی بذر گیاه خارسنبل بر بیان ژن BCL2 در سلولهای سرطانی پستان و پروستات انسان و ارتباط آن با مهار رشد سلولهای سرطانی است. با توجه به آن در مرحله بعدی کار با جداسازی ماده موثره این گیاه و تحقیقات تکمیلی میتوان بهعنوان یک ترکیب موثر در درمان سرطان معرفی شود. نتایج همچنین نشان داد عصاره این گیاه بر روی مسیر آپوپتوزیس تاثیر دارد با تحقیقات تکمیلی از جمله بررسی بیان ژنهای دیگری که در مسیر آپوپتوزیس درگیر هستند و میتواند بهطور دقیقتری پاسخگو این مطلب باشد که عصاره حاصل بهعنوان ترکیبی موثر برای درمان سرطان سینه و پروستات مورد استفاده قرار گیرد.
تشکر و قدردانی
این مقاله از پایان نامه دوره دکترای رشته بیوتکنولوژی کشاورزی مصوب در دانشکده کشاورزی دانشگاه گیلان استخراج شده است. از مسئولین آزمایشگاه ژنتیک و بیوتکنولوزی دانشگاه تحصیلات تکمیلی صنعتی و فناوری پیشرفته کرمان جهت قرار دادن امکانات و وسایل آزمایشگاهی و آقایان دکتر علی درخشانی، دکتر فیروز جنت علی پور که ما را در انجام و ارتقاء کیفی این پژوهش یاری دادند، صمیمانه تشکر و قدردانی می شود.
)