Document Type : Research - Scientific
Authors
1 Department of Cell and Molecular Biology, Faculty of Biological Sciences, Kharazmi University, Tehran, Iran
2 Department of Animal Biology, Faculty of Biological Science, Kharazmi University, Tehran, Iran.
3 Department of Biology, College of Science, University of Tehran, Tehran, Iran
Abstract
Aim: In current study, we aimed to reduce Cdc42 gene expression in lung carcinoma related cells, Calu-6, and assayed its effect on cell proliferation.
Material and Methods: To reduce the expression of Cdc42 gene shRNA system was used and lentiviral system was selected to deliver Cdc42 specific shRNA to Calu-6 cells. Recombinant lentiviruses produced by co-transfection of pMD2G, psPAX2 and p-GFP-C-shLenti plasmids into 293T cells using lipofectamin. Efficiency of transfection and transduction assessed by florescent microscopy. Viability of cells treated by recombinant lentiviruses assessed by MTT assay.
Results: florescent microscopy showed 80% transfection of 293T cells and high rate of Calu-6 cells transduction. MTT assay results revealed that viability of transduced Calu-6 cells reached to %58 and %40 in compare to control and negative control cells, respectively.
Conclusion: recombinant lentiviruses properly transfer Cdc42-shRNA into Calu-6 cells, leading to reduction of cell proliferation. Silencing of Cdc42 gene expression using lentiviruses is persist and long-term effect which can be under attention for gene therapy of lung cancer.
Highlights
-
Keywords
مقدمه
سرطان مجموعه‌ای از 100 بیماری مختلف است که در طول زمان گسترش می‌یابد و زمانی ایجاد می‌شود که یک سلول، محدودیت‌های خود در تقسیم سلولی را از دست بدهد و شروع به تکثیر و رشد کنترل نشده کند. سرطان تقریباً می‌تواند در هر یک از بافت‌های بدن ایجاد شود که هر نوع از آن‌ها ویژگی‌های منحصربه‌فردی دارد. فرآیندهای اساسی که باعث ایجاد سرطان می‌شوند، در تمام انواع بیماری‌ها کاملاً مشابه هستند (1 و 2). سرطان ریه از سرطان‌های شایع در جهان می‌باشد که رتبه سوم شایع‌ترین سرطان در مردان و چهارمین آن در زنان را به خود اختصاص داده است (3). سرطان ریه، اولین عامل منجر به مرگ در میان سرطان‌ها می‌باشد. در سال 2015، حدود 158040 نفر در اثر ابتلا به این سرطان جان خود را از دست دادند که حدود 27 درصد مرگ ناشی از سرطان‌ها را در دنیا شامل می‌شود (4). مجموع مرگ‌ومیر ناشی از سرطان ریه، به اندازه مجموع مرگ‌ومیر ناشی از سه سرطان پروستات، پستان و کلون است (5). روش‌های درمانی سرطان ریه شامل جراحی، شیمی‌درمانی و پرتودرمانی است که بهصورت مستقل و گاهی ترکیبی مورد استفاده قرار می‌گیرند. با این حال، بسیاری از این گزینه‌های درمانی به مراحل اولیه تومور محدود می‌شوند و حتی گاهی پس از جراحی هنوز هم احتمال بازگشت تومور در این بیماران وجود دارد. بنابراین، امروزه استفاده از روش‌های درمانی جدیدتر که موثرتر و دارای اثرات جانبی کمتری هستند مورد توجه قرار گرفته است (6).
یافته‌ها نشان می‌دهد که سرطان ریه می‌تواند در اثر تجمع تغییرات ژنتیکی در ژن‌های مهمی که محصول پروتئینی آن‌ها در کنترل حرکت سلولی، تکثیر، تمایز و آپوپتوز نقش دارد ایجاد گردد. شناسایی و مشخصه‌یابی این تغییرات ژنتیکی که منجر به پیشرفت و گسترش سرطان ریه می‌شود می‌تواند در تشخیص زود هنگام و پیشرفت درمان‌های هدفمند جدید کمک کند (7).
ژن Cell Division Cycle 42 (Cdc42) (Omim ID: 116952) عضوی از خانواده Rho GTPase ها و متعلق به سوپر خانواده Ras است. مطالعات نشان داده است که Cdc42 نقش مهمی را در تشکیل فیلوپودیا، حرکت سلول، حرکت جهت‌دار و رشد سلولی دارد (8). تنظیم نامناسب ژن Cdc42 با بیماری‌های مختلف انسانی و/یا ناهنجاری‌های تکوینی همراه است. به طوری که افزایش بیان آن در چندین سرطان مختلف از جمله سرطان بیضه، کولورکتال، سرطان پستان، کارسینومای سر و گردن، ملانوما (12-8) و سرطان ریه سلول‌هایغیرکوچک ( NSCLC:Non small carcinoma lung cancer) دیده شده است (10 و 11). در اثر افزایش فعالیت ژن cdc42، تجزیه گیرنده فاکتور رشد اپیدرمی (EGFR) که با واسطه c-Cbl صورت می‌گیرد مختل می‌شود که منجر به افزایش فعالیت EGFR و تحریک تجزیه پروتئوزومی p21CIP1 و در نهایت افزایش رشد و مهاجرت سلولی می‌گردد. این پیامدهای عملکردی ممکن است از طریق مسیرهای تنظیم PAK1، MLC، ERK1/2 و JNK انجام شود. علاوه بر این، مهار سیگنال‌های Cdc42 می‌تواند باعث مهار رشد سلولی و القا آپوپتوزیس از طریق مسیرهای سیگنالی PI(3)K-Akt و Erk و مهار کننده تومور p53 شود (8).
ایده اولیه ژن‌درمانی بر پایه یک ژن یا محصول آن است که می‌تواند به صورت انتخابی و با حداقل سمیت به یک سلول/بافت خاص برسد. این محصول می‌تواند بیان یک ژن خاص را مهار کرده یا باعث بیان طبیعی ژن شود (13). مکانیسم RNAi(RNA interference) یک فرآیند بیولوژیکی است که اجازه تجزیه کنترل شده mRNA (messenger RNA) های اختصاصی هدف را می‌دهد (14). کشف‌های اخیر در مکانیسم RNAi و مسیرهای خاموش‌سازی ژن، انقلابی را در درک ما از مسیرهای تنظیمی ژن‌ها ایجاد کرده است. RNAi به عنوان یک ابزار تحقیقاتی برای کنترل بیان ژن‌های خاص در ارگانیسم‌های آزمایشگاهی مختلفی استفاده می‌شود و دارای پتانسیل درمانی برای کاهش بیان ژن‌های موردنظر است (15). این مکانیسم از سیستم‌های siRNA (Small interfering RNA) یا shRNA (short hairpin RNA) بهعنوان یک ابزار رایج برای بررسی اثرات از دست دادن عملکرد ژن‌های مورد نظر در پستانداران، در کنار روش‌هایی همچون کشف داروهای درمانی استفاده می‌کند (16).
مکانیسم RNAi از طریق سنتز شیمیایی siRNA و یا بر پایه shRNA عمل می‌کند. shRNA از طریق ویروس یا وکتورهای پلاسمیدی بیان می‌شود. دلیل استفاده از shRNA، اثر خاموش‌سازی پایدارتر در سلول‌ها است. shRNA مزیت‌های بیشتری نسبت به siRNA دارد چون نرخ تجزیه نسبتاً پایین‌تری دارد (16).
رسانش مؤثر و ایمن یک موضوع مهم در کاربردهای بالینی اسیدهای نوکلئیک به عنوان عوامل درمانی است (13). وکتورهای ویروسی و غیر ویروسی مختلفی برای رسانش ژن وجود دارد که هرکدام مزیت‌ها و معایب خاص خود را دارد. لنتی‌ویروس‌ها از رایج‌ترین سیستم‌های رسانش در ژن‌درمانی هستند و مزیت‌های زیادی نسبت به دیگر وکتورهای ویروسی دارند. مثلاً لنتی‌ویروس‌ها می‌توانند ژن‌های بزرگ با اندازه 9-8 کیلو باز را حمل کنند و سمیت کمی دارند (16). وکتورهای لنتی‌ویروسی یک سیستم رسانشی کارآمد برای بیان پایدار و طولانی‌مدت shRNA در سلول‌های پستانداران است. وکتورهای لنتی‌ویروسی قادرند که shRNA ها را که می‌توانند برای کاهش بیان ژن اختصاصی مورد استفاده قرار گیرند وارد ژنوم سلول‌ها کنند. به این ترتیب shRNA به طور مداوم در سلول تولید می‌شود و با استفاده از سیستم میزبان، بیان ژن مورد نظر را کاهش می‌دهد (17).
در پژوهش حاضر، ژن Cdc42 با استفاده از مکانیسم RNAi و با استفاده از shRNA اختصاصی ژن Cdc42، مورد هدف قرار گرفته و بیان آن در سلول‌های Calu-6 مرتبط با سرطان ریه توسط سیستم لنتی‌ویروسی کاهش یافت. با توجه به نقش ژن Cdc42 در تکثیر سلولی، اثر کاهش بیان این ژن بر میزان تکثیر سلول‌های سرطان ریه مورد ارزیابی قرار گرفت.
مواد و روش‌ها
تهیه باکتری‌های مستعد: برای مستعد سازی باکتری (E.Coli (Escherichia coli سوش DH5α، از روش کلسیم کلراید و با غلظت 100 میلی‌مولار استفاده شد. بدین ترتیب که یک کلونی از کشت خطی باکتری DH5α در پنج میلی‌لیتر محیط کشت LB Lysogeny Broth)) کشت شبانه داده شد. در روز دوم، 100 میلی‌لیتر از محیط کشت LB broth با یک میلی‌لیتر کشت شبانه باکتری تلقیح شد و تا رسیدن به 4/0-3/0 OD600=، در شیکر انکوباتور، با دور rpm 180 و دمای °C37 انکوبه گردید. سپس در دور g 3800 به مدت 10 دقیقه سانتریفیوژ شد و پس از دور ریختن محیط رویی با محلول 100 میلی‌مولار کلسیم کلراید سرد انکوبه و مجدداً سانتریفیوژ گردید. مرحله انکوباسیون با کلسیم کلراید سرد و سانتریفیوژ مجدداً تکرار گردید و در نهایت باکتری‌های مستعد شده در محلول کلسیم کلراید سرد حاوی گلیسرول ذخیره شدند.
ترانسفورماسیون باکتری‌های مستعد شده با وکتورهای pGFP-C-shLenti، psPAX2 و pMD2G
برای تکثیر پلاسمیدهای مورد نظر، ابتدا باید این پلاسمیدها درون باکتری‌های مستعد وارد شوند. برای این منظور ترانسفورماسیون سوش DH5α با روش شوک حرارتی انجام گردید. بدین صورت که پنج میکرولیتر از هرکدام از پلاسمیدها به صورت جداگانه به 50 میکرولیتر از باکتری مستعد شده اضافه گردید. پس از 30 دقیقه انکوباسیون بر روی یخ، به مدت 45 ثانیه درون حمام آب °C42 قرار گرفت و پس از 2 دقیقه انکوباسیون بر روی یخ، 500 میکرولیتر محیط LB Broth به آن اضافه شد و 2 ساعت درون شیکر انکوباتور با دمای °C37 و دور 180 انکوبه گردید. باکتری‌های ترانسفورم شده با پلاسمیدهای psPAX2 و pMD2G در محیط LB Agar حاوی آمپی‌سیلین و باکتری‌های ترانسفورم شده با پلاسمید pGFP-C-shLenti در محیط LB-Agar حاوی کلرامفنیکل تکثیر یافتند.
استخراج پلاسمید: برای استخراج پلاسمیدها از کیت استخراج پلاسمید (Bio-Spin Mini-Prep Plasmid Extraction Kit) محصول شرکت Bioflux ژاپن استفاده شد و استخراج براساس دستورالعمل شرکت سازنده انجام گردید. برای بررسی کیفی صحت استخراج پلاسمید از الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد.
کشت سلول: سلول‌های 293T (سلول‌های کلیه جنین) و Calu-6 (سلول‌های کارسینومای ریه) از انستیتو پاستور ایران خریداری گردید و در محیط کشت RPMI 1640) Roswell Park Memorial Institute medium) حاوی ده درصد (Fetal Bovine Serum) FBS و یک درصد آنتی‌بیوتیک‌های پنی‌سیلین و استرپتومایسین در 37 درجه سانتیگراد و 5 درصد CO2 کشت داده شدند. بهمنظور تولید ویروس، سلول‌های 293T یک روز پیش از ترانسفکشن در پلیت 60 سانتی‌متری کشت داده شدند.
تولید ویروس: برای تولید لنتی‌ویروس‌های نوترکیب به عنوان حاملی برای رسانش ژن Cdc42، سلول‌های 293T، پس از رسیدن به تراکم 90 درصد، هم زمان با سه وکتور لنتی‌ویروسی ترانسفکت شدند. بدین ترتیب که این سلول‌ها با 10 میکروگرم پلاسمید pGFP-C-shLenti و پلاسمیدهای غشایی و بسته‌بندی psPAX و pMD2G با استفاده از لیپوفکتامین 2000 (Invitrogene, USA) و طبق دستورالعمل شرکت سازنده ترانسفکت گردیدند. محیط کشت سلول‌های 293T، که حاوی ویروس‌های تولید شده است در مقاطع زمانی 48 و 72 ساعت جمع‌آوری شد. برای تولید لنتی‌ویروس کنترل (فاقد Cdc42-shRNA)، از پلاسمید فاقد توالی shRNA به همراه دو پلاسمید psPAX و pMD2G استفاده شد.
ترانسداکشن سلول‌های Calu-6: سلول‌های Calu-6 در پلیت‌های 24 خانه کشت داده شدند و تحت تیمار با رقت‌های مختلفی از لنتی‌ویروس‌های نوترکیب قرار گرفتند. برای افزایش بازده ترانسداکشن از پلی برن (Sigma Aldrich, UK) استفاده شد. دو روز پس از ترانسداکشن، سلول‌ها با آنتی‌بیوتیک پورومایسین تیمار شدند. تیمار آنتی‌بیوتیکی باعث کشته شدن سلول‌هایی شد که با ویروس آلوده نشده باشند و سلول‌های ترانسداکت شده به علت وجود ژن مقاومت به آنتی‌بیوتیک پورومایسین زنده ماندند. به این صورت، پس از دو روز تیمار آنتی‌بیوتیکی، همه سلول‌های آلوده نشده با ویروس از بین رفتند. به منظور بررسی کیفی ترانسداکشن از میکروسکوپ فلورسنس استفاده شد و بیان ژن گزارشگر GFP مورد بررسی قرار گرفت.
بررسی تکثیر سلول‌ها با روش MTT: بهمنظور بررسی اثر کاهش بیان ژن Cdc42 بر روند تکثیر و ماندگاری زیستی سلول‌های Calu-6، ماندگاری زیستی این سلول‌ها پس از ترانسداکشن، در فواصل زمانی 24، 48 و 72 ساعت، با روش MTT (3-(4,5- imethylthiazol-2-Yl)-2,5-Diphenyltetrazolium Bromide) مورد ارزیابی قرار گرفت. بدین منظور، تعداد 2000 سلول ترانسفکت شده و نیز نمونه‌های کنترل و کنترل منفی در پلیت‌های 24 خانه کشت داده شدند. سپس این سلول‌ها در دمای °C37 به مدت 4 ساعت با 50 میکرولیتر محلول MTT انکوبه شدند. محیط رویی بهآرامی کشیده شد و DMSO Dimethyl sulfoxide)) برای حل کردن محصول فورمازان به مدت 20 دقیقه در دمای اتاق اضافه گردید. در نهایت جذب نوری هر نمونه در 490 نانومتر اندازه‌گیری شد. این آزمایش‌ها سه بار تکرار گردید و میزان تکثیر سلول‌های ترانسداکت شده با لنتی‌ویروس‌های نوترکیب حاوی shRNA با سلول‌های کنترل (ترانسداکت شدۀ فاقد shRNA-Cdc42) و کنترل منفی (ترانسداکت نشده) مقایسه شد.
آنالیز آماری
سنجش MTT سه بار تکرار شد. معنی‌داری نتایج حاصل، با استفاده از نرم‌افزار InStat3 به دست آمد و نمودار با استفاده از نرم‌افزار مایکروسافت اکسل 2013 رسم شد.
نتایج
تکثیر و استخراج پلاسمید
برای بررسی کیفی و صحت استخراج پلاسمید از الکتروفورز ژل آگارز استفاده شد. پنج میکرولیتر از پلاسمید با پنج میکرولیتر از رنگ لود کننده بر روی ژل، لود و دستگاه ران شد. باندهای مربوط به پلاسمیدهای psPAX2، pMD2G و pGFP-C-shLenti و کنترل در شکل 1 نشان داده شده است.
شکل 1: بررسی کیفی صحت استخراج چهار پلاسمید کنترل، pGFP-C-shLenti، psPAX2 و pMD2G با استفاده از الکتروفورز ژل آگارز
ترانسفکشن سلول‌های 293T و تولید لنتی‌ویروس
|
شکل 2: الف 1 و 2) سلول‌های 293T ترانسفکت شده با پلاسمید کنترل فاقد Cdc42-shRNA. شکل ب 1 و 2) سلول‌های 293T ترانسفکت شده با پلاسمید tGFP-C-shLenti. |
|
الف 1 1 |
|
الف 2 |
|
ب 1 |
|
ب 2 |
24 ساعت پس از ترانسفکشن بیان ژن GFP در سلول‌های بسته‌بندی کنندۀ 293T با میکروسکوپ فلورسنس مورد بررسی قرار گرفت. مشاهده در زیر میکروسکوپ و شمارش سلول‌های بیان کننده GFP نشان داد که حدود 80 درصد از سلول‌های 293T آلوده به لنتی‌ویروس بوده و در حال تولید ذرات ویروسی بودند (شکل 2).
ترانسداکشن سلول‌های Calu-6
سلول‌ها پس از کشت در پلیت، با MOI 50 ترانسداکت شدند. یک روز پس از ترانسداکشن، جهت تأیید فرایند ترانسداکشن مشاهده در زیر میکروسکوپ فلورسصورت گرفت که نشان دهنده ترانسداکشن بخشی از سلول‌های Calu-6 توسط ذرات لنتی‌ویروسی حاوی GFP-shRNA-Cdc42 بود. تیمار آنتی‌بیوتیکی در طی دو روز منجر به حذف سلول‌های ترانسداکت نشده و بالا رفتن خلوص سلول‌های آلوده شد (شکل 3).
|
شکل 3:. شکل الف 1 و 2) سلول‌های ترانسداکت شده با ویروس کنترل فاقد Cdc42-shRNA. شکل ب 1 و 2) سلول‌های ترانسداکت شده با ویروس کد کننده Cdc42-shRNA را نشان می‌دهد.
|
|
الف 1 |
|
الف 2 |
|
ب 1 |
|
ب 2 |
بررسی تکثیر سلول‌ها با MTT
نتایج حاصل از روش MTT نشان داد که نرخ سرعت رشد سلول‌های Calu-6، 24 و 48 ساعت پس از کشت در سلول‌هایی که تحت آلودگی ویروسی قرار گرفته بودند نسبت به سلول‌های گروه کنترل و کنترل منفی تغییری نداشته است اما نرخ رشد این سلول‌ها پس از 72 ساعت نسبت به سلول‌های کنترل منفی در سطح 01/0>p و نسبت به سلول‌های کنترل در سطح 001/0>p کاهش معنی‌داری یافت، به طوری که رشد سلول‌ها نسبت به سلول‌های کنترل 58 درصد و نسبت به سلول‌های کنترل منفی 40 درصد کاهش یافت (شکل 4).
|
شکل 4: نمودار بررسی رشد و تکثیر سلول‌ها در طی 72 ساعت. به منظور بررسی رشد و تکثیر سلول‌ها، سلول‌های ترانسداکت شده به همراه نمونه کنترل و کنترل منفی به تعداد 2000 سلول در هر چاهک کشت داده شدند. میزان رشد و تکثیر سلول‌ها روزانه و با استفاده از روش MTT مورد بررسی قرار گرفت. نمودار حاصل، میزان رشد سه گروه سلول ترانسداکت شده، کنترل منفی و کنترل را طی 3 روز متوالی نشان می‌دهد. نتایج حاصل از آزمون MTT نشان می‌دهد اگرچه سرعت رشد سلول‌ها در 48 ساعت اول تغییر معنی‌داری را نسبت به گروه کنترل و کنترل منفی نشان نمیدهد اما سرعت رشد این سلول‌ها در 72 ساعت پس از کشت، کاهش معنی‌داری را نسبت به نمونه‌های کنترل (با سه ستاره و 001/0>P) و کنترل منفی (با دو ستاره و 01/0>P) نشان می‌دهد.
|
|
** |
|
*** |
بحث
Cdc42، یک عضو از خانواده Rho GTPase ها است که تنظیم نامناسب بیان آن می‌تواند عملکرد طبیعی سلول‌ها را تغییر داده و منجر به شروع مسیرهای سیگنالی مختلفی شود که در ارتباط با بیماری‌های مختلف از جمله سرطان می‌باشند (18). بیان ژن Cdc42 در سرطان‌های مختلفی از جمله NSCLC افزایش می‌یابد و باعث پیشبرد فاز G1/S چرخه سلولی می‌شود (19)؛ بنابراین به نظر می‌رسد می‌توان با کاهش بیان ژن Cdc42، پیشرفت تومور را کنترل کرد (18).
در سال‌های اخیر پژوهش‌های مختلفی در رابطه با کاهش بیان ژن Cdc42 در سلول‌های سرطانی با استفاده از مهارکننده‌ها صورت گرفته است. دو مهار کننده معمول برای Cdc42، شامل toxin B و Secramine است که هر دو محدودیت‌هایی در استفاده دارند. توکسین B، Cdc42 را از طریق تغییرات پس از ترجمه و با افزودن گلوکز به یک ریشه سرین، مهار می‌کند و بدینترتیب ارتباط cdc42 با غشاها مهار می‌شود و از انتقال سیگنال‌های پایین دست ممانعت بهعمل میآید. سکرامین نیز برهمکنش Cdc42 با RhoGDI1 را پایدار کرده و باعث قفل شدن Cdc42 در حالت غیرفعال می‌شود. از سوی دیگر این دو مهار کننده عملکرد اختصاصی ندارند و علاوه بر Cdc42، Rho و Rac را نیز مهار می‌کنند. بنابراین، این مهار کننده‌ها دارای عملکرد اختصاصی نبوده و استفاده از آن‌ها در پژوهش‌های مربوط به Cdc42 در فرایندهای پیچیده سلولی محدود است (20). در پژوهشی که در سال 2013 توسط Karin Zins و همکاران انجام شد از کوچک مولکول AZA197 برای مهار Cdc42 استفاده گردید. این پژوهش نشان داد که کوچک مولکول AZA197 می‌تواند با هدف قرار دادن انتخابی Cdc42، رشد، تهاجم و متاستاز را در سلول‌های SW620 و HT-29 سرطان کلون مهار کند و آپوپتوزیس را از طریق کاهش بیان PAK1 و ERK افزایش دهد (21). در پژوهش دیگری که در سال 2011 توسط QING-YONG CHEN و همکاران انجام شد از کورکومین به منظور مهار بیان ژن Cdc42 استفاده گردید. نتایج این پژوهش نشان داد که کورکومین می‌تواند با کاهش بیان ژن Cdc42، رشد، تهاجم و متاستاز را در رده سلولی 801D سرطان ریه سلول‌های غیرکوچک مهار کند (22).
مکانیسم RNAi فرآیندی طبیعی است که در آن بیان ژن هدف به طور انتخابی و با اختصاصیت بالا مهار می‌شود.. عوامل اختصاصی هدف در مکانیسم RNAi این پتانسیل را دارند که به صورت اختصاصی، اهداف مولکولی کلیدی که به صورت غیرطبیعی افزایش بیان یافته یا به طور مداوم تولید می‌شود و برای بقا تومور ضروری هستند را به منظور شخصی‌سازی درمان سرطان مهار کند (23). گرچه این مکانیسم با چالش‌هایی مواجه می‌باشد اما به نظر می‌رسد مؤثرترین روش در درمان بیماری‌ها است. عملکرد RNAi با واسطه مولکول‌های (micro RNA) miRNA، (Small interfering RNA) siRNA و shRNA انجام می‌شود. این مولکول‌ها پس از پردازش و ورود به سیتوپلاسم شروع به تجزیه mRNA از طریق ماشین درونی سلول می‌کنند (24). اگرچه این مولکول‌ها عملکرد تقریباً مشابهی را از خود نشان می‌دهند اما تفاوت‌هایی با هم دارند (23). مقاله‌ای که در سال 2017 توسط Yongqiang Li و همکاران منتشر شد نشان داد که miR-29a در سرطان ریه سلول‌های غیرکوچک کاهش میابد. این کاهش بیان در ارتباط با متاستاز سرطان ریه است. ترانسفکشن این miRNA به سلول‌ها و در نتیجه افزایش بیان آن، منجر به مهار رشد سلولی، مهاجرت و متاستاز در سلول‌های NSCLC می‌شود. از سوی دیگر، ژن Cdc42 بهعنوان هدف اصلی miR-29a شناخته شده است و در واقع miR-29a عملکرد سرکوبگری توموری خود در سلول‌های NSCLC را بهواسطه مهار بیان ژن Cdc42 انجام می‌دهد (25). در پژوهش دیگری که در سال 2016 توسط Mingliang Zhang و همکاران منتشر شد نشان داد که مقدار miR-29a در سلول‌های MDA-MB-453 سرطان پستان کاهش میابد. ترانسفکت این miRNA در سلول، باعث افزایش بیان آن و در نتیجه توقف چرخه سلولی در فاز G0/G1 می‌شود. بررسی‌های بیشتر نشان داد که افزایش بیان این miRNA منجر به کاهش بیان Cdc42 می‌گردد؛ در واقع miR-29a نقش مهار کننده تومور را در سرطان پستان دارد و عملکرد خود را با توقف چرخه سلولی از طریق تنظیم منفی ژن Cdc42 اعمال می‌کند (26). CHENG ZHAOو همکاران نیز در سال 2015 نشان دادند که miR-195 به عنوان یک سرکوبگر تومور عمل می‌کند. افزایش بیان آن و در نتیجه کاهش بیان ژن Cdc42 که به عنوان هدف این miRNA است می‌تواند رشد سلول‌های سرطان مثانه را احتمالاً از طریق فعال‌سازی مسیر STAT3 مهار کند. از سوی دیگر، افزایش مقدار Cdc42 می‌تواند اثر مهاری ناشی از افزایش بیان miR-195 را بر رشد سلول‌های سرطان مثانه از بین ببرد (27). Karen J. Humphreys و همکاران در سال 2014 نشان دادند که miR-18a می‌تواند Cdc42 را مهار کند و بدینصورت نقش یک سرکوب‌کننده تومور را در سرطان کولورکتال ایفا می‌کند (28). Yuefeng Li و همکاران (8) نشان دادند که MiR-330 می‌تواند با هدف قرار دادن Cdc42 در سلول‌های سرطان کولورکتال، رشد این سلول‌ها را تنظیم کند.. Liu M و همکاران (29) نشان دادند که miR-137 می‌تواند با هدف قرار دادن ژن Cdc42هم در سطح پروتئین و هم در سطح mRNA، بیان آن را کاهش دهد که منجر به توقف چرخه سلولی در مرحله G1 و مهار رشد و تهاجم سلول‌های سرطانی کولورکتال می‌شود.
باید توجه داشت که یکی از معایب استفاده از miRNA جهت هدف قرار دادن ژن مورد نظر، اختصاصیت پایین آن در مقایسه با siRNA و shRNA است. زیرا miRNA عملکرد اختصاصی برای یک ژن خاص ندارد و گاهی می‌تواند حتی تا 100 ژن را مورد هدف قرار دهد (30). shRNAبر خلاف siRNA که درون سیتوپلاسم ایجاد می‌شود، در هسته سنتز شده و پس از پردازش و انتقال به سیتوپلاسم در کمپلکس RISC مشارکت می‌کند. میزان لود شدن siRNA در کمپلکس RISC، 10 برابر کمتر از shRNA است و از سوی دیگر، shRNA بازده بالاتری در عملکرد خود نسبت به siRNA دارد (23).
اگرچه پژوهش‌های زیادی در رابطه با مکانیسم RNAi و مولکول‌های siRNA و shRNA در حال انجام است اما به نظر می‌رسد حداقل در رابطه با ژن Cdc42 در این حیطه پژوهش زیادی با استفاده از مهار کننده‌های shRNA انجام نشده است. در پژوهشی که در سال 2011 توسط QING-YONG CHEN و همکاران انجام شد، shRNA اختصاصی ژن Cdc42 با استفاده از لیپوفکتامین به درون سلول‌های 801D سرطان ریه ترانسفکت گردید که منجر به کاهش بیان ژن Cdc42 شد. کاهش بیان این ژن منجر به کاهش قدرت تهاجمی و متاستاز این سلول‌ها گردید (22).
در پژوهش حاضر، از مکانیسم RNAi و مولکول shRNA جهت کنترل بیان ژن Cdc42 در سلول‌های Calu-6 کارسینومای ریه استفاده گردید و اثر آن بر روند رشد و تکثیر سلولی مورد ارزیابی قرار گرفت. با توجه به بیان پایدار shRNA و بازده عملکردی بیشتر این مولکول نسبت به siRNA، shRNA بهعنوان ابزاری مناسب جهت تعدیل بیان ژن مورد نظر انتخاب گردید. انتقال shRNA به سلول، نیازمند استفاده از وکتورهای مناسب می‌باشد. وکتورهای مورد استفاده در ژن‌درمانی شامل وکتورهای ویروسی و غیر ویروسی است. ویروس‌ها رایج‌ترین وکتورها در ژن‌درمانی است و حدود 70 درصد آزمایش‌های بالینی ژن‌درمانی از وکتورهای ویروسی استفاده می‌کنند (32). وکتورهای ویروسی دو مزیت عمده دارند، که یکی بازده بسیار بالا آن در مقایسه با وکتورهای غیر ویروسی و دیگری توانایی در بیان طولانی‌مدت RNAi درمانی رسانش شده است (32). در این پژوهش، برخلاف پژوهش QING-YONG CHEN، shRNA با استفاده از وکتورهای لنتی‌ویروسی وارد سلول شد. این روش این مزیت را دارد که shRNA را وارد ژنوم سلول می‌کند. بدین ترتیب این ژن به عنوان بخشی از ژنوم، به صورت مداوم بیان می‌شود.
سلول‌های Calu-6 کارسینومای ریه که سلول هدف ما در این پژوهش است مورد تیمار با لنتی‌ویروس‌های نوترکیب تولید شده قرار گرفت. بازده ترانسداکشن با میکروسکوپ فلورسنس مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از اطمینان از آلودگی سلول‌های Calu-6 با لنتی‌ویروس‌های نوترکیب، اثر کاهش بیان ژن Cdc42 بر روند رشد و تکثیر این سلول‌ها در سه روز متوالی با روش MTT ارزیابی شد. داده‌های حاصل نشان داد که اگرچه در روز اول و دوم، تغییر معنی‌داری در سرعت روند تکثیر سلول‌های تیمار شده با لنتی‌ویروس در مقایسه با نمونه‌های کنترل و کنترل منفی وجود ندارد اما روز سوم کاهش معنی‌داری در سرعت رشد این سلول‌ها مشاهده گردید. این امر نشان می‌دهد وکتورهای لنتی‌ویروسی به خوبی توانسته‌اند ژن مورد نظر را به سلول هدف منتقل کنند و گزینه مناسبی برای انتقال ژن مورد نظر به سلول‌های هدف است. از سوی دیگر، کاهش سرعت رشد سلول‌های ترانسداکت شده با لنتی‌ویروس نوترکیب نشان می‌دهد ژن Cdc42 می‌تواند به عنوان یک هدف مهم در روند درمان هدفمند سرطان ریه مورد استفاده قرار گیرد.
نتیجه گیری
نتایج این تحقیق نشان داد که ژن Cdc42 نقشی کلیدی در تکثیر سلول‌های Calu-6 کارسینومای ریه ایفا می‌کند. هدف قرار دادن این ژن با استفاده از shRNA اختصاصی ژن Cdc42 و نیز استفاده از وکتورهای لنتی‌ویروسی جهت انتقال shRNA-Cdc42 به سلول هدف نشان داد که وکتورهای لنتی‌ویروسی ابزار مناسبی جهت انتقال shRNA-Cdc42 به سلول‌های Calu-6 بوده و این انتقال منجر به کاهش تکثیر سلول‌های Calu-6 شده است. کاهش میزان تکثیر سلول‌های سرطان ریه بهواسطه سیستم مهاری لنتی‌ویروسی- shRNA یک اثر پایدار و طولانی مدت می‌باشد که می‌تواند در ژن‌درمانی این سرطان مورد توجه قرار گیرد.
)