دانشگاه اراک سلول و بافت 2228-7035 8 3 2017 09 23 Expression of active beta-glucuronidases enzyme in tobacco plant seeds بیان آنزیم فعال بتا-گلوکورونیداز در بذر گیاه توتون 231 241 30357 10.52547/JCT.8.3.231 FA خدیجه باقری - دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، زنجان، ایران بهرام ملکی زنجانی - دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، زنجان، ایران مهسا مکانیک - دانشگاه زنجان، دانشکده کشاورزی، گروه زراعت و اصلاح نباتات، زنجان، ایران Journal Article 2018 03 07 - <br /><strong>Aim:</strong> The purpose of this research was to design and prepare a suitable gene construct and transfer it to the tobacco plant and analysis of transgenic plants. <br /><strong>Material and methods: </strong>Seed-specific construct that containing Napin promoter, Ω sequence, GUS gene, and SAR sequence was prepared in pBI121 plasmid and proliferated in <em>E.coli</em>.. Then tobacco leaf explants were inoculated with LBA4404 agrobacterium strain by standard protocol. Selection of regenerated shoots also were performed in a selection media (co-culture medias + 25 mg/L Kan + 200 mg/L Cef). Transgenic plants were analyzed by PCR, RT-PCR and histochemical assay. <br /><strong>Results: </strong>Analysis of regenerated plantlets by using PCR and specific primers of nptII and GUS indicated that transfer of these genes to plantlets was successful. RT-PCR reaction results showed that nptII is transcribed in both tissues while GUS is transcribed only in the seed tissue. This finding was expected because Nos promoter (which controls the nptII transcription) is a constitutive and Napin is a seed specific promoter.. Expression and activity of Beta-glucuronidase enzyme in seeds of selected plants was confirmed by SDS-PAGE and histochemical assay. <br /><strong>Conclusion: </strong>The result of this research showed that designed gene construct was appropriate,  because Napin promotes the expression of GUS gene in the seeds and Omega sequences have also been effective in increasing of transgene expression.  In the fallowing, this construct can be used for the production of recombinant proteins by replacing valuable genes with <em>GUS</em>.. <br />  <strong>هدف:</strong> طراحی و تهیه سازه ژنی مناسب و انتقال آن به گیاه توتون و بررسی گیاهان تراریخت حاصله بوده است.<br /><strong>مواد و روش‌ها:</strong> سازه اختصاصی بذر حاوی پیشبرنده Napin، توالی Ω ، ژن GUS و توالی SAR در پلاسمید pBI121 طراحی و تهیه و در باکتری E. coli تکثیر شد. ریزنمونه‌های برگی توتون با آگروباکتریوم سویه LBA4404 به‫روش استاندارد تلقیح شدند. گزینش جوانه‌های باززایی شده در محیط انتخابی (شامل MS، mg/l  1/0 NAA،  mg/l3 BAP ،mg/L 25 کانامایسین، mg/L 200 سفوتاکسیم) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت با PCR، RT-PCR و آزمون هیستوشیمیایی انجام شد.<br /><strong>نتایج:</strong> بررسی مولکولی گیاهان باززایی شده با PCR و آغازگرهای اختصاصی ژن‌های nptII و GUS نشان‌دهنده انتقال این ژن‌ها به گیاه‫چه‌های باززایی شده بود. نتایج RT-PCR نشان داد که نسخه‌برداری از ژن nptII در هر دو بافت برگ و بذر صورت می‌گیرد در حالیکه نسخه‌برداری از ژن GUS تنها در بذر صورت می‌گیرد. با توجه به اینکه پیشبرنده NOS (کنترل‌کننده ژن nptII) عمومی و Napin (کنترل‌کننده ژن GUS) یک پیشبرنده اختصاصی بذر می‌باشد، این نتیجه مورد انتظار بود. در نهایت با استفاده از SDS-PAGE و آزمون هیستوشیمیایی، تولید و فعالیت آنزیم بتا-گلوکورونیداز در بذر گیاهان تراریخت تائید شد.<br /><strong>نتیجه‌گیری:</strong> نتایج مناسب بودن سازه ژنی طراحی شده را نشان داد، چرا که پیشبرنده Napin به خوبی موجب بیان اختصاصی ژن GUS در بذر شده و توالی امگا نیز در افزایش بیان تراژن موثر بوده است. در ادامه کار می‌توان این سازه را با جایگزینی ژن‌های ارزشمند با ژن  GUSبرای تولید پروتئینهای نوترکیب استفاده نمود. https://jct.araku.ac.ir/article_30357_b3a5abfdeb740c8bc8df9c6a8386f127.pdf