دانشگاه اراک سلول و بافت 2228-7035 6 3 2016 02 01 The Effect of Small Molecule Mediated Epigenetic Modulations on Gene Overexpression with Lentiviral System in Embryonic Stem Cells تاثیر ایجاد تغییرات اپی‌ژنتیکی با کوچک ‌مولکول‌ها بر بیش‌بیان ژن به‏روش لنتی‌ویروسی در سلول‌های بنیادی جنینی 431 441 18748 10.52547/JCT.6.3.431 FA محسن بصیری دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک، تهران، ایران مهرداد بهمنش دانشگاه تربیت مدرس، دانشکده علوم زیستی، گروه ژنتیک، تهران، ایران یاسر تهمتنی پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‏های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلول‏های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران آزاده مرادمند پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‏های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلول‏های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران حسین بهاروند پژوهشگاه رویان، پژوهشکده زیست شناسی و فناوری سلول‏های بنیادی جهاد دانشگاهی، مرکز تحقیقات علوم سلولی، گروه سلول‏های بنیادی و زیست شناسی تکوینی، تهران، ایران Journal Article 2016 02 24 <strong>Aim:</strong> In this study the efficiency of lentiviral gene transfer and cytomegalovirus promoter mediated overexpression has been investigated. Furthermore, the effect of small molecule-mediated inhibition of epigenetic pathways on gene overexpression has been studied. <strong>Materials and Methods:</strong> Mouse ES cells were transduced with different doses of lentiviruses  harboring Green Fluorescent Protein (GFP) and the percentage of GFP expressing cells was quantified with flowcytometery. The persistence of GFP expression was assessed after 8 days of transduction. Using embryonic stem (ES) cells transduced with a lentiviral vector harboring pancreatic and duodenal 1 (<em>Pdx1</em>) gene, we studied the influence of 5-azacytidin (5-AZA), DZNep, and BIX01294 small molecules on the gene expression system. <strong>Results:</strong> Lentiviral mediated gene transfer to ES cells with 10 and 20 multiplicities of infection (MOI) resulted in more than 90 percent transgenesis. However, the expression of transgene showed a dramatic decrease during 8 days of post-transduction. Treatment with 5-AZA leads to a 2.5 folds increase in the transgene expression in a permissive culture medium. DZNep also elevated the transgene expression up to 26.5 and 5.9 folds in pluripotency and permissive media respectively. The expression of endogenous <em>Pdx1</em> gene also increased following DZNep treated. <strong>Conclusion:</strong> Lentiviral transduction with MOIs more than 10, is an efficient method for transgenesis of mouse ES cells. However, co-application of this method along with the CMV promoter leads to inactivation of the gene expression in long term. DZNep treatment results in reactivation of transgene expression but also can influence the expression of endogenous genes.   <strong>هدف: </strong>در این مطالعه کارایی روش انتقال ژن به روش لنتی‌ویروسی و بیش‌بیان ژن با پروموتر سایتومگالوویروس (CMV) بررسی و تاثیر کوچک‌‌مولکول (small molecules)‌ های مهارکننده مسیرهای اپی‌ژنتیکی بر بیش‌بیان ژن ارزیابی شده‌است. <strong>مواد و روش‌ها: </strong>سلول‌های ES  موشی با مقادیر مختلف لنتی‌ویروس بیان کننده پروتئین فلورسنت سبز (green fluorescent protein; GFP) تراریخت شده و درصد سلول‌های بیان‌کننده GFP با روش فلوسایتومتری اندازه‌گیری شد. ماندگاری بیان GFP در مدت هشت روز بررسی گردید. به‌کمک لنتی‌ویروس بیان‌کننده ژن فاکتور رونویسی پانکراسی و دئودنومی 1 (<em>Pdx1</em>)، تاثیر تیمار کوچک‌مولکول‌های 5-آزاسایتادین (5-AZA)، DZNep و BIX01294  بر سیستم بیانی ارزیابی شد. <strong>نتایج: </strong>انتقال لنتی‌ویروسی ژن به سلول‌های ES با استفاده از ضریب آلوده‌سازی (Multiplicity of infection; MOI) 10 و 20 موجب تراریخت شدن بیش از 90 درصد این سلول‌ها شد. با این‌حال، بیان ژن انتقال‌یافته در طول هشت روز کاهش چشم‏گیر داشت. کوچک‌‌مولکول 5-AZA در محیط کشت تسهیل‌کننده تمایز (permissive)، بیان ژن از سیستم لنتی‌ویروسی را 5/2 برابر افزایش داد. همچنین DZNep در محیط‌های پر توانی (pluripotency) و تسهیل‌کننده تمایز موجب افزایش به‏ترتیب 5/26 و 9/5 برابری بیان ژن شد. بیان ژن <em>Pdx1</em> داخلی خود سلول نیز در تیمار با DZNep افزایش یافت. <strong>نتیجه‌گیری:</strong> انتقال لنتی‌ویروسی ژن با MOI بیش از 10، روشی کارآمد برای انتقال ژن به سلول‌های ES موشی است، اما این روش به‌همراه استفاده از پروموتر CMV موجب خاموش شدن بیان ژن در درازمدت می‌شود. تیمار با DZNep موجب فعال شدن این سیستم بیانی می‌شود. اما می‌تواند با تاثیراتی بر بیان سایر ژن‌های سلول نیز همراه باشد.   https://jct.araku.ac.ir/article_18748_b8e4befbb79fa488a203763d887edb18.pdf