موسی گردانه؛ عباس رحیمی شم آبادی؛ عمران اسماعیل زاده
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود ...
بیشتر
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود آید. سپس ژن Nurr1 با آنزیمهای Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T را با این پلاسمید نهایی، بههمراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلولها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس بهدست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلولهای هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیمهای مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروسهای ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و بهدنبال آلوده سازی سلولهای انسانی HEK-293T با ویروسهای مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را بهطور موفقیت آمیز بیان کردند.
