سلول و بافت

چکیده هدف: ماده D-1,2,4 بوتان تریول یک ماده شیمیایی ارزشمند با کاربردهای گسترده در زمینه های مختلف است. هدف از انجام این مطالعه کلون‌سازی و بیان سطحی ژن آنزیم زایلوزدهیدروژناز از کلوباکتر ویبریوئیدس در ای. کلی میباشد. مواد و روش‌ها: برای دسترسی به باکتری ابتدا ژنوم باکتری مورد نظر استخراج شد. به منظور ساخت سویه‌ی بیان کننده آنزیم زایلوز دهیدروژناز ژن این پروتئین از باکتری کلوباکترویبریوئیدسCB1 تکثیر و به باکتری ای. کلی انتقال یافت. سپس ژن مورد نظربا استفاده از پرایمرهای طراحی شده به روش PCR تکثیر و ابتدا در وکتور کلونینگ pTZ57و سپس در وکتور بیانی pET 26 کلون شد. سپس بیان این آنزیم به وسیله‌ی SDS-PAGE و عملکرد آن با تغییر در جذب طول موج 340 نانومتر توسط NADH تولید شده مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: با انجام آزمایش های تاییدی و اطمینان از وجود ژن در وکتورها(با استفاده از آنزیم‌های محدودالاثر و تکثیر ژن به کمک واکنش زنجیره‌ای پلی‌مراز (Colony PCR) و فرآیند کلونینگ)، بیان و عملکرد این آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. وجود پروتئین نوترکیب توسط SDS-PAGE برای ژن زایلوز دهیدروژناز با وزن مولکولی 52.2 کیلودالتون بررسی و میزان بیان پروتئین نوترکیب با نرم افزار ImageJ ، تقریبا 25 درصد تخمین زده شد. نتیجه گیری:هدف از این تحقیق تنها ایجاد مسیر متابولیسمی تولید زایلونات در سویه ای. کلی به وسیله ی سطحی کردن اولین آنزیم این مسیر(زایلوزدهیدروژناز) بود که نتایج بدست آمده در این تحقیق موید فعال بودن این آنزیم در سطح سلول می‌باشد و برای تعیین میزان دقیق تولید و تکمیل کردن مسیرنیازمند بررسی های دیگرمی‌باشد.

چکیده هدف: 1،2،4-بوتان تریول (BT)، یک ماده شیمیایی غیرطبیعی با کاربردهای دارویی و نظامی، از ویژگی‫های این ماده است. تولید زیستی BT هدف این تحقیق است، زیرا روش شیمیایی به‫دلیل محدودیت‌های کاتالیزوری و بازده پایین، اقتصادی نیست. تولید آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلازبا هدف تکمیل مسیر آنزیمی سنتز زیستی BT می‌باشد که از زایلوز طی چهار واکنش آنزیمی انجام می‌شود و E. coli با دارا بودن دو آنزیم از این مسیر، با افزودن دو ژن دیگر، قادر به تکمیل آن خواهد بود. مواد و روش‫ها: به‫منظور ساخت سویه E. coli بیان‌کننده آنزیم بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز، ژن mdlC از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. پس از تایید کلونینگ با آزمایش‌های تاییدی، بیان پروتئین با ژل SDS-PAGE و عملکرد آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: پس از انتقال سازواره بیانی به سویه مناسب، حضور باند پروتئینی 56 کیلودالتونی در ژل SDS-PAGE، بیان ژن mdlC را تایید کرد. برای ارزیابی عملکرد آنزیم، وکتور نوترکیب pBAD.mdlC به سویه TOP10 ترنسفرم و تولید BT در محیط کشت با روش HPLC آنالیز شد. نتیجه‌گیری: بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز (BFD)، آنزیمی کلیدی در مسیر تولید بوتان تریول (BT) درE. coli  است. در این مطالعه، ژن mdlC کد کننده BFD از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. سیستم بیانی pET28 به‫دلیل سهولت استفاده انتخاب شد و وکتور pBAD نیز به‫دلیل قابلیت القا مورد استفاده قرار گرفت. بیان پروتئین 56 کیلودالتونی با SDS-PAGE تایید و عملکرد آنزیم در تولید BT با HPLC بررسی شد.