موسی گردانه؛ عباس رحیمی شم آبادی؛ عمران اسماعیل زاده
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود ...
بیشتر
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود آید. سپس ژن Nurr1 با آنزیمهای Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T را با این پلاسمید نهایی، بههمراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلول‌ها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس بهدست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلولهای هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیمهای مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروسهای ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و بهدنبال آلوده سازی سلولهای انسانی HEK-293T با ویروسهای مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را بهطور موفقیت آمیز بیان کردند.
عباس رحیمی شم آبادی؛ موسی گردانه؛ عمران اسماعیل زاده
چکیده
هدف: با تلفیق سیستم االقایی تتراسیکلین (Tet-inducible system) و ناقلین لنتی ویروسی، القا بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلولهای پرندگان مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها: ژن EGFP تحت کنترل سیستم Tet-ON قرار گرفت و بیان آن در سلولهای کبدی جوجه رده LMH بررسی شد. ابتدا باکتریهای مستعد با ناقل لنتی ویروسی القایی حامل EGFP بههمراه ...
بیشتر
هدف: با تلفیق سیستم االقایی تتراسیکلین (Tet-inducible system) و ناقلین لنتی ویروسی، القا بیان ژن گزارشگر Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در سلولهای پرندگان مورد بررسی قرار گرفت. مواد و روشها: ژن EGFP تحت کنترل سیستم Tet-ON قرار گرفت و بیان آن در سلولهای کبدی جوجه رده LMH بررسی شد. ابتدا باکتریهای مستعد با ناقل لنتی ویروسی القایی حامل EGFP بههمراه یک ناقل دوم که فعال کننده Tet (Tet-transactivator) بهنام rtTA-M2 را حمل میکرد ترانسفورم شده و ذخیره ماکسی پرپ خالصی از هریک از ایندو DNA پلاسمیدی فراهم شدند. سپس با روش رسوب DNA-فسفات کلسیم سلولهای LMH با ذخیره هردو پلاسمید ترانسفکت شد. در مرحله بعد، غلظتهای سریالی از آنالوگ Tet یعنی داکسی سیکلین را به محیط کشت سلول اضافه نمودیم بهطوریکه با افزایش غلظت DOX، بیان EGFP بیشتر القا گردید. نتایج: افزایش غلظت داکسی سایکلین افزایش بیان را به دنبال داشت. در 24 ساعت اول بعد از ترانسفکشن بیان بهترتیب برای غلظتهای 0 ، 01/0 ، 1/0 و 1 میکروگرم بر میلیلیتر داکسی سایکلین 4/0، 2/6 ، 3/10و 16 درصد و در 24 ساعت دوم بهترتیب 4/6 ، 26 ، 3/28 و7/29بود.با این .جود، افزایش بیش از حد غلظت داکسی سایکلین باعث مرگ سلول‌ها گردید. نتیجه گیری: تلفیق سیستمهای القایی Tet با منشا باکتریایی و لنتی ویروسهای نوترکیب مرتبط با انتقال ژن به سلولهای انسانی میتواند باعث القا ژن در سلولهای پرندگان شود. غلظت القا کننده بر میزان القا بیان ترانسژن تاثیر مستقیم میگذارد.
چکیده
هدف: اهداف این مطالعه سابکلونینگ ژن (PARK7) DJ-1 به درون وکتور انتقال لنتیویروسی، تولید لنتیویروسهای نوترکیب و آلوده سازی سلولهای هدف با این ویروسها میباشند.مواد وروشها: ژن DJ1 با استفاده از آنزیم های محدود کننده EcoR1 و Xho1 از وکتور pcDNA-DJ1 به دست آمد. وکتور انتقالی لنتی ویروس به صورت همزمان توسط آنزیم های محدود کننده ...
بیشتر
هدف: اهداف این مطالعه سابکلونینگ ژن (PARK7) DJ-1 به درون وکتور انتقال لنتیویروسی، تولید لنتیویروسهای نوترکیب و آلوده سازی سلولهای هدف با این ویروسها میباشند.مواد وروشها: ژن DJ1 با استفاده از آنزیم های محدود کننده EcoR1 و Xho1 از وکتور pcDNA-DJ1 به دست آمد. وکتور انتقالی لنتی ویروس به صورت همزمان توسط آنزیم های محدود کننده EcoR1 و Sal1 بریده شد. ژن DJ1 توسط آنزیم DNA لیگاز T4 به داخل وکتور ترانسفر و بالادست ژن DJ1 وارد شد، به طوریکه توالی DJ1-IRES-Jred در پایین دست و تحت کنترل پروموتر CMV قرار گرفت. برای تولید لنتی ویروس های نوترکیب، وکتور ساخته شده به همراه دو وکتور بسته بندی و پوشش ویروس به طور همزمان به درون سلول های HEK (Human Embryonic Kidney) انتقال داده شدند. ویروس های ساخته شده برای آلوده سازی سلول های هدف استفاده شدند.نتایج: برای اطمینان از درستی سابکلونینگ از تستهای آنزیمی و PCR استفاده شد. همچنین برای مشاهده بیان ژن Jred که نشان دهنده موفقیت ما در انتقال ژن می باشد، از میکروسکوپ فلورسانس استفاده شد. سپس برای مشاهده افزایش بیان ژن DJ1 در سلول های آلوده شده نسبت به سلول های طبیعی، از تست RT-PCR استفاده شد.نتیجه گیری: این مطالعه کاربرد موفقیت آمیز ناقلهای لنتیویروسی در انتقال ژن به سلولهای یوکاریوتی را نشان میدهد و روشن میسازد که این ناقلها میتوانند در درمان بیماریهای سیستم عصبی مورد استفاده قرار گیرند.
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی کارائی جذب DNA و انتقال ژن به سلولهای کبدی جوجه نژاد لگهورن در دو سطح ترانسفکشن و ترانسدوکشن با لنتی ویروسهای نوترکیب و شدت بیان ترانسژن میباشد.مواد و روشها:برای ترانسفکشن یا ترانسدوکشن ویروسی، سلول‌ها در پلیتهای 96 خانه کشت داده شدند و در مراحل مختلف با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده گردیدند. تعداد ...
بیشتر
هدف: هدف از این مطالعه بررسی کارائی جذب DNA و انتقال ژن به سلولهای کبدی جوجه نژاد لگهورن در دو سطح ترانسفکشن و ترانسدوکشن با لنتی ویروسهای نوترکیب و شدت بیان ترانسژن میباشد.مواد و روشها:برای ترانسفکشن یا ترانسدوکشن ویروسی، سلول‌ها در پلیتهای 96 خانه کشت داده شدند و در مراحل مختلف با میکروسکوپ فلورسنس مشاهده گردیدند. تعداد سلولهای GFP (Green Fluorescent Protein-positive) با نرم افزار Grid Cell Counter و شدت بیان ترانسژن با نرم افزار ImageJ محاسبه و دادهها با نرم افزار SPSS آنالیز شدند.نتایج: بیان ژن GFP، در سطح ترانسفکشن، در سلولهای HEK Human Embryonic Kidney)) و LMH (Chicken hepatoma cell line) به ترتیب 6 ساعت و 9 ساعت بعد از انتقال ژن و در مرحله ترانسدوکشن به ترتیب 22 ساعت و 36 ساعت بعد مشاهده شدند. شمارش سلولهای GFp +، 48 ساعت پس از ترانسفکشن نشان دادکه سلول های HEK و LMH به ترتیب 40 درصد و 35 درصد DNA را دریافت و بیان کردهاند. این مقادیر در 72 ساعت بترتیب به 95 درصد و 48 درصد رسید. شمارش سلولهای مثبت 72 و 96 ساعت پس از ترانسدوکشن ویروسی نیز الگوئی مشابه از نظر دریافت DNA توسط دو رده سلولی مزبور را به اثبات رسانید. لیکن آنالیز شدت بیان GFP نشان داد که رده HEK و LMH بترتیب 74 درصد و 89 درصد GFP را با اختلاف معنیداری (p <0.01) بیان کردند.نتیجه گیری: نتایج حاصله نشان داد که سلولهای HEK از قدرت جذب بالاتری برای دریافت DNA برخوردار هستند با این حال سلولهای LMH قادرند ژنهای خارجی را با شدت بیشتری بیان نمایند.
