سلول و بافت

چکیده هدف: طراحی و تهیه سازه ژنی مناسب و انتقال آن به گیاه توتون و بررسی گیاهان تراریخت حاصله بوده است.
مواد و روش‌ها: سازه اختصاصی بذر حاوی پیشبرنده Napin، توالی Ω ، ژن GUS و توالی SAR در پلاسمید pBI121 طراحی و تهیه و در باکتری E. coli تکثیر شد. ریزنمونه‌های برگی توتون با آگروباکتریوم سویه LBA4404 به‫روش استاندارد تلقیح شدند. گزینش جوانه‌های باززایی شده در محیط انتخابی (شامل MS، mg/l  1/0 NAA،  mg/l3 BAP ،mg/L 25 کانامایسین، mg/L 200 سفوتاکسیم) انجام شد. آنالیز گیاهان تراریخت با PCR، RT-PCR و آزمون هیستوشیمیایی انجام شد.
نتایج: بررسی مولکولی گیاهان باززایی شده با PCR و آغازگرهای اختصاصی ژن‌های nptII و GUS نشان‌دهنده انتقال این ژن‌ها به گیاه‫چه‌های باززایی شده بود. نتایج RT-PCR نشان داد که نسخه‌برداری از ژن nptII در هر دو بافت برگ و بذر صورت می‌گیرد در حالیکه نسخه‌برداری از ژن GUS تنها در بذر صورت می‌گیرد. با توجه به اینکه پیشبرنده NOS (کنترل‌کننده ژن nptII) عمومی و Napin (کنترل‌کننده ژن GUS) یک پیشبرنده اختصاصی بذر می‌باشد، این نتیجه مورد انتظار بود. در نهایت با استفاده از SDS-PAGE و آزمون هیستوشیمیایی، تولید و فعالیت آنزیم بتا-گلوکورونیداز در بذر گیاهان تراریخت تائید شد.
نتیجه‌گیری: نتایج مناسب بودن سازه ژنی طراحی شده را نشان داد، چرا که پیشبرنده Napin به خوبی موجب بیان اختصاصی ژن GUS در بذر شده و توالی امگا نیز در افزایش بیان تراژن موثر بوده است. در ادامه کار می‌توان این سازه را با جایگزینی ژن‌های ارزشمند با ژن  GUSبرای تولید پروتئینهای نوترکیب استفاده نمود.

چکیده هدف: حرکت آب از عرض غشاهای سلولی با حضور پروتئین‌هایی بنام ‌کانال آبی یا آکواپورین تسهیل می‌شود. کانال‌‌های آبی غشاپلاسمایی گیاهان به دو گروه PIP1s و PIP2s تقسیم می‌شوند که فعالیت انتقال آب متفاوتی را نشان می‌دهند به طوری که PIP1s غیرفعال بوده، در حالیکه PIP2s افزایش قابل توجهی را در ضریب نفوذپذیری آبی اسموتیک غشاء (p _f) موجب می‌شود. این تفاوت در فعالیت انتقال آب آن‌ها می‌تواند ناشی از مکان متفاوت آن‌ها در سلول باشد. هدف از این تحقیق بررسی مکان درون سلولی دو کانال آبی NtPIP1;1 (عضو گروه PIP1s) و NtPIP2;1 (عضو گروه PIP2s) در سلول‌های زنده مزوفیل برگ گیاه توتون است. 
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی توالی cDNA دو کانال آبی به توالی ژن کد کننده پروتئین فلورسانت سبز (GFP) متصل گردید و به طور موقتی در پروتوپلاست‌های تهیه شده از مزوفیل برگ توتون بیان شدند. سپس با استفاده از طول موج برانگیختگی نور آبی مکان درون سلولی این دو کانال آبی در زیر میکروسکوپ فلورسانس بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان داد که NtPIP1;1 در ساختارهای غشایی داخل سلول باقی مانده در حالی‏که NtPIP2;1 به غشا پلاسمایی منتقل می‌شود. بیان همزمان وکتور‌های حامل توالی NtPIP1;1-GFp و HDEL-YFp (نشانگر شبکه اندوپلاسمی متصل به پروتئین با فلورسانس زرد) در پروتوپلاست‌ها نشان داد که NtPIP1;1 در مکان‌هایی مشابه با HDEL (لیزین- آسپارتیک اسید- گلوتامیک اسید-لوسین) در سلول قرار می‌گیرد.
نتیجه گیری: کانال آبی NtPIP2;1 به غشاء پلاسمایی سلول مستقر شده در حالی‏که NtPIP1;1 در داخل شبکه آندوپلاسمی باقی مانده و به غشا پلاسمایی منتقل نمی‌شود و به همین دلیل فاقد فعالیت انتقال آب است.
 
 

چکیده هدف: تنظیم کنندگان رشد گیاهی می‌توانند تغییراتی در فرآیندهای فیزیولوژیک اعمال نمایند. هدف از این مطالعه، بررسی تاثیر جیبرلین (GA3) بر پروتئین های محلول و الگوی الکتروفورزی پروتئین‌های ریشه و برگ گیاهان تراریخت حامل Ri T-DNA دارای ساقه کوتاه توتون در مقایسه با شاهد می باشد.
مواد و روش‌ها: ابتدا تراریخت بودن گیاه توتون (Nicotiana tabacum L.) رقم  Wisconsinبا روش PCR مورد تایید قرارگرفت. سپس گیاهان غیر تراریخت و تراریخت به مدت 4 هفته درون محیط کشت MS حاوی GA3 با غلظت های 0، 2/0 و 4/0 میلی گرم در لیتر  در شرایط درون شیشه کشت داده شدند. پروتئین محلول کل ریشه و برگ گیاهان تراریخت و غیر تراریخت تحت تیمار GA3 استخراج و اندازه گیری شد. همچنین الگوی الکتروفورزی پروتئین های ریشه و برگ این گیاهان با روش SDS-PAGE  بررسی گردید.
نتایج: تراریخت بودن گیاهان مورد آزمایش با استفاده از پرایمر ژن آنزیم بتاگلوکورونیداز (GUS) اثبات گردید. بررسی پروتئینی ریشه و برگ گیاهان غیر تراریخت و تراریخت تیمار شده با غلظت‌های مختلف جیبرلین نشان داد که تیمار خارجی تاثیر معنی ‌داری در افزایش پروتئین‌های محلول کل ریشه و برگ گیاهان غیر تراریخت و تراریخت دارد. همچنین جیبرلین موجب افزایش بیان باندهای پروتئینی در الگوی الکتروفورزی پروتئین‌ها گردید.
‍ نتیجه گیری: تصور می شود جیبرلین خارجی، بیوسنتز پروتئین در ریشه و برگ‌ها را از طریق تاثیر بر فرآیند های نسخه برداری و ترجمه القا می کند. جیبرلین همچنین از فعالیت آنزیم های تجزیه کننده پروتئین ممانعت می نماید.
 
 

چکیده هدف: گیاه توتون  (Nicotiana tabacum L.)حاوی مقدار زیادی آلکالوئید نیکوتین است که برای سلامتی انسان مضر است. دست‌ورزی‏های ژنتیکی از جمله انتقال ژن‌های مسدود کننده مسیر بیوسنتز نیکوتین، القاء موتاسیون، ایجاد تغییرات سوماکلونال و انتقال  T-DNA به منظور القاء تغییرات مناسب ژنتیکی برای کاهش بیان آنزیم‌های کلیدی مسیر تولید نیکوتین می‌تواند موجب تغییر در میزان نیکوتین در این گیاه گردد، لذا این تحقیق با هدف بررسی تغییرات نیکوتین در گیاهان توتون جهش یافته با T-DNA طراحی و انجام گرفت.
مواد و روش‌ها: در مطالعه حاضر گیاهان جهش‌ یافته  K4حاوی (T-DNA)، گیاهان حاوی Ri-TDNA، گیاهان باززائی شده از برگ و گیاهان طبیعی روی محیط کشت  MSحاوی آنتی‌بیوتیک کانامایسین تکثیر یافتند. سپس برگ‌های گیاهان جهش‌یافته و طبیعی جداگانه خشک و آسیاب شدند. عصاره استخراج شده توسط هگزان از بافت برگ، توسط TLC و GC از نظر کیفی و کمی مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: آنالیز عصاره‌‌های حاصله کاهش میزان نیکوتین در گیاه جهش‌یافته K4 و افزایش آن را در گیاهان باززایی شده و جهش یافته Ri-TDNA نسبت به گیاهان طبیعی مادری نشان دادند.
نتیجه گیری: احتمالاً تغییر در میزان نیکوتین در گیاهان جهش‌یافته و باززائی شده به خاطر فعال‌سازی ژن‌های آنزیم‌های کلیدی مسیر بیوسنتز آلکالوئید نیکوتین در مورد گیاه جهش‌یافته حاوی Ri-TDNA و بالعکس خاموش شدن و یا کاهش بیان این ژن‌ها در گیاه جهش یافته  K4 (حاوی T-DNA) می باشند.
 

چکیده هدف: حرکت آب از عرض غشاءهای سلولی در اثر حضور کانال‌های آبی به نام آکواپورین‌ها (AQPs) تسهیل می‌شود. ترکیبات جیوه یکی از بازدارنده‌های قوی آکواپورین‌های گیاهی و جانوری می‌باشند.  به هر حال چندین فرم مشابه از آکواپورین‌ها مانند NtAQP1 در گیاه توتون توسط جیوه ممانعت نمی‌شوند. هدف از این تحقیق بررسی حساسیت آکواپورین NtPIP2;1 جداسازی شده از توتون نسبت به جیوه است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه تجربی پس از سنتز cRNA  مربوط به NtPIP2;1، تزریق آن به داخل اووسیت‌های زنوپوس توسط میکرواینجکشن صورت گرفت. پس از دو روز انکوبه کردن اووسیت‌ها، آنها به مدت 10 دقیقه در معرض 1 میلی‌مولار کلرور جیوه قرار گرفته،  سپس آزمون انبساط حجم اووسیت در محیط هیپوتونیک انجام و ضریب نفوذپذیری غشاء ( Pf) اووسیت تعیین شد.
نتایج: Pf محاسبه شده برای اووسیت‌های گروه کنترل و تیمار شده با کلرور جیوه که هر دو آکواپورین NtPIP2;1 را بیان می‌کنند به ترتیب برابر با ^2-10×99/0 و^2-10×98/0 سانتیمتر بر ثانیه بود که تفاوت معنی‌داری  با یکدیگر نشان ندادند(p>0.05). مقایسه توالی اسید آمینه آکواپورین NtPIP2;1 با NtAQP1 (غیرحساس به جیوه) نشان داد که NtPIP2;1 همانند NtAQP1 در نزدیک منفذ آبی دارای اسید‌ آمینه ترئونین به جای سیستئین می‌باشد.
نتیجه‌ گیری: NtPIP2;1 یک آکواپورین غیر حساس به جیوه را در گیاه توتون کدگذاری می‌کند و این به دلیل جایگزینی اسیدآمینه سیستئین در نزدیک منفذ آبی با ترئونین می‌باشد.