مینا رسول نژاد؛ موسی گردانه؛ فرزانه صابونی
چکیده
هدف: در این تحقیق از بیشبیان فاکتورهایNurr1 و GDNF، بهدلیل پتانسیل ضدالتهابی و ترمیمی آنها و نیز نقش Nurr1در تنظیم بیان ژن گیرنده GDNF(Ret)، با هدف حفاظت سلولهای دوپامینسازSH-SY5Y در مقابل التهاب عصبی و نیز مسمومیت 6-OHDA استفاده شد.مواد و روشها: ابتدا لنتیویروسهای نوترکیب حامل ژنهایNurr1 وGDNF تهیه و بهترتیب به سلولهای ...
بیشتر
هدف: در این تحقیق از بیشبیان فاکتورهایNurr1 و GDNF، بهدلیل پتانسیل ضدالتهابی و ترمیمی آنها و نیز نقش Nurr1در تنظیم بیان ژن گیرنده GDNF(Ret)، با هدف حفاظت سلولهای دوپامینسازSH-SY5Y در مقابل التهاب عصبی و نیز مسمومیت 6-OHDA استفاده شد.مواد و روشها: ابتدا لنتیویروسهای نوترکیب حامل ژنهایNurr1 وGDNF تهیه و بهترتیب به سلولهای SH-SY5Y و آستروسیتوما ترانسداکت شدند. همچنین برای تولید بهینه فاکتور GDNF، سلولهای HEK-293T با ناقل پلاسمیدی مربوطه ترانسفکت و محیط مشروط آنها و نیزسلولهای آستروسیتوما، حاوی فاکتور GDNF، جمعآوری شد. بیشبیان ژنهای مزبور با RT-PCR به اثبات رسید. از سوی دیگرسلولهای میکروگلیا از مغز نوزاد رت جداسازی و متعاقبا با لیپوپلی ساکارید (LPS) فعال و نهایتا بیان فاکتورهایTNF-α و iNOS در آنها با تستگریسوRT-PCR اثبات شد؛ محیط مشروط میکروگلیا جمعآوری و بههمراه محیط مشروط سلولهای آستروسیتوما/HEK-293T به سلولهای SH-SY5Yافزوده شد. ردهیSH-SY5Y بهصورت جداگانه نیز با محیط مشروط آستروسیتوما / HEK- 293T و توکسین 6-OHDA تیمار شد.نتایج: آنالیز MTT نشان داد سلولهای SH-SY5Y با بیان فزایندهNurr1 و یا در حضور GDNF، مقاومت بیشتری در برابر التهاب عصبی و توکسین6-OHDA نشان میدهند. همچنین GDNF و Nurr1 با هم اثر سینرژیک داشته و مقاومت بیشتری را به سلولهای دوپامینساز عطا میکنند.نتیجهگیری: فاکتورهایNurr1 و GDNF به تنهایی و نیز بهصورت توام و سینرژیک، اثر حفاظتی بر نورونهای دوپامینساز در مقابل عوامل التهابی و توکسین 6-OHDA دارند.
سینا لاسمی؛ موسی گردانه؛ پروین اکبری
چکیده
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی میباشد. مواد و روشها: ابتدا لنتی ویروسهای نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارشگر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلولها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی بهنامهای ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن ...
بیشتر
هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلولهای دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی میباشد. مواد و روشها: ابتدا لنتی ویروسهای نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارشگر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلولها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی بهنامهای ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن سلولهای HEK-293T بهعنوان رده سلولی مولد ویروس بهکار برده شدند. محیط سلولهای ترانسفکت شده 24 و 48 ساعت جمع آوری و تغلیظ شد تا ذخیرة لنتی ویروسی بهدست آید. بهدنبال ترانسدوکشن سلولهای دوپامین ساز PC12 با این ذخیرة غلیظ ویروسی، سلولهای مزبور افزایش بیان DJ-1 را آغاز کردند. پس از تیمار این سلولها با توکسین 6-OHDA، میزان بقای آنها در مقایسه با شاهد اندازهگیری شد. نتایج: مراحل ترانسفکشن سلولهای HEK-293T و آلودگی سلولهای PC12 با ذخیرة ویروسی بهطور موفقیت آمیز به انجام رسید، زیرا بیان ژن گزارشگر Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزایش بیان DJ-1 با تکنیک RT- PCR اثبات شد. آزمایشهای بعدی نشان داد که افزایش بیان DJ-1 باعث افزایش چشمگیری در بقای سلولهای PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA میشود. درصد بقای سلولهای PC12 که افزایش بیان DJ-1 داشتند، در حدود 30 درصد بیشتر از درصد بقای سلولهای کنترل برآورد شد و این افزایش از نظر آماری معنیدار بود. نتیجهگیری: افزایش بیان ژن DJ-1 در سلولهای دوپامین ساز PC12 مقاومت و بقای این سلولها را در برابر سمیت نورونی 6-OHDA بهطور معنیدار و چشمگیری افزایش میدهد.
موسی گردانه؛ عباس رحیمی شم آبادی؛ عمران اسماعیل زاده
چکیده
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود ...
بیشتر
هدف: هدف این تحقیق تولید لنتی ویروسهای حامل ژن Nurr1 و بیان در سلولهای انسانی میباشد. مواد و روشها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیمهای Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیمهای Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن کور شد. قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) بهوجود آید. سپس ژن Nurr1 با آنزیمهای Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروسهای نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T را با این پلاسمید نهایی، بههمراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلولها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس بهدست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلولهای هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیمهای مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروسهای ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و بهدنبال آلوده سازی سلولهای انسانی HEK-293T با ویروسهای مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را بهطور موفقیت آمیز بیان کردند.
