سلول و بافت

چکیده هدف: در این تحقیق از بیش­بیان فاکتورهایNurr1 و GDNF، به‏دلیل پتانسیل ضدالتهابی و ترمیمی آن‏ها و نیز نقش  Nurr1در تنظیم بیان ژن گیرنده GDNF(Ret)، با هدف حفاظت سلول‏های دوپامین­سازSH-SY5Y در مقابل التهاب عصبی و نیز مسمومیت 6-OHDA  استفاده شد.
مواد و روش­ها: ابتدا لنتی­ویروس‏های نوترکیب حامل ژن‏هایNurr1 وGDNF تهیه و به‏ترتیب به سلول‏های SH-SY5Y و آستروسیتوما ترانسداکت شدند. همچنین برای تولید بهینه فاکتور GDNF، سلول‏های HEK-293T با ناقل پلاسمیدی مربوطه ترانسفکت و محیط مشروط آن‏ها و نیزسلول‏های آستروسیتوما، حاوی فاکتور GDNF، جمع­آوری شد. بیش­بیان ژن‏های مزبور با RT-PCR به اثبات رسید. از سوی دیگرسلول‏های میکروگلیا از مغز نوزاد رت جداسازی و متعاقبا با لیپوپلی ساکارید (LPS) فعال و نهایتا بیان فاکتورهایTNF-α و iNOS در آن‏ها با تستگریسوRT-PCR اثبات شد؛ محیط مشروط میکروگلیا جمع­آوری و به‏همراه محیط مشروط سلول‏های آستروسیتوما/HEK-293T  به سلول‏های  SH-SY5Yافزوده شد. رده­یSH-SY5Y به‏صورت جداگانه نیز با محیط مشروط آستروسیتوما / HEK- 293T و توکسین 6-OHDA تیمار شد.
نتایج: آنالیز MTT نشان داد سلول‏های SH-SY5Y با بیان فزاینده­Nurr1  و یا در حضور GDNF، مقاومت بیشتری در برابر التهاب عصبی و توکسین6-OHDA نشان می‏دهند. همچنین GDNF و Nurr1 با هم اثر سینرژیک داشته و مقاومت بیشتری را به سلول‏های دوپامین­ساز عطا می‏کنند.
نتیجه­گیری: فاکتورهایNurr1  و GDNF به تنهایی و نیز به‏صورت توام و سینرژیک، اثر حفاظتی بر نورون‏های دوپامین­ساز در مقابل عوامل التهابی و توکسین 6-OHDA دارند.

چکیده هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر DJ-1 بر افزایش بقای سلول‏های دوپامین ساز در برابر سمیت پارکینسونی  می‏باشد.
مواد و روش‏ها:  ابتدا لنتی ویروس‏های نوترکیب ناقل توام ژن های DJ-1 و گزارش‏گر Jred تولید شده و برای آلوده سازی سلول‏ها استفاده شدند. بدین منظور سه پلاسمید لنتی ویروسی به‏نام‏های ناقل، بسته بندی و غشا برای ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T به‏عنوان رده سلولی مولد ویروس به‏کار برده شدند. محیط سلول‏های ترانسفکت شده 24 و 48 ساعت جمع آوری و تغلیظ شد تا ذخیرة لنتی ویروسی به‏دست آید. به‏دنبال ترانسدوکشن سلول‏های دوپامین ساز PC12 با این ذخیرة غلیظ ویروسی، سلول‏های مزبور افزایش بیان DJ-1 را آغاز کردند. پس از تیمار این سلول‏ها با توکسین 6-OHDA، میزان بقای آن‏ها در مقایسه با شاهد اندازه‏گیری شد.
نتایج: مراحل ترانسفکشن سلول‏های HEK-293T و آلودگی سلول‏های PC12 با ذخیرة ویروسی به‏طور موفقیت آمیز به انجام رسید، زیرا بیان ژن گزارش‏گر Jred با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس در هر دو مرحله مشاهده شد. سپس افزایش بیان DJ-1 با تکنیک RT- PCR اثبات شد. آزمایش‏های بعدی نشان داد که افزایش بیان DJ-1 باعث افزایش چشم‏گیری در بقای سلول‏های PC12 در برابر سمیت ناشی از 6-OHDA می‏شود. درصد بقای سلول‏های PC12 که افزایش بیان DJ-1 داشتند، در حدود 30 درصد بیشتر از درصد بقای سلول‏های کنترل برآورد شد و این افزایش از نظر آماری معنی‏دار بود.
نتیجه‏گیری: افزایش بیان ژن DJ-1 در سلول‏های دوپامین ساز PC12 مقاومت و بقای این سلول‏ها را در برابر سمیت نورونی 6-OHDA به‏طور معنی‏دار و چشم‏گیری افزایش می‏دهد.
 

چکیده هدف: هدف این تحقیق تولید  لنتی ویروس‏های حامل ژن Nurr1 و بیان در سلول‏های انسانی می‏باشد. مواد و روش‏ها: قطعه ژنی IRES-EGFP با آنزیم‏های Bgl ll/Not1 از ناقل pIRES2-EGFP جدا و با Klenow کور (Blunt) گردید. ناقل لنتی ویروسی  pNL-EGFP/CMV/WPREdU3 با آنزیم‏های Nhe1/ Xho1 برش و دو سر آن  کور شد.  قطعه ژنی ایزوله شده به این ناقل منتقل شد تا سازه لنتی ویروسی (I) به‏وجود آید. سپس ژن Nurr1  با آنزیم‏های Xho1 و BamH1 از ناقل PCMX-NOT بریده و درون پلاسمید (I) خطی شده باSal1 و BamH1 منتقل شد تا سازه نهایی لنتی ویروسی (II) تولید گردد. برای تولید لنتی ویروس‏های نوترکیب، رده سلول انسانی HEK-293T  را با این پلاسمید نهایی، به‏همراه پلاسمیدهای غشایی و بسته بندی لنتی ویروس ترانسفکت شد. محیط این سلول‏ها که مملو از ذرات ویروسی شده بود جمع آوری و از ستون آمیکون عبور داده شد تا ذخیره غلیظ ویروس به‏دست آید. این ذخیره برای آلوده سازی سلول‏های هدف استفاده شد. بیان EGFP در زیر میکروسکوپ به اثبات رسید و بیان ژن Nurr1 با RT-PCR سنجیده شد. نتایج: درستی مراحل کلونینگ با آنزیم‏های مربوطه اثبات شد. با میکروسکوپ فلورسنس بیان Enhanced Green Fluorescent Protein (EGFP) در هر دو مرحله ترانسفکشن و ترانسدوکشن ثابت گردید. تکنیک RT-PCR بیان Nurr1 را در هردو مرحله به اثبات رسانید. نتیجه گیری: لنتی ویروس‏های ناقل ژن انسانی Nurr1 تولید شده و به‏دنبال آلوده سازی سلول‏های انسانی HEK-293T با ویروس‏های مزبور، سلولهای فوق ژن Nurr1 را به‏طور موفقیت آمیز بیان کردند.