سلول و بافت

چکیده هدف: مسیر بیوسنتز کلروفیل یکی از اهداف مهم ایجاد تغییرات ژنتیکی به‫منظور تغییر سرعت فتوسنتز و رشد گیاهان برای تامین افزایش تقاضای غذا در جمعیت رو به رشد جهان است. در این مطالعه تاثیر فوق بیان ژن GSA یکی از ژن‌های مسیر بیوسنتز کلروفیل بر شرایط فیزیولوژیکی گیاه تنباکو مورد بررسی قرار گرفت. 5-آمینولوولینیک اسید (ALA) محصول ژن GSA است. ALA پیش‌ساز ساخت تتراپیرول‌ها است. این ترکیب نقش بسیار مهمی در سلول‌های زنده دارد مثلا به‫عنوان رنگدانه‌ها، گیرنده نور (فیتوکروم)، گروه پروستاتیک بسیاری از پروتئین‌ها (مثل سیتوکروم‌ها، هموگلوبین، میوگلوبین و لگ هموگلوبین) و آنزیم‌ها (مثل کاتالاز، آسکوربات، پراکسیداز و غیره) نقش دارند. امروزه ALA به‫دلیل استفاده گسترده از آن در کشاورزی، جنگلداری و داروسازی مورد توجه زیادی قرار گرفته است. ALA در غلظت‌های پایین فتوسنتز، رشد و نمو، عملکرد و بهره‌وری را افزایش می‌دهد. همچنین ظاهر، رنگ میوه ، کیفیت و طعم محصولات را در گیاهان تیمار شده در شرایط عادی و استرس‌زا افزایش می‌دهد. ALA همچنین ویژگی‌های آنتی اکسیدانی، جذب مواد مغذی، راندمان مصرف آب و تعادل اسمزی را در گیاهان بهبود می‌بخشد. مواد و روش‌‌ها: در این تحقیق با توجه به مطالعات بیوانفورماتیکی cDNA ژن MsGSA گیاه یونجه رقم اصفهانی برای انتقال به گیاه تنباکو رقم Xanthi انتخاب گردید. از ناقل بیانی دوگانه گیاهی ‏pBI121‎‏ که دارای ژن مقاومت آنتی‌بیوتیک کانامایسین برای انتخاب در باکتری‌ها و گیاهان، محل‌های برش برای آنزیم‌های SacI و BamHI، پروموتر CaMV35S (پرموتور ویروس موزاییک گل کلم)، توالی خاتمه دهنده­ی نسخه‌برداری nos و ژن گزارشگر β-گلوکورونیداز (GUS) استفاده شد. پس از ساخت سازه ژنی
 pBI121-GSA و تایید انتقال سازه با استفاده از سه روش کلون PCR، هضم آنزیمی و ترادف‌یابی سازه مربوطه به اگروباکتریوم تومفسینس سویه  LB4404انتقال داده شد. با استفاده از اگروباکتریوم واجد سازه ژنی، ژن مربوطه به ژنوم گیاه تنباکو منتقل و گیاهان تراریخته روی محیط گزینشی انتخاب شدند و وجود ژن با انجام PCR در گیاهان باززایی شده تایید شد. جوانه‌های تراریخته ریشه‌دار شده به خاک منتقل شدند. میزان بیان ژن GSA در گیاهان تراریخته حاصل با RT-PCR مورد ارزیابی قرار گرفت و میزان رشد و محتوای بیوشیمیایی آن‌ها مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: نتایج نشان داد که رشد گیاهان تراریخته به‫صورت معنی‌داری بسته به میزان بیان ژن GSA افزایش یافت همچنین محتوای ALA (آمینولوولینیک اسید)، کلروفیل a، b و کلروفیل کل که محصول بیان ژن مربوطه می‌باشد. همچنین نتایج نشان می‌دهد که محتوای آنتوسیانین‌ها، فلاونوئیدها و ترکیبات فنل گیاهان تراریخته متناسب با میزان افزایش بیان ژن GSA به‫طور معنی‌داری نسبت به گیاهان تیپ وحشی افزایش پیدا کرده است.
نتیجه‌گیری: افزایش میزان رشد، محتوای کلروفیل a،b ، کلروفیل کل،  ALA، آنتوسیانین، فلاونوئیدها و فنل گیاهان تراریخته متناسب با میزان افزایش بیان ژن GSA است و این بیانگر افزایش توان رشدی و افزایش پتانسیل مقاومت در گیاهان تراریخته تحت تاثیر ژن انتقالی GSA و افزایش محتوایALA  است

چکیده هدف: در این پژوهش، به‏منظور بررسی تاثیر خاموشی بر بیان ژن کلیدی DBOX (که آنزیم نهایی بیوسنتز دو آلکالوئید سنگوینارین و پاپاورین را کد می‌کند)، از فن VIGS در گونه ای از خشخاش (Papaver somniferum L.) استفاده شد.
 مواد و روش‌ها: قطعه 350 جفت بازی از توالی ژن DBOX (در محدوده  bp1462-1112) براساس تولید بیشترین تعداد siRNA با طول 21 نوکلئوتید انتخاب شد. پس از همسانه‌سازی این قطعه در ناقل واسط pTZ57R/T و انتقال به ناقل ویروسی pTRV2، مایع تلقیح آگروباکتریوم حاوی سازه خاموشی به برگ‌های بوته‌های گیاه تزریق شد. گیاهان تراریخت اولیه توسط واکنش PCR با استفاده از آغازگرهای ژن کد کننده پوشش پروتئینی ویروس (CP) انتخاب و غربالگری ثانویه توسط تکنیک PCR نیمه کمی صورت گرفت. در مرحله بعد نمونه‌هایی با بیشترین خاموشی (کمترین بیان) ژن مورد نظر توسط تکنیک real-time RT-PCR مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: صحت همسانه‌سازی در پلاسمیدهای  pTZ57R/Tو pTRV2 با استفاده از واکنش‌های PCR و هضم آنزیمی تائید شد. براساس نتایج PCR نیمه کمی، تعداد 5 بوته تراریخت با کمترین بیان برای ژن DBOX انتخاب شدند. نتایج نهایی real-time RT-PCR به‏طور متوسط بیانگر کاهش نسبی 81 درصدی در بیان رونوشت‌های ژن DBOX در گیاهان تراریخت در مقایسه با گیاهان کنترل (تلقیح شده با پلاسمید خالی pTRV2) بود.
نتیجه‌گیری: به‏طور کلی نتایج نشان داد که فن VIGS به‏طور موفقیت آمیزی می‌تواند میزان بیان ژن DBOX را در گیاه خشخاش کاهش دهد. به‏علاوه از نتایج به‏دست آمده در خصوص این ژن، می‌توان در درک بیشتر مسیر بیوسنتزی آلکالوئیدهای گیاه خشخاش و تولید گیاهان تراریخت با اهداف مهندسی متابولیت بهره برد.
 

چکیده هدف: گیاه دارویی شقایق (Papaver somniferum L.) تنها منبع تجاری از آلکالوئیدهای دارویی بنزوفنانترین از زیر گروه آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین  است که  شامل مسکن­های ضد درد مانند کدئین و داروهای نیمه مصنوعی اکسی کدون، باپرنورفین و نالتروکسون می­باشد. اگرچه بیشتر ژن­های مسیر این آلکالوئیدها شناسایی شده­اند، ولی تنظیم پس از نسخه­برداری ژن­های مسیر آلکالوئیدهای آن‏ها به­خوبی شناسایی نشده است. خاموش سازی القایی با ویروس (virus induced gene slencing) یکی از روش‏های سریع برای خاموشی ژن است که در این تحقیق از این روش برای بررسی خاموشی یکی از ژن‏های مهم مسیر آلکالوئیدهای این گیاه استفاده شد.
مواد و روش‏ها: در این تحقیق به‏­منظور کاهش سیستماتیک در سطوح بیان ژن آنزیم­های مسیر تولید آلکالوئیدهای بنزیل ایزوکوئینولین از VIGS استفاده شد. جهت خاموشی ژن کدئین رداکتاز (Codeinone Reductase) از ناقل pTRV جهت همسانه­سازی استفاده شد. انتقال آگروباکتری حاوی سازه مورد نظر به برگ­های 2 تا 3 هفته­ای با استفاده از روش اگرواینفیلتراسیون انجام شد.
نتایج: نتایج همسانه­سازی این ژن با استفاده از روش­های مختلف مولکولی همانند PCR و هضم آنزیمی مورد تایید قرار گرفت. ترا ریختگی گیاهان تلقیح شده با سازه ژنتیکی مورد نظر با استفاده از PCR اثبات شد. تعیین سطوح نسخه­برداری ژن هدف با استفاده از فن PCR نیمه کمی و PCR در زمان واقعی نشان داد که بیان ژن   COR حدود 89 درصد کاهش یافته است.
نتیجه‌گیری: نتایج این تحقیق نشان داد که با استفاده از روش تداخل RNA، بیان ژن کدئین رداکتاز به‏صورت معنی‌داری در مقایسه با شاهد کاهش بیان داشت.