سلول و بافت

چکیده هدف: 1،2،4-بوتان تریول (BT)، یک ماده شیمیایی غیرطبیعی با کاربردهای دارویی و نظامی، از ویژگی‫های این ماده است. تولید زیستی BT هدف این تحقیق است، زیرا روش شیمیایی به‫دلیل محدودیت‌های کاتالیزوری و بازده پایین، اقتصادی نیست. تولید آنزیم بنزیل فورمات دکربوکسیلازبا هدف تکمیل مسیر آنزیمی سنتز زیستی BT می‌باشد که از زایلوز طی چهار واکنش آنزیمی انجام می‌شود و E. coli با دارا بودن دو آنزیم از این مسیر، با افزودن دو ژن دیگر، قادر به تکمیل آن خواهد بود. مواد و روش‫ها: به‫منظور ساخت سویه E. coli بیان‌کننده آنزیم بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز، ژن mdlC از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. پس از تایید کلونینگ با آزمایش‌های تاییدی، بیان پروتئین با ژل SDS-PAGE و عملکرد آنزیم مورد بررسی قرار گرفت. نتایج: پس از انتقال سازواره بیانی به سویه مناسب، حضور باند پروتئینی 56 کیلودالتونی در ژل SDS-PAGE، بیان ژن mdlC را تایید کرد. برای ارزیابی عملکرد آنزیم، وکتور نوترکیب pBAD.mdlC به سویه TOP10 ترنسفرم و تولید BT در محیط کشت با روش HPLC آنالیز شد. نتیجه‌گیری: بنزوئیل فرمات دکربوکسیلاز (BFD)، آنزیمی کلیدی در مسیر تولید بوتان تریول (BT) درE. coli  است. در این مطالعه، ژن mdlC کد کننده BFD از P. putida تکثیر و در وکتورهای pBAD و pET28 کلون شد. سیستم بیانی pET28 به‫دلیل سهولت استفاده انتخاب شد و وکتور pBAD نیز به‫دلیل قابلیت القا مورد استفاده قرار گرفت. بیان پروتئین 56 کیلودالتونی با SDS-PAGE تایید و عملکرد آنزیم در تولید BT با HPLC بررسی شد.

چکیده کلون سازی و بیان ژن آنزیم زایلونات دهیدراتاز از کلوباکتر ویبریوئیدس

چکیده هدف: در قرن حاضر، تولید داروهای نوترکیب افزایش یافته است. از جمله این داروها، هورمون رشد می‏باشد که به‏علت مشکلاتی که در پروسه­ی بیان نوع سیتوپلاسمی و پری پلاسمی این پروتئین وجود دارد، یافتن راه حلی که بتواند بیان را بهینه نماید ضروری به‏نظر می‏رسد. لذا در این تحقیق با استفاده نمودن از trx-tag بیان هورمون رشد را به‏صورت محلول بهینه شد که علاوه بر افزایش بیان پرتئین (حل مشکل پری پلاسمی) از تشکیل انکلوزیون بادی (مشکل سیتوپلاسمی) جلوگیری می‏نماید.
مواد و روش­ها: سنتز ژن و کاست ژنی به‏منظور بیان هورمون رشد در سیستم بیانی pET 32a صورت گرفت. کاست ژنی شاملtrx-tag  برای محلول سازی پروتئین،His tag  به‏منظور خالص سازی و انتروکیناز در ابتدای ژن rHgh به‏منظور جداسازی برچسب های قبلی از این پروتئین می‏باشد.
نتایج: بعد از کلون سازی این ژن در وکتور و بیان آن، تایید آن توسط وسترن بلات صورت گرفت. نتایج به‏دست آمده با استفاده از نرم افزارهای آنالیز ژل درصد بیانی حدود  از کل بیان را در سویه نوترکیب نشان می­دهد.
نتیجه گیری: در این تحقیق، نشان داده شد که با استفاده از Trx-tag می‏توان پروتئین را به‏حالت محلول در آورد و میزان بیان را بالا برد در ادامه با انجام مراحل  تخمیر و پایین دستی می‏توان به نتایج بهتری دست یافت.
 

چکیده هدف: هدف این پژوهش کلون سازی و بیان ژن کد کننده‏ی میدکاین انسانی در اشریشیاکولای بوده که پس از انجام مراحل لازم در مقیاس آزمایشگاهی محقق گردید.
مواد و روش‏ها: روش‌ها شامل کشت سلول، استخراج RNA، ساخت cDNA، تکنیک‌های کلون‌سازی، القای بیان با IPTG (ایزوپروپیل‌تیوگالاکتوزیداز)، ارزیابی بیان به‏وسیله‌ی ژل پلی‌اکریل‌آمید و تایید توسط وسترن بلات بود.
نتایج: ژن میدکاین در pET-21a(+) کلون و سپس به اوریگامی منتقل شد. این فاکتور رشد در کلونی حاوی pET-21a(+) نوترکیب پس از 16 ساعت انکوباسیون در دمای 18 درجه سانتی‏گراد با هم زدن در 250 دور در دقیقه، در سطح سیتوپلاسمی بیان گردید. بیان پروتئین 13 کیلودالتونی دارای دم هیستیدینی از طریق وسترن بلات مورد تایید قرار گرفت.
نتیجه‌گیری: با‌توجه به اینکه سویه اوریگامی در ژن های TrxB و gor جهش یافته است، سینوپلاسم محیطی اکسید کننده می باشد، به‏همین سبب باعث افزایش تشکیل باندهای دی سولفید می‏شود. بنابراین به‏نظر می‏رسد که پس از بیان میدکاین، باقی مانده‏های سیتوزین به‏صورت محلول باقی می‏مانند. این شرایط باعث به‏وجود آمدن محیط مناسبی برای فولدینگ صحیح پروتئین و حل شدن آن می‏شود.