مقدمه

سرطان یکی از شایع‏ترین دلایل مرگ و میر در جهان است (2،1) که از این میان سرطان پستان در خانم‏ها بسیار رایج می‏باشد و سلامت آن‏ها را به‏خطر می‏اندازد (3). در سال 2018، 627 هزار مرگ ناشی از ابتلا به این بیماری گزارش شده است (4). سرطان پستان یک بیماری چند عاملی است (5) و عمده دلایل در ایجاد این بیماری عبارتند از جنسیت (6)، سن، فاکتورهای تولید مثلی (7)، فاکتورهای هورمونی (8)، فاکتورهای ژنتیکی (9)، سن یائسگی (10،11)، سقط (12)، تاریخچه خانوادگی (7)، تراکم بافت پستان (13) و سبک زندگی (15،14،7). میزان شیوع و مرگ‏ومیر حاصل از این بیماری در بخش‏های مختلف جهان به‏دلیل فاکتورهای ژنتیکی و محیطی متنوع و سبک زندگی متفاوت می‏باشد (16). از بزرگ‏ترین محدودیت‏های داروهای ضدسرطان، مقاومت سلول‏های سرطانی نسبت به داروها است (17). مناسب‏ترین روش درمانی توسط پزشک و بیمار و با توجه به مرحله و خصوصیات زیستی سرطان، سن بیمار، خطرات و فواید هر روش درمانی انتخاب می‏شود. برخی از روش‏های درمان سرطان شامل: جراحی، پرتودرمانی، شیمی درمانی، هورمون درمانی و گیاه درمانی می‏باشندکه گیاهان به‏علت عدم عوارض جانبی نسبت به داروهای شیمیایی بیشتر مورد توجه قرار گرفته‏اند (18). از گیاهان دارویی می‏توان به گیاه درمنه یا آرتمیزیا (A. sieberi) اشاره کرد که بالغ بر 400 گونه از این جنس در جهان و 34 گونه در ایران گزارش شده است. گیاه درمنه متعلق به تیره کاسنیان (Asteraceae) می‏باشد. این گیاه بوته‏ای و معطر بوده و رنگ آن سبز متمایل به خاکستری است، بسیار پر شاخه و طعم آن تلخ می‏باشد (19). ترکیبات موثر آن آلفاتیوجون (alphathujone)، کامفور (camphor)، بتاتیوجون (betathujone)، 1 و 8 سینئول (1,8-cineole) می‏باشد (20). گیاه آرتمیزیا در درمان بیماری‏های مختلف انگلی، باکتریایی، قارچی، التهابی و توموری نقش دارد و قادر به القای آپوپتوزیس و فعالیت ضدتکثیری و‌‌ آنتی‌اکسیدانتی نیز می‌باشد (23،22،21).
گیاه آرتمیزیا قبلا بر روی سایر رده‏های سلولی سرطان پستان و سایر انواع سرطان‏ها از قبیل کولون، رحم، معده ، کبد و خون کار شده است و موثر واقع گردید. تحقیقات نشان داد که عصاره متانولیA. sieberi موجب القای مرگ سلولی در رده سلولیMCF7 می‏شود (24). یکی از ترکیبات موثر گیاه آرتمیزیا، سسکوئیترپن لاکتونی به‏نام آرتمیزینین می‏باشد که در درمان مالاریا موثر است و از دهه 1990 ویژگی‏های ضدسرطانی آن نیز گزارش شده است (25،26). این ترکیب در حضور آهن فرو یا هم احیا شده به رادیکال سیتوتوکسیکی تبدیل می‏شود که در سلول‏های سرطانی استرس اکسیداتیو را القا می‏کند. همچنین گزارش شده است که این ترکیب آپوپتوزیس و فروپتوزیس را القا می‏کند و متاستاز سرطانی را مهار می‏کند (27) .A.sieberi گونه‏ای بومی ایران می‏باشد که تحقیقات اندکی روی اثرات ضدسرطانی آن انجام شده است. با توجه به آن‏که جنس‏های مختلف آرتمیزیا حاوی ترکیبات تا حدودی متفاوت هستند و ازطرف‏دیگر احتمالا میزان ترکیبات آهن‏دار در بافت‏های سرطانی مختلف نیز متغیر می‏باشد، بنابراین در مطالعه حاضر برای نخستین بار اثرات ضد سرطانی عصاره هیدروالکلی A. sieberi بر رده سلولی سرطان پستان SKBr3 با تمرکز بر سمیت سلولی و ارزیابی چرخه سلولی مورد بررسی قرار گرفت.

مواد و روش‌ها

آماده سازی عصاره:گیاه A. sieberi از منطقه قم جمع‏آوری شد و توسط مرکز هرباریوم دانشگاه تهران شناسایی شد. سپس در مجاورت هوا خشک و آسیاب شد. به‏منظور عصاره­گیری مقدار 82 گرم از نمونه به‏مدت 24 ساعت در اتانول 96 درصد (زکریا، ایران) قرار گرفت. سپس عصاره صاف شد و به‏مدت یک هفته در دمای اتاق قرار گرفت تا حلال آن تبخیر شد. باقیمانده برای انجام آزمایشات در یخچال با درجه حرارت 4 درجه سانتی‏گراد نگهداری شد.

تهیه رقت‏های مختلف از‌ عصاره گیاه:200 میلی‏گرم عصاره گیاه در 4 میلی‏لیتر بافر PBS (Merck، آلمان) حل شد و سپس از فیلتر سرسرنگی 2/0 میکرون ( Getبایوفیل) عبور و مایع کاملا صاف و استریل شد. رقت‏های بعدی مورد نظر توسط محیط کشت DMEM (Dulbeccos Modified Eagle Medium) تهیه شد.

کشت‌ سلول:رده سلولی SKBr3 مربوط به سرطان پستان با منشا انسانی از بانک سلولی انستیتوپاستور ایران خریداری شد و در محیط کشت DMEM (Gibco، آمریکا) حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS) (Gibco، آمریکا) و 1 درصد آنتی بیوتیک (پنی‏سیلین/استرپتومایسین) (Gibco، آمریکا) کشت داده شده و در فلاسک 25 سانتی‏متر مکعب در انکوباتور (Memert، آلمان) با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و فشار 5 درصد CO₂ و 95 درصد نگه‏داری شدند. تمام مراحل فوق در زیر هود لامینار (ژال تجهیز، ایران) و در محیطی کاملا استریل انجام گرفت.

سنجش سمیت سلولی:MTT (3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromidethiazole) یک نمک تترازولیوم محلول در آب است که براساس فعالیت آنزیم سوکسینات دهیدروژناز میتوکندریایی سلول‏های زنده عمل می‏کند (28). پس از پر شدن حدود 70 درصد کف فلاسک، با 1000 میکرولیتر بافر PBS (Phosphate Buffer Serum) (Merck، آلمان) شستشو شده و تخلیه شد. سپس 1000 میکرولیتر تریپسین (Gibco، آمریکا) اضافه کرده و به‏مدت 5 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد انکوبه شد و به‏منظور کند شدن عملکرد آنزیم تریپسین 2000 میکرولیتر محیط کشت DMEM به سلول‏ها اضافه شد. سپس سلول‏ها به داخل لوله آزمایش در پیچ‏دارمنتقل شدند. بعد از شمارش سلول‏های موجود در فالکون، به‏هر چاهک از پلیت 96 خانه (SPL، کره) 10³×8  سلول منتقل شد و با دوزهای مختلف عصاره تیمار شد. بعد از گذشت 24 و 48 ساعت ابتدا سلول‏ها با استفاده از بافر PBS شست و شو داده شدند. سپس محلول MTT (Merck، آلمان) (5 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر در PBS) به چاهک‏های پلیت 96 خانه‏ای اضافه شد و به‏مدت 4 ساعت در انکوباتور 37 درجه سانتیگراد قرار گرفت. پس از طی زمان انکوباسیون، محلول رویی در چاهک‏ها خالی شد و 100 میکرولیتر محلول DMSO (Merck، آلمان) به‏هر کدام از چاهک‏های پلیت 96 خانه‏ای اضافه شد و سپس توسط الایزا ریدر (Biotec، آمریکا) جذب نوری نمونه‏ها در طول موج 570 نانومتر اندازه‏گیری شد و سپس داده‏ها در نرم افزار Graph Pad Prism وارد شدند و میزان IC₅₀ مربوط به‏هر زمان محاسبه شد.

ساخت غلظت IC50 (24 و 48 ساعت) از محلول آماده شده اولیه: طبق داده‏های آنالیزی نرم افزار Graph Pad Prism، IC50 در زمان‏های 24 و 48 ساعت به‏ترتیب برابر با 150 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر و 50  میلی‏گرم بر میلی‏لیتر محاسبه شد. طبق اعداد به‏دست آمده غلظتی از عصاره که دارای میزان جذب به‏اندازه نصف جذب مشاهده شده در کنترل منفی می‏باشد را به‏عنوان IC50 در نظر گرفته میشود و بیان‏گر غلظتی از عصاره می‏باشد که باعث مرگ سلولی در 50 درصد از جمعیت سلولی تیمار شده، می شود. با توجه به رابطه‏ی M1*V1=M2*V2 حجم مناسب از محیط کشت DMEM و محلول آماده شده اولیه برای افزودن به چاهک‏های پلیت های 6 خانه 24 و 48 ساعت برای تست  چرخه سلولی برآورده شد.

سنجش چرخه سلولی: در ابتدا محیط کشت درون فلاسک حاوی رده سلولی SKBr3 توسط 1000 میکرولیتر بافر PBS شست و شو شد و تخلیه شد.  به‏منظور کنده شدن سلول‏ها از کف فلاسک 1000 میکرولیتر تریپسین به آن اضافه شد و به‏مدت 5 دقیقه انکوبه شد. در مرحله بعد محتوی فلاسک به یک لوله آزمایش در پیچ‏دار منتقل و به آن در حدود 2000 میکرولیتر محیط کشت DMEM افزوده شد. بعد از شمارش سلول‏ها، حجم سلولی مورد نظر  3 میلی‏لیتر محاسبه شد و به‏هر چاهک از پلیت 6 خانه‏ای (SPL، کره )، 10⁵×1سلول منتقل شد. از لوله آزمایش در پیچ‏دار (حاوی 3 میلی‏لیتر سلول و 17میلی‏لیتر محیط کشت DMEM ) به‏هر چاهک از پلیت 6 خانه‏ای، 1000 میکرولیتر اضافه شد و انکوبه شد. بعد از پایان مدت زمان 24 و 48 ساعت با توجه به IC₅₀ هر زمان، لوله آزمایش در پیچ‏دار مخصوص به آن‏ها تهیه شد و سپس محیط رویی چاهک‏ها، تخلیه شد و از آن لوله‏های آزمایش در پیچ‏دار 2 میلی‏لیتر به چاهک‏های مرتبط افزوده و انکوبه شد. در ادامه، هر چاهک از پلیت به لوله آزمایش در پیچ‏دار همنام با خود منتقل شد و هر چاهک با 1000 میکرولیتر بافر PBS مورد شست و شو قرار گرفت، سپس 500 میکرولیتر تریپسین به آن اضافه و به لوله‏های آزمایش در پیچ‏دار منتقل شدند. سپس به‏مدت 5 دقیقه با 1200 دور در دقیقه سانتریفیوژ (ژال تجهیز، ایران) شدند و به رسوب آن‏ها، 900 میکرولیتر اتانول 70 درصد (زکریا، ایران) و 100 میکرولیتر بافر PBS اضافه شد. در آخر برای خوانش آن توسط دستگاه فلوسایتومتری FACS Calibur) BD، انگلیس) به‏هرکدام از لوله‏های آزمایش در پیچ‏دار کوکتل نهایی (20 میکرولیتر PI (Sigma، آمریکا) و 20 میکرولیتر RNase A (سیناژن، ایران) و 1 میکرولیتر ترایتون X 100 (Sigma، آمریکا) که همگی در بافر PBS حل شده و به حجم 1 میلی‏لیتر رسیده) اضافه شد.

آنالیز آماری

نتایج به‏دست آمده در این مطالعه براساس حداقل سه بار تکرار استوار است که با گرفتن میانگین و محاسبه انحراف معیار، میزان تغییرات محاسبه شد. با استفاده از نرم افزار Graph pad prism 5 (Graph Pad Software, Inc., LA Jolla, CA, USA)، مقدار IC₅₀ نمونه‏ها (غلظتی از عصاره است که منجر به مهار رشد 50 درصدی سلول‏های سرطانی می‏شود) محاسبه شد. برای تجزیه و تحلیل اثر غلظت‏های مختلف عصاره بر رده سلولی سرطانی از آزمون آماری آنالیز واریانس دو طرفه (Two-way ANOVA) برای مقایسه گروه‏ها با کنترل استفاده شد. همچنین (05/0>p) معنی‏دار در نظر گرفته شد.

نتایج

بررسی سمیت سلولی عصاره هیدرو الکلی گیاه درمنه بر روی رده سلولی SKBr3 با استفاده از تست MTT انجام شد. همان‏طورکه نتایج تحلیل آماری در شکل 1 نشان داده است. عصاره مورد نظر در غلظت 10 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت در سطح 05/0>p و در غلظت‏های 100 و 1000 میکروگرم بر میلی لیتر در 24 ساعت در سطح معنی‏داری 001/0>p و در غلظت های 1، 10، 100، 1000 میکروگرم بر میلی لیتر در 48 ساعت در سطح 001/0>p موجب کاهش معنی‏دار بقای سلول‏های سرطانی در مقایسه با گروه کنترل شد. این نتایج نشان داد که اثر کشندگی سلولی عصاره وابسته به‏دوز و زمان است.

همچنین مقادیر IC₅₀ عصاره پس از 24 و 48 ساعت به‏ترتیب 150 و50 میکروگرم بر میلیلیتر محاسبه شد. نتایج حاصل از تاثیرگذاری این عصاره بر فازهای مختلف چرخه سلولی سلول‏های SKBr3 توسط دستگاه فلوسایتومتری در زمان‏های 24 و 48 ساعت در شکل 2 آورده شده و در شکل 3 آنالیز شده است.

شکل  1: میزان درصد بقای سلول‏ها با استفاده از روش MTT پس از  24 و 48 ساعت تیمار با عصاره هیدروالکلی گیاه آرتمیزیا سیبری. نمودار نشان می‏دهد که درصد بازدارندگی این عصاره روی سلول‏های سرطان پستان SKBr3 وابسته به دوز و زمان می‏باشد. مقایسه سلول‏ها با هم با آزمون آماری p< 0.001***  و p< 0.05 ^*.

شکل 2: نتیجه مبتنی بر میزان فلوئورسنت و درصد سلول‏ها در  چرخه سلولی در سه گروه کنترل، 24 و 48 ساعت (به‏ترتیب از چپ به راست)

شکل 3: مقایسه شدت تغییرات سه فاز چرخه سلولی در دو گروه تیمار و یک گروه کنترل تحت تاثیر عصاره هیدروالکلی گیاه آرتمیزیا سیبری (P value0.05  (ns) ، P value

بحث

سرطان مشکلی روبه‏رشد در سراسر جهان می‏باشد و یکی از مهم‏ترین دلایل مرگ‏ومیر در جوامع انسانی است (29). بیشتر گیاهانی که در طبیعت وجود دارند دارای خاصیت دارویی هستند. عوامل دارویی در گیاهان با خاصیت آنتی اکسیدانتی می‏توانند به‏عنوان یک عامل ضدسرطانی عمل کنند (30). امروزه فرآورده‏های گیاهی نسبت به سایر روش‏های درمانی نظیر شیمی درمانی، پرتودرمانی و هورمون درمانی به‏علت در دسترس و ارزان بودن و داشتن عوارض جانبی کمتر بیش‏تر مورد توجه قرار گرفته‏اند (31).

در مطالعه حاضر اثرات ضدسرطانی گیاه A. Sieberi مورد ارزیابی قرار گرفت. نتایج حاصل از تست  MTTنشان داد که غلظت‏های مختلف عصاره هیدروالکلی گیاه درمنه در مقایسه با گروه شاهد تفاوت معنی‏داری بر روی سمیت سلولی رده سلولی SKBr3 دارد. بیش‏ترین اثر مهاری این عصاره در غلظت 1000 میکروگرم بر میلی‏لیتر در 48 ساعت بوده است. ازطرف‏ دیگر حداکثر تاثیر آن بر چرخه سلولی بر تمامی فازها (G1 و S و G2) در 48 ساعت بوده است.‌ مطالعات گذشته نشان داده است که عصاره گیاه  A. capillaris Thunbergدر غلظت 200- 25 میکروگرم بر میلی‏لیتر مانع تکثیر سلول‏های هپاتومای انسانی SMMC-7721  در طی 72 ساعت و القای توقف چرخه سلولی در فاز G0/G1 می­شود (32). نتایج تحقیق دیگری نشان داد که عصاره متانولی گیاه A. absinthium در غلظت 25 و 20 میکروگرم بر میلی لیتر به‏ترتیب باعث مهار رشد 50 درصدی سلول‏های MCF-7 و MDA-MB-231 شده و اوج القای آپوپتوزیس این گیاه در فاز قبل از G1 در مدت زمان 72 ساعت بوده است (33). کیم و همکارانش نشان دادند که عصاره برگ گیاه A.princeps قابلیت مهار رده‏های سلولی آندومتریوتیک انسانی (11Z و 12Z) در فازG1 چرخه سلولی دارد. علاوه‏براین، عصاره گیاه موجب فعال‏سازی کاسپازهای 3، 8 و 9 شده است (34). در تحقیق حاضر نیز عصاره هیدروالکلی A. sieberi منجر به القای آپوپتوزیس و توقف چرخه سلولی شده است.

نتایج این بررسی نشان داد که خاصیت ضدسرطانی عصاره هیدروالکلی درمنه وابسته به دوز بوده است. در تحقیق دیگری نشان داده شد که اثر مهاری عصاره آبی A. princeps بر رده سلولی سرطان پستان MCF-7 وابسته به دوز بوده و منجر به مهار رشد این نوع از سلول‏های سرطانی شده است (35). گزارش شده است که اثر مهاری عصاره اتیل استاتی گیاهA.capillaris Thunberg بر سلول‏های سرطانی هپاتوسلولار (HCC) وابسته به دوز بوده است و علاوه بر القای آپوپتوزیس، قابلیت مهار رشد سلول‏ها و مهاجرت آن‏ها به نواحی دیگر را نیز دارا می‏باشد (36). میرکین و همکاران (37) نشان دادند که گیاه A.absinthum می‏تواند آپوپتوز را در سلول‏های لوسمی لنفوسیتیک مزمن القا کند. عصاره متانولی گیاه A.annua با غلظت‏های مختلف سبب مهار رشد سلول‏های سرطانی لوسمی لنفوبلاستیک حاد رده‏های Reh و Nalm-6 می‏شود (38).
نشان داده شده است که عصاره متانولی A. annua سبب کاهش رشد تمام رده‏های سلولی سرطانی معده
(AGS)، سرویکس (Hela)، کولون (HT-29) و پستان (MCF-7) با غلظت‏های مختلف به‏مدت 72 ساعت شده است (39). محققان نشان دادند که عصاره‏های مختلف A. turanica و A. biennis در مدت زمان 48 ساعت بیشترین اثر ضدتکثیری بر رده‏های سلولی سرطان خون ( HL-60 و K562) را داشته است (41،40). تحقیقات گردانیان و همکاران (24) نشان داد که عصاره متانولی A. sieberi موجب القای مرگ سلولی در رده سلولیMCF7 می‏شود  . همچنین نشان داده شده است که مهم‏ترین مواد موثره گیاه آرتمیزیا لیمونن، اوژنول، آلفا پینن، توژون، بورنئول، پیپریتون، کامفور و مقادیر زیادی آرتمیزین است. همچنین این ترکیبات موجب القای آپوپتوزیس، مهار رشد سلول‏های توموری و توقف چرخه سلولی در مرحله G2/M می‏شوند (42) . آرتمیزینین در حضور آهن فرو یا هم احیا شده به رادیکال سیتوتوکسیکی تبدیل می‏شود که در سلول‏های سرطانی استرس اکسیداتیو را القا می‏کند. همچنین گزارش شده است که این ترکیب آپوپتوزیس و فروپتوز را القا می‏کند و متاستاز سرطانی را مهار می‏کند (27). نتایج این تحقیق از آن جهت با مطالعه ما همسو است که در مدت زمان 48 ساعت بیش‏ترین اثر ضدتکثیری بر روی سلول‏های سرطانی مشاهده شده است. نتایج این تحقیقات خاصیت القای آپوپتوزی حاصل از مطالعه حاضر بر روی رده ‌سلولیSKBr3‌ را تایید می‏کند.

نتیجه­گیری

در این مطالعه مشخص گردید بیش‏ترین اثر مهاری عصاره هیدروالکلی گیاه A. sieberi در غلظت 1000 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر در 48 ساعت بر روی سلول‏های سرطانی SKBr3 بوده است. از طرفی عصاره مذکور بر سلول‏های سرطانی فوق در فازهای (G1 و G2) و (G1 و S و G2) از چرخه سلولی به‏ترتیب در طی 24 و 48 ساعت اثر داشته است. با توجه به نتایج به‏دست آمده، عصاره هیدروالکلی گیاه درمنه به‏عنوان یک داروی موثر در درمان انواع سرطان‏ها از جمله سرطان پستان می‏تواند مورد استفاده قرار گیرد. البته شناخت مکانیسم‏های موثر اثر عصاره در القای اثرات آپوپتوتیک بر روی این رده سلولی نیازمند تحقیقات بیشتری است.

تشکر و قدردانی

این مقاله حاضر بخشی از پایان نامه دوره کارشناسی ارشد بیوشیمی مصوب دانشگاه آزاد اسلامی واحد علوم پزشکی تهران می‏باشد.