Editorial

Authors

Abstract

Aim: Different methods have been used for introducing DNA into mammalian cells. Calcium phosphate-based transfection protocols are inexpensive and easy to perform, however, the transfection efficiency in some cases is not satisfactory. In this study we try to increase the efficiency of calcium phosphate-mediated cell transfection.   Material and Methods: 2.0×105 HEK293T cells were plated in each well of a 6-well plate containing a 10% poly L lysine-coated coverslip and grown to 60% confluency. The cells were then transfected with a plasmid encoding GFP (Green Fluorescence Protein), using a standard calcium phosphate protocol in the presence or absence of chloroquine phosphate. GFP protein expression was observed by immunofluorescence microscopy and quantified with the help of Image J software.  Results: We have shown that chloroquine phosphate can highly improve the efficiency of calcium phosphate-dependent transfection in the HEK293T cells, leading to an approximate 8-fold increase in the number of transfected cells. Chloroquine phosphate was not toxic to the cells, however, its positive effect on transfection efficiency was abolished in the presence of glycerol or DMSO (Dimethyl sulphoxide). Conclusion: we recommend chloroquine phosphate for increasing the efficiency of transfection by the inexpensive method of calcium phosphate. In addition, we recommend that chloroquine phosphate to be used alone and not along with other inducers of cell transfection.   

Keywords

مقدمه

ترانسفکشن سلول‏ها به فرآیندی اطلاق می‏گردد که در طی آن یک ماده ژنتیکی به‏صورت DNA یا RNA به‏درون سلول‏ها فرستاده می‏شود (1). حاملین مولکولی مختلفی برای ترانسفکشن سلول‏های پستانداران مورد استفاده قرار گرفته اند. این حاملین معمولا دارای بار الکتریکی مثبت هستند و به‏دنبال اتصال با DNA توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول می‏شوند. لیپوزوم‏ها حاملین بسیار خوبی برای انتقال مواد ژنتیکی مانند DNA هستند زیرا انواع مختلف سلول‏ها را می‏توان توسط آن‏ها ترانسفکت کرد و این ترانسفکشن معمولا با کارایی مناسب صورت می‏گیرد و اثرات سمی نسبتا کمی بر سلول‏ها دارد (4-2). با این‏حال عواملی مانند سلامت سلول‏ها- کیفیت و کمیت ماده ژنتیکی- سرم موجود در محیط کشت- روش تهیه لیپوزوم و در نهایت مدت زمان ترانسفکشن از عواملی هستند که ممکن است کارایی ترانسفکشن توسط لیپوزوم‏ها را کاهش دهند (5 و 6). به‏علاوه لیپوزوم‏ها حاملین بسیار گران قیمتی هستند.

اولین روش ترانسفکشن وابسته به فسفات کلسیم توسط دانشمندانی به‏نام‏های Graham و van der Eb معرفی شد (7). این روش وابسته به مخلوط کردن DNA با محلولی از کلرید کلسیم است. سپس این مخلوط به یک محلول بافری سالین/ فسفات (saline/phosphate) اضافه می‏گردد و در دمای اتقاق نگه‏داری می‏شود تا رسوبات DNA با کلسیم تشکیل گردد. سپس محلول حاوی این رسوبات به کشت سلول‏ها اضافه می‏گردد که در نتیجه آن سلول‏ها توسط پدیده آندوسیتوز رسوبات ریز DNA/کلسیم را به خود جذب نموده و از طریق آندوزوم‏ها (endosomes) DNA به هسته سلول منتقل می‏گردد (2 و 8).

علی‏رغم کارایی پایین روش فسفات کلسیم در ترانسفکشن سلول‏ها و نیز حساسیت این روش به ,pH حرارت و تغییر غلظت سالین، این روش برای ترانسفکشن انواع مختلفی از سلول‏های حیوانی مورد استفاده قرار گرفته است (6 و 9). به‏علاوه این روش ساده و ارزان قیمت است و در میان سایر روش‏های ترانسفکشن تنها روشی است که از یون‏های کوچکی که به‏طور طبیعی در محیط کشت سلول وجود دارند استفاده می‏کند (9 و 10).

در این مقاله ما نتایج دیگر دانشمندان را مورد تایید قرار داده و نشان دادیم که کیفیت پائین ترانسفکشن توسط روش کلسیم فسفات می‏تواند به‏میزان قابل ملاحظه‏ای توسط ماده‏ای به‏نام فسفات کلروکین (chloroquine phosphate) که یک داروی ضد مالاریا است (11) بهبود یابد. افزودن فسفات کلروکین با غلظت 25 میکرو‏گرم در هر میلی‏لیتر (mg/ml) کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T را به میزان قابل ملاحظه‏ای (تا 8 برابر) افزایش داد و جالب آنکه در این شرایط سلول‏ها سلامت خود را حفظ کردند و کاهشی در حیات سلول‏ها مشاهده نگردید. به‏علاوه، نتایج ما نشان داد که گلیسرول و یا دی متیل سولفوکسید (DMSO, Dimethyl sulphoxide) که از محرک‏های ترانسفکشن سلول‏ها محسوب می‏شوند، اثرات افزایشی فسفات کلروکین در ترانسفکشن سلول‏ها را از بین می‏برند.

 

مواد و روش‏ها

کشت سلول و ترانسفکشن: رده سلولی HEK293T از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. دویست هزار سلول (2 X 105) HEK293T در هر یک از خانه‏های یک ظرف 6 خانه‏ای (مخصوص کشت سلول‏های جانوری) که حاوی یک لامل پوشیده از پلی‏ال‏لیزین بود کاشته شدند و سلول‏ها در انکوباتور کشت سلول با شرایط استاندارد، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد دی اکسید کربن و رطوبت مناسب کشت داده شدند. برای کشت سلول‏ها از محیطDMEM   حاوی 10 درصد سرم گوساله (FBS, fetal bovine serum) و آنتی بیوتیک (100 میکروگرم در میلی‏لیتر پنی سیلین و 100 واحد در میلی‏لیتر استرپتومایسین) استفاده شد. هنگامی‏که سلول‏ها تقریبا به تراکم رشدی 60 درصد (confluency) رسیدند، محیط کشت سلول‏ها با محیط تازه حاوی 25 میکروگرم  در میلی لیتر فسفات کلروکین (Ipca laboratories, India) تعویض گردید. در آزمایش‏هایی که اثرات گلیسرول و یا DMSO مورد ارزیابی قرار گرفت، هر یک از آن‏ها به‏میزان درصد حجمی 10 درصد به محیط کشت سلول‏ها اضافه شدند. بعد از 2 ساعت سلول‏ها با 2 میکروگرم از یک حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP (Green Fluorescence Protein) ترانسفکت شدند. یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم برای ترانسفکشن سلول‏ها مورد استفاده قرار گرفت (12). 6 ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط سلول‏ها با محیط فاقد فسفات کلروکین تعویض شد و 36 ساعت بعد سلول‏ها برداشت شدند و برای بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنس (Zeiss, Germany) مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (immunofluorescence microscopy): سلول‏های ترانسفکت شده با پلاسمید GFP بعد از برداشت، با محلول (PBS, phosphate-buffered saline) شستشو داده شدند و سپس در محلول 4 درصد پارافرمالدئید (در PBS) به‏مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق ثابت (fix) شدند. سلول‏ها مجددا شستشو داده شدند و توسط محلول 2/0 درصد تریتون X-100 در PBS به‏مدت 3 دقیقه نفوذ پذیر شدند. لامل‏های حاوی سلول سپس دو بار (هر بار 5 دقیقه) توسط محلول PBS شستشو داده شده و سپس هر کدام از آن‏ها بر روی یک اسلاید میکروسکوپی تمیز حاوی یک قطره کوچک از محیط چسبنده شامل 90 درصد گلیسرول و 10 درصد PBS      (mounting medium) قرار گرفتند. کناره‏های لامل‏ها توسط لاک ناخن مسدود شده و سپس توسط میکروسکوپ فلورسانس (Zeiss, Germany) مورد مشاهده قرار گرفتند. میزان تجلی پروتئین GFP توسط نرم افزاز image J مورد اندازه گیری کمی قرار گرفت و اندیکس تجلی پروتئین همانند روش توضیح داده شده در منبع شماره 13 محاسبه گردید (13).

نتایج

بسیاری از رده‏های سلولی می‏توانند توسط رسوبات DNA/فسفات کلسیم ترانسفکت شوند که این رسوبات به سطح سلول می‏چسبند و توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول می‏شوند (14). برای مطالعه نقش فسفات کلروکین در کارایی ترانسفکشن، سلول‏های HEK293T با پلاسمید تجلی دهنده پروتئین GFP (حامل cDNA ژن GFP) و با یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم ترانسفکت شدند (12). ژن GFP که پروتئین Green Flouroscent Protein را تجلی می‏دهد به‏طور گسترده به‏عنوان یک ژن گزارشگر (reporter gene) در مطالعات بیان ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته است (15). تیمار با فسفات کلروکین تا 8 برابر میزان ترانسفکشن سلول‏ها را افزایش داد در حالی‏که تیمار سلول‏ها با گلیسرول و یا DMSO تاثیری بر ترانسفکشن سلول‏ها نداشت (شکل 1).

 

 

 

شکل 1: الف) نتیجه یکی از آزمایشات ایمونوفلورسانس که در آن، سلول‏های HEK293T با پلاسمید کد کننده پروتئین GFP (Green Flouroscent Protein) همانند روش توضیح داده شده در قسمت "مواد و روش‏ها" ترانسفکت و با موادی که در شکل معرفی شده اند تیمار شده‏اند. ب) نمودار معرف نوع تیمار سلول‏های ترانسفکت شده و همین‏طور معرف میزان بیان ژن GFP در سلول‏ها می باشد که توسط نرم افزار Image J اندازه‏گیری شده است. متوسط اندازه‏گیری نتایج سه آزمایش مختلف (همانند آزمایش نشان داده شده درالف، در این شکل نشان داده شده است.

 

جالب آنکه تیمار سلول‏ها با گلیسرول و یا DMSO به‏طور کامل باعث از بین رفتن اثر افزایشی فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلول‏ها شد که بیانگر آنست که هر یک از این دو ماده به نوعی باعث از بین رفتن اثر فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلول‏ها می‏گردد (شکل 1).

اندازه‏گیری میزان ترانسفکشن بر اساس تعداد سلول‏های ترانسفکت شده و شدت بیان ژن GFP مورد ارزیابی قرار گرفت که هر دو این عوامل در حضور فسفات کلروکین افزایش پیدا کردند. شدت بیان ژن GFPتوسط نرم افزار Image J مورد اندازه‏گیری قرار گرفت.

ما همچنین در این مطالعه دریافتیم که تیمار سلول‏های HEK293T با غلظت 25 میکروگرم  در میلی‏لیتر (mg/ml)  فسفات کلروکین به‏مدت 6 ساعت (بعد از ترانسفکشن) باعث هیچ‏گونه کاهشی در بقای سلول‏ها نمی‏شود (شکل 2).

 

 

شکل 2: الف) نمونهای از رنگ آمیزی هسته سلول‏ها با رنگ DAPI (diamidino-2-phenylindole). این شکل جمعیت سلول‏ها را در حالت تیمار شده و تیمار نشده با فسفات کلروکین مورد مقایسه قرار می‏دهد. ب) نمودار بیانگر اندازه‏گیری کمی نتایج است.

 

 

بحث

ترانسفکشن سلول‏ها با روش وابسته به فسفات کلسیم روشی آسان و از نظر اقتصادی به صرفه است. با این‏حال کارایی این روش برای بعضی از سنجش‏های آزمایشگاهی کافی نیست (16). در این مطالعه ما نشان می‏دهیم که فسفات کلروکین به‏میزان قابل ملاحظه‏ای کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T را با روش فسفات کلسیم افزایش می‏دهد.

فسفات کلروکین ماده‏ای است که مدت‏هاست در درمان مالاریا مورد استفاده قرار گرفته است (17). گزارشاتی است مبنی بر اینکه غلظت‏های بالای این ماده و یا در معرض قرار گرفتن طولانی مدت سلول‏ها با این ماده برای سلول‏ها سمی است و باعث مرگ آن‏ها می‏گردد (18). با این‏حال در غلظت مورد استفاده در این مطالعه (25 میکروگرم در میلی‏لیتر) و زمان ترانسفکشن (6 ساعت)، فسفات کلروکین هیچگونه اثر سمی بر سلول‏های HEK293T نداشت.

بازدارندگی تجزیه DNA توسط فسفات کلروکین یکی از مکانیسم‏های محتمل در افزایش میزان ترانسفکشن توسط این ماده می‏باشد. در طی ترانسفکشن، اکثر مولکول‏های پلاسمید از طریق پدیده آندوسیتوز وارد سلول می شوند و در این مرحله DNA ممکن است قبل از آنکه به هسته سلول برسد به‏علت ادغام اندوزوم (endosome) و لیزوزوم (lysosome) توسط آنزیم‏های نوکلئاز لیزوزومال مورد تجزیه واقع گردد (19). ادغام اندوزوم و لیزوزوم می‏تواند توسط عوامل لیزوزوموتروپیک مانند فسفات کلروکین، که از ادغام اندوزوم و لیزوزوم ممانعت می‏کنند، جلوگیری شود (لازم به ذکر است که مواد لیزوزوموتروپیک موادی هستند که به‏طور ترجیحی در لیزوزوم‏ها تجمع پیدا می‏کنند) (8). در حقیقت فسفات کلروکین می‏تواند pH اندوزوم را تنظیم کند و فرآیند اسیدی شدن را بر هم بزند و بنابراین باعث افزایش اسمولاریته و در نهایت پارگی وزیکول‏ها گردد که در نتیجه آن DNA پلاسمیدی به‏داخل سیتوپلاسم آزاد می‏گردد (9 و 10).

این نکته قابل ذکر است که فسفات کلروکین کارایی ترانسفکشن سلول‏های سرطانی کولون (SW480) و سلول‏های سرطانی پروستات (PC-3) را افزایش نداد. دلیل این امر می‏تواند تفاوت در خصوصیات بیولوژیک (مانند تراوایی غشایی) میان سلول‏های HEK293T و سلول‏های ذکر شده باشد. بنابراین به‏نظر می‏رسد که ماده فسفات کلروکین به‏طور ترجیهی تنها باعث افزایش ترانسفکشن عده‏ای از سلول‏ها می‏شود.

فسفات کلروکین اول بار برای ترانسفکشن سلول‏ها با DNA ویروس پولیوما مورد استفاده قرار گرفت (20) و از آن زمان تاکنون به‏عنوان یک ماده موثر در ترانسفکشن برای عده ای از سلول‏های پستانداران مورد استفاده قرار گرفته است (21و 22). میزان افزایش کارایی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین به نوع سلول- محیط کشت و روش ترانسفکشن بستگی دارد و بنابراین محققین دیگری که از فسفات کلروکین برای تحریک ترانسفکشن سلولی استفاده کرده‏اند میزان افزایش متفاوتی را تجربه کرده‏اند. برای مثال در مورد رده سلولی استئوسارکوما افزایش 3 برابری ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین گزارش شده است (22) و یا گروه دیگری توانسته‏اند ترانسفکشن سلول‏های رت را با DNA ویروس پولیوما تا 6 برابر توسط فسفات کلروکین افزایش دهند (20). گروه دیگری ترانسفکشن سلول‏های CHO (Chinese hamster ovary) را با پلاسمید pSV2neo توسط فسفات کلروکین تا 20 برابر افزایش داده‏اند (21). با روش توضیح داده شده در این مقاله ما نشان می‏دهیم که کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T به‏طور قابل ملاحظه‏ای تا 8 برابر می‏تواند توسط فسفات کلروکین افزایش یابد. به‏علاوه ما نشان می‏دهیم که دو ماده گلیسرول و یا DMSO (که هر دو به‏عنوان محرک‏های ترانسفکشن سلول‏ها شناخته شده‏اند) اثر افزایشی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین را از بین می‏برند. بنابراین با توجه به نتایج فوق توصیه نمی‏کنیم که این محرک‏ها توام با فسفات کلروکین مورد استفاده

قرار گیرند.

نتیجه گیری

به‏طور خلاصه با توجه به استفاده گسترده از سلول‏های HEK293T در مطالعات بیان ژنتیکی, ما فسفات کلروکین را به‏عنوان یک ماده با ارزش برای افزایش کارایی ترانسفکشن توسط روش ارزان قیمت فسفات کلسیم توصیه می‏کنیم. با این‏حال با توجه به نتایج این مقاله پیشنهاد می‏گردد که فسفات کلروکین به‏عنوان تنها محرک در واکنش ترانسفکشن مورد استفاده قرار گیرد و از استفاده توام آن با سایر محرک‏ها مانند گلیسرول و DMSO خودداری گردد. 

 

تشکر و قدردانی

حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP به‏صورت اهدایی از دکتر Peter Klein (از دانشگاه پنسیلوانیا در کشور آمریکا) دریافت گردید. این‏کار توسط طرح پژوهشی شماره 31/86103 صندوق حمایت از پژوهشگران ریاست جمهوری و معاونت پژوهشی دانشگاه تهران مورد حمایت مالی قرار گرفته است. 

  1. Bassani-Molinas MM. Transient transfection of HEK293 cells in suspension: process characterization and optimization by applying invasive nucleotide and non-invasive electronic nose technology. Doctoral thesis. Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, Germany. 2003.
  2. Jordan M, Schallhorn A, Wurm FM. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucl Acid Res. 1996; 24(4): 596-601.
  3. Wordragen MV, Shakya R, Verkerk R, Peytavis R, et al. Liposome-mediated transfer of YAC DNA to tobacco cells. Plant Mol Biol Rep. 1997; 15: 170-178.
  4. Lonez C,VandenbrandenM, RuysschaertMJ. Cationic liposomal lipids: From gene carriers to cell signalingProgress. Lipid Res. 2008; 47(5): 340-347.
  5. Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem. 1994; 269: 2550-2561.
  6. Gavrilescu LC, Van Etten RA. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. 2007; 10: 550.
  7. Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973; 52: 456-467.
  8. Moore NM, Sheppard CL, Sakiyama-Elbert SE. Characterization of a multifunctional PEG-based gene delivery system containing nuclear localization signals and endosomal escape peptides. Acta Biomaterialia. 2009; 5: 854-564.
  9. Erbacher P, Roche AC, Monsigny M, Midoux P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Exp Cell Res. 1996; 225: 186-194.

 

10. Wolfert MA, Seymour LW. Chloroquine and amphipathic peptide helices show synergistic transfection in vitro. Gene Ther. 1998;5(3): 409-414.

11. Bruce Chwatt, L.J. Essential malariology; 2th Ed. John Wiley &.
Sons Inc. New York, NY. 1985.

12. Pear WS, Nolan GP, Scott ML, Baltimore D. Production of high-titer helper free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90(18): 8392-8396.

13. Kang Y, Saile E, Schell MA, Deny TP. Quantitative immunofluorescence of regulated eps gene expression in single cells of Ralstonia solanacearum. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 2356-2362.

14. Welzel T, Radtke T, Meyer-Zaika W, Heumannb R, et al. Transfection of cells with custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA. J Mat Chem. 2004; 14: 2213-2217.

15. TsienRY. The green fluorescent protein, Ann Rev Biochem. 1998;67: 509-544.

16. Kingston RE, Chen CA, Rose JK. Calcium phosphate transfection. Curr Prot Mol Biol. 2003; Chapter 9: Unit 9.1.

17. Cooper RG, Magwere T. Chloroquine: Novel uses and manifestations. Indian J Med Res. 2007;127: 305-316.

18. Boya P, Gonzalez-Polo RA, Poncet D, Andreau K, et al. Mitochondrial membrane permeabilization is a critical step of lysosome-initiated apoptosis induced by hydroxychloroquine. Oncogene 2003; 22: 3927-3936.

19. Ciftci K, Levy RJ. Enhanced plasmid DNA transfection with lysosomotropic agents in cultured fibroblasts. Int. J. Pharmaceutics. 2001; 218(1-2): 81-92.

20. Luthman H, Magnusson G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucl Acid Res. 1983; 11(5): 1295-1308.

21. Mazahir T, Hasan RS, Chang TY. High-efficiency stable gene transfection using chloroquine-treated Chinese hamster ovary cells. Soma Cell Mol Genet. 1991; 17: 513-517.

22. Karikó K, Kuo A, Barnathan ES, Langer DJ. Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta. 1998; 1369(2): 320-334.