مطالعه اثر پرتو UV-C بر کلروفیل و فلاونوئیدهای یونجه تاجی Coronilla varia L. (Fabaceae)

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: کاهش ضخامت لایه اُزن در اثر افزایش آلاینده‌ها سبب کاهش جذب پرتوهای فرابنفش (UV) خورشید به وسیله‏ی این لایه و در نتیجه آسیب موجودات زنده، از جمله گیاهان می‌شود. وقوع تغییرات فیتوشیمیایی در گیاهان از جمله واکنش‌های سازش، دفاع و مقابله‏ی آنها در برابر آسیب‌های ناشی از این پرتوهاست. پس بررسی این تغییرات در گیاهان عالی اهمیت دارد.
مواد و روش ها: ده گروه کشت شامل گیاهان بذری و مزرعه‌ای شاهد و تحت تیمار UV-C (با زمان کل یک تا بیست ساعت) در گلدان‏های مشابه با خاک و شرایط نگهداری یکسان از گونه Coronilla varia L. آماده شدند. کلیه‏ی گیاهان 90 روزه جهت کلروفیل متری قبل و بعد از تیمار  UV-Cو مطالعه ی فلاونوئیدها با روش‌های کروماتوگرافی کاغذی دو بعدی و لایه نازک برداشت گردیدند.
نتایج: نتایج کلروفیل متری، کاهش کلروفیل را در گیاهان تحت تیمار در مقایسه با شاهد نشان داد. مقایسه‏ی فلاونوئیدهای برگ تغییر در تعداد و نوع فلاونوئیدهای برگ گیاهان تحت تیمار نسبت به شاهد را نشان داد. این تغییرات شامل وجود لوتئولین و ویسنین‌ در گیاهان تحت تیمار و عدم وجود آنها در گیاهان شاهد، وجود کامفرول در نمونه‌های مزرعه‌ای تحت تیمار و عدم وجود آن در سایر نمونه‌ها، وجود کریسین در نمونه‌های شاهد و عدم وجود آن در نمونه‌های تحت تیمار و حذف آپی‌جنین، ایزورامنتین، رامنتین، نارنجنین، میرستین و کوئرستین در نمونه‌های مزرعه‌ای تحت تیمار بودند.
نتیجه گیری: تصور می‌شود ایجاد تغییرات فیتوشیمیایی شامل تغییر در نوع و تعداد فلاونوئیدها، واکنش دفاعی گیاه در برابر تنش‌های فیزیولوژیک و ازجمله پرتو UV-C باشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نور خورشید که گیاهان از آن برای فتوسنتز استفاده می­کنند دارای پرتوهای فرابنفش (UV) الکترومغناطیسی کیهانی شامل: 1) UV-A 320-390 nm، 2) UV-B 280-320 nm و 3) UV-C <280 nm می­باشد. UV-A که طول موج­های 320 تا 390 نانومتر را شامل می­شود به وسیله لایه اُزن جذب نشده و به دلیل انرژی پایین نیز آسیب جدی به گیاهان نمی­رساند. پرتوهای UV-B با طول موج بین 280 تا 320 نانومتر تا حدودی به وسیله لایه اُزن جذب می­شوند که امروزه با کاهش لایه اُزن در نتیجه آلودگی کلروفلوروکربن (CFC) در لایه استراتوسفر در محیط زیست افزایش یافته و دارای انرژی بالاتری نسبت به دو پرتو دیگر UV می­باشند (1). ناحیة UV-C در طیف UV شامل طول موج­های پایین­تر از 280 نانومتر است. این طول موج­ها با انرژی بالا، به صورت کامل و مؤثرتری توسط اُزن در لایه استراتوسفر جذب می­شود و بنابراین در صورت کامل بودن لایه اُزن از نور خورشیدی که به سطح زمین می­رسد حذف می­شوند، اما امروزه با کاهش ضخامت لایه اُزن در نتیجه افزایش آلاینده­ها، موجودات زنده پرتو فرابنفش را دریافت کرده و در برابر آسیب جدی این پرتوها قرار می­گیرند (2). همه موجودات زنده مکانیسم­هایی را برای جلوگیری از ورود نور به درون سلول‏های خود دارند. همچنین پاسخ­های ترمیمی یا سازشی به سرعت در پاسخ به قرارگیری در معرض پرتو UV القا می­شود. مقاومت و یا سازش گیاه به تنش UV در جنس­ها، گونه­ها و حتی واریته‏های گیاهی بسیار متفاوت است. در گیاهانی که در مناطق با پرتو UV زیاد مانند مناطق واقع در عرض­های جغرافیایی پایین و یا نقاط مرتفع رشد و زندگی می­کنند حفاظت در برابر UV مشاهده می­شود (3 و 4). بر اساس مطالعات Frohnmeyer  و همکاران (5) تاثیر پرتو UV بر گیاهان شامل تغییرات مورفولوژیکی مانند ایجاد میان گره­های کوچک، کاهش وزن، کاهش بیوماس، کاهش سطح برگی، کاهش تولید مثل، ممانعت از رشد و طویل شدن هیپوکوتیل می­باشد. پرتوهای UV سبب برخی آسیب­های مولکولی می­شوند، زیرا جذب UV توسط اسیدهای آمینه آروماتیک و نوکلئوتیدها می­تواند منجر به عدم کارکرد اسیدهای نوکلئیک و پروتئین­های مربوطه شود (6). در گیاهان تغییرات ساختاری ایجاد شده به وسیله‏ی UV در کلروپلاست­ها و پروتئین­های D1 و D2 در مرکز فتوسیستم 2 می­تواند منجر به کاهش ظرفیت فتوسنتزی و سرعت رشد شود (7). مطالعات Reddy و همکاران (8) نشان داد که پرتو UV می­تواند موجب تغییر آرایش مولکولی و موتاسیون گردد. همچنین UV از طریق تشکیل رادیکال­های آزاد اکسیژنی آسیب­های سلولی ایجاد می­کند. مطالعات نشان داده که بیشترین جذب DNA در طول موج 260 نانومتر UV-C بوده و می­تواند آسیب­های شدیدی را به سرعت در آن ایجاد کند (2). همچنین، کاهش مقدار پروتئین کل برگ­های گیاه سیب­زمینی قرار گرفته در معرض پرتو UV-B نیز توسط Santhos و همکاران (9) گزارش شده است. مطالعات رحمت زاده و همکاران (10) بر روی گندم نشان داد که تابش UV-C منجر به کاهش محتوای پروتئین و قند در نمونه­های تیمار شده با این پرتو شده است. همچنین، پرتو UV-C منجر به کاهش معنی­داری در محتوای کلروفیل و کاروتنوئیدها در گیاهان تیمار شده با UV گردید. مطالعات تشریحی برگ گندم نیز نشان داد که گیاهانی که در معرض پرتو UV-C قرار گرفته­اند دارای لایه کوتیکول ضخیم­تری نسبت به گیاهان شاهد هستند. مطالعات نشان می‏دهد که حساس­ترین مکان نسبت به اثر بازدارندگی UV-B در گیاهان، فتوسیستم 2 بوده و فتوسیستم 1، به پرتو UV-B مقاوم­تر است (11 و 12).

همه موجودات زنده و به خصوص گیاهان مکانیسم­ها و واکنش­هایی را برای مقابله و یا سازش با این تنش محیطی دارا می­باشند (2) که از آن جمله می­توان تغییرات مولکولی و فیتوشیمیایی را نام برد (8). مطالعات بسیاری در زمینه تاثیر UV و سایرتنش­ها بر گیاهان تا کنون صورت گرفته است. Singh (13)، Biggs و همکاران (14) و Krizek و همکاران (15) در مطالعات خود کاهش کلروفیل، پیچیدگی و مومی شدن برگ­ها، کاهش سطح برگ و Balakrishnan و همکاران (16) افزایش فلاونوئیدها را در گیاهان تحت تیمار UV در مقایسه با کنترل نشان دادند. همچنین Mazza و همکاران (17) و Mackerness  و همکاران (18) ایجاد تنش اکسیداتیو تحت این پرتو را بررسی کردند. فلاونوئیدها از دسته ترکیبات پلی فنلیک در گیاهان با اعمال مختلفی می­باشند. افزایش متابولیسم فنیل پروپانوئید و مقدار ترکیبات فنلیک می­تواند تحت فاکتورهای محیطی و شرایط تنش مشاهده شود. سنتز ایزوفلاون­ها و برخی فلاونوئید­های دیگر، وقتی گیاهان آلوده یا مجروح شوند یا تحت دماهای پایین و شرایط کمبود تغذیه­ای قرار گیرند، القا می­شوند. گیاهان فلاونوئیدهای جذب کننده UV و دیگر ترکیبات فنلیک را به طور عمده در واکوئل­های سلول­های اپیدرمی انباشته می‏کنند. در سال­های اخیر خواص آنتی اکسیدانی فلاونوئیدها بیشتر مورد توجه است (19 و 20). یافته­هایQuaite  و همکاران (20) نشان می­دهد که ظاهرا گیاهان در طی تکامل خود را با سطوح مختلف تابش پرتوهای UV-B از طریق حداقل دو مکانیسم حفاظتی شامل برهم­کنش نوری و رنگیزه­های جاذب پرتوهای فرا بنفش مانند فلاونوئیدها و فنیل پروپانوئیدها تطبیق داده­اند (20). گونه­های مقاوم به UV ممکن است به خوبی به وسیله‏ی رنگیزه­های فرعی سنتز شده از مسیر پروپانوئید در لایه اپیدرمی یا در کرک­های برگ محافظت شوند (21 و 22). مقادیر نفوذ UV-B از میان لایه اپیدرمی به مزوفیل با استفاده از فیبر نوری کوچک، اهمیت جذب مواد در لایه­های اپیدرمی را تایید کرده است (23). نقش فلاونوئیدها در بهبود آسیب وارده UV-B به فتوسنتز به طور واضح در جوانه­های گندم سیاه نیز به اثبات رسیده است، طوری که ایزوویتکسین­ها و سایر فنیل پروپانوئیدها منحصرا در لایه ی اپیدرمی انباشته شده­اند (24). بیوسنتز این ترکیبات به وسیلة مراحل ایزومریزاسیون القا شدة UV-B، از ترکیبات پیش ساخت تنظیم می­شود (25). موتان­های فاقد فلاونوئید Arabidopsis بسیار به پرتوهای UV کیهانی حساس هستند (26 و 27). ممانعت از آسیب DNA ایجاد شده به وسیله ی UV-B توسط فلاونوئیدها در جوانه­های ذرت نشان داده شده است (28). همچنین مطالعات Caldwell  و همکاران (29) تغییر و یا تحریک سنتز رنگیزه­های جاذب UV تحت تاثیر پرتوهای UV را در گیاهان نشان می­دهد. تجمع ترکیبات فنلی جاذب UV نیز در پاسخ گیاه به پرتوهای بالای خورشیدی نیز مشاهده شده است که می­توانند گیاه را در برابر پرتوهای UV محافظت کنند (29و30). مطالعات میرزاتونی (31) نشان داد که اپیدرم برگ گیاهان عالی به دلیل داشتن ترکیبات جاذب مانند فلاونوئیدهای موجود در واکوئل­های سلول­های اپیدرمی، به عنوان یک لایه محافظ در برابر پرتوهای UV عمل می­کند. همچنین این مطالعات ثابت کرد که کاهش درصد اسانس در ریحان تحت تاثیر پرتوهای UV می­تواند به دلیل تغییر مسیر پیش ساخت­های ترکیبات اسانس باشد. یعنی اسیدهای آمینه آروماتیک که پیش ساز مشترک ترکیبات فنلی اسانس و فلاونوئیدها هستند بیشتر به سمت سنتز ترکیبات جاذب UV مانند فلاونوئیدها هدایت می­شوند. مطالعات Teramura و همکاران (32) بر روی جوانه های خیار رشد یافته در اتاقک رشد نشان داد که از دست دادن آب تحت تاثیر 12 درصد اُزن رخ می­دهد، چنانکه گیاهان تحت تنش آبی با سطوح بالایی ازUV-B  تیمار شوند، آن ها توانایی بستن روزنه­ها را با افزایش دوز بالای UV از دست می­دهند. برعکس جوانه­های تربچه حساسیت کمتری را نسبت به تابش پرتو UV-B تحت شرایط تنش آبی در مقایسه با خیار از خود نشان دادند. احتمال می­رود دلیل این امر وجود تراکم بیشتر فلاونوئیدهای جاذب UV در اپیدرم برگ­های تربچه باشد (33). چنین مطالعاتی نقش فلاونوئیدها را به عنوان یکی از مکانیسم­های دفاعی، سازش و مقابله گیاهان در برابر تنش­های محیطی مانند پرتوهای UV نشان می­دهد.

    با توجه به اینکه فلاونوئیدها از جمله ترکیبات فیتوشیمیایی هستند که برای دفاع و مقابله با شرایط نامساعد محیطی مانند نور شدید، پرتوها، کم­آبی و آلاینده­ها و همچنین کاهش آسیب در برخی گیاهان ساخته شده و یا دچار تغییر می­شوند (34) لذا در این پژوهش گونه Coronilla varia از لگوم­ها برای بررسی تاثیر پرتو UV-C بر کلروفیل و فلاونوئیدهای آن انتخاب گردید.

 

مواد و روش‌ها

نمونه­برداری، شناسایی و تهیه بذر: جمع­آوری گونه Coronilla varia از اطراف شهر اراک، استان مرکزی در مرداد ماه 1389 انجام گردید. گونه پس از جمع آوری کدگذاری شده و اطلاعات مربوط به آن ثبت و به صورت نمونه هرباریومی در­آمد که به عنوان نمونه شاهد در هرباریوم دانشگاه اراک نگهداری می­شود. گونه پس از انتقال به آزمایشگاه با استفاده از منابع موجود (35 و 36) شناسایی، مورد تایید و برچسب­گذاری گردید. بذرهای رسیده و سالم گیاه نیز جهت انجام کشت جمع­آوری شدند.

یافتن بهترین شرایط کشت بذر برای گیاه مورد مطالعه، کشت، نگهداری و تیمار گیاهان: تجربیات عملی در مورد کشت بذر یونجه تاجی نشان داد بهترین روش قرار دادن مستقیم بذر خشک استریل شده با محلول 1 درصد هیپوکلرید سدیم به درون خاک گلدان است و در آزمایشات از این روش اخیر استفاده شد. در این پژوهش نمونه­ها در ده گروه تیماری در پنج تکرار به قرار جدول 1 آماده و تهیه شدند (هر گروه تیماری با علامت اختصاری مخصوص به خود که متشکل از S=sample، Cv=Coronilla varia و عدد که شماره تیمار است برچسب گذاری گردید). ده بذر سالم و رسیده  Coronilla varia در دو پلیت جداگانه قرار داده شد. یک پلیت به مدت 1 ساعت و پلیت دیگر به مدت دو ساعت در معرض پرتو 245 نانومتر UV-C قرار گرفتند و پس از ایجاد شکاف کوچک به گلدان منتقل گردیدند. ده بذر Coronilla varia در هر گلدان (با قطر 15 سانتی متر) تیمارهای SCv1 و SCv4 تا SCv7 کاشته شد (S=Sample، Cv=Coronilla varia و اعداد شماره تیمارها می باشد). گیاهان برگدار Coronilla varia نیز از مزرعه با احتیاط برداشت و در هر یک از گلدان­های تیمارهای SCv8 تا SCv10 کاشته شدند. همه گلدان­ها پس از اولین آبیاری به اتاق کشت با دمای2 ±25 درجه سانتی گراد، دوره نوری: 16 ساعت    روشنایی و 8 ساعت تاریکی، شدت نور: µEm-2S-1 68-53 (Lux 4500-3500) و آبیاری با آب معمولی 3 بار در هفته به مدت 90 روز قرار داده شدند.

 

 

جدول 1: ده گروه تیماری Coronilla varia برای بررسی تاثیر  245 نانومتر UV-C بر آنها در مقایسه با شاهد.

کُد

نمونه

بذر

گیاه برگدار

تعداد کل دفعات تیمار

زمان کل تیمارها (h)

زمان هر تیمار (h)

دفعات تیمار

زمان هر تیمار (h)

روز هر بار تیمار (d)

SCv1

شاهد گلخانه ای

0

0

0

0

0

0

SCv2

UV-C در مرحله ی بذر

1

1

0

0

1

1

SCv3

UV-C در مرحله ی بذر

2

1

0

0

1

2

SCv4

UV-C در مرحله ی گیاه برگدار

0

0

1

3 روز متوالی

3 بار به فاصله 1 ماه

9

SCv5

UV-C در مرحله ی گیاه برگدار

0

0

2

3 روز متوالی

3 بار به فاصله 1 ماه

18

SCv6

UV-C در مرحله ی بذر و گیاه برگدار

1

1

1

3 روز متوالی

4 بار (1 بار بذر و 3 بار گیاه برگدار به فاصله 1 ماه)

10

SCv7

UV-C در مرحله ی بذر و گیاه برگدار

1

1

2

3 روز متوالی

4 بار (1 بار بذر و 3 بار گیاه برگدار به فاصله 1 ماه)

20

SCv8

شاهد مزرعه ای

0

0

0

0

0

0

SCv9

UV-C در مرحله ی گیاه برگدار انتقال از مزرعه به گلخانه

0

0

1

3 روز متوالی

3 بار به فاصله 1 ماه

9

SCv10

UV-C در مرحله ی گیاه برگدار انتقال از مزرعه به گلخانه

0

0

2

3 روز متوالی

3 بار به فاصله 1 ماه

18

 

Abbreviation: S=sample, Cv=Coronilla varia L., h=hour, d=day.

 

 


کلروفیل متری و مطالعه فلاونوئیدها: در پایان کشت کلروفیل متری (کوآنتا) در همه نمونه­ها به وسیله کلروفیل­متر SPAD-502 (Minolta) انجام گردید. نتایج در جدول 2 و شکل 1 آمده­اند. برای مطالعه‏ی فلاونوئیدها، برگچه­های گیاهان شاهد و تحت تیمار به طور جداگانه جمع­آوری و پس از خشک کردن به صورت پودر درآمدند.200 میلی­گرم از پودر برگ هر نمونه به روش آبی-الکلی (جوشاندن، خیساندن، فیلتراسیون) و تقطیر در خلاء (Heidolph laborrita 4000 efficient) عصاره­گیری شدند. عصاره­های هر نمونه و همچنین معرف روتین به طور جداگانه بر روی کاغذ کروماتوگرافی واتمن شماره یک در ابعاد 29×23 لکه گذاری شدند.

کروماتوگرافی دو بعدی (2-DPC) 2-Dimensional Paper Chromatography: کروماتوگرام­های هر نمونه به ترتیب در کروماتوتانک های شاندون حاوی BAW (Butanul, Acetic acid, Water) و HOAc (اسید استیک 15 درصد) به طور جداگانه قرار داده شده، پس از پایان کروماتوگرافی خشک و به وسیلهUV  در طول موج 366 نانومترCamag UV Cabinet) 254 &366 nm) خوانده و لکه­ها بر روی آنها علامت­گذاری گردیدند. مقادیر RF لکه­های هر یک از کروماتوگرام­ها در BAW (بوتانول، اسید استیک، آب مقطر به نسبت 4: 1: 5) و HOAc  15درصد محاسبه و سپس با استفاده از کلید شناسایی اولیه (37 و 38) لکه­ها شناسایی شدند.


جدول 2: مقایسه مقدار کلروفیل برگ قبل و بعد از قرار گرفتن در معرض  UV-Cدر نمونه های شاهد و تحت تیمار.

Characters

Treatments

Mean ± SD

ChA

ChB

40.96±2.01

41±1.24

SCv1 (0.h)

35.69±0.86

38.79±1.14

SCv2 (1 h)

33.6±1.26

37.04±0.70

SCv3 (2 h)

31.95±2.03

36.2±0.85

SCv4 (9 h)

30.69±1.18

36.82±2.45

SCv5 (18 h)

29.03±1.01

35.96±2.01

SCv6 (18 h)

27.5±1.23

32±1.06

SCv7 (20 h)

44.18±2.10

45±2.09

SCv8 (0 h)

27.5±1.14

29.54±1.02

SCv9 (9 h)

24.44±0.09

27.98±1.04

SCv10 (18 h)

 

Abbreviation: S=sample, Cv=Coronilla varia L.,

مقدار کلروفیل  قبل از ChB= Chlorophyll before UV-C treatment (quanta)          UV-C

مقدار کلروفیل پس از ChA= Chlorophyll after UV-C treatment (quanta)            UV-C

,UVC = UV-C (hours) (ساعت)  UV-C زمان کل تحت تیمار.

 

 

شکل 1: مقایسه مقدار کلروفیل برگ قبل و بعد از قرار گرفتن در معرض  UV-Cدر نمونه های شاهد و تحت تیمار، برای نوع تیمارها به مواد و روش­ها مراجعه شود (S=sample, Cv=Coronilla varia L. و عدد شماره تیمار است).

 


هیدرولیز اسیدی و شناسایی فلاونوئیدهای آگلیکون: مقدار 5/0 میلی­گرم از عصاره­های مورد استفاده در 2-DPC هر جمعیت در 5/0 میلی­لیتر اتانول 70 درصد حل شدند و در لوله­های آزمایش برچسب­دار ریخته شدند. به هر لوله آزمایش 2 میلی­لیتر اسید کلریدریک 2 مولار افزوده و مخلوط به          مدت 5/0 ساعت در بن­ماری 100 درجه سانتی­گراد قرار داده شد. پس از بیرون آوردن و سرد شدن لوله­ها 2 میلی­لیتر اتیل‏استات به هر لوله اضافه شد. پس از تشکیل دو فاز        مجزا، محلول رویی برداشت شد و بعد از تبخیر، در 5 میلی لیتر اتانول حل گردید و به همراه استانداردهای قابل دسترس     (تهیه شده از MERCK و FLUKA) در متانول 80 درصد           برای کروماتوگرافی لایه نازک (TLC) در سه حلال         مختلف استفاده گردید. کروماتوگرام­ها در حلال‏هایBAW، CAW (Chlorophorm, Acetic acid, Water 3:0.4:6) و فروستال قرار داده شدند. در پایان کروماتوگرام­ها خشک و با UV در طول موج 366 نانومتر خوانده شدند. مقادیر RF برای هر لکه محاسبه و با مقایسه با استانداردهای مورد استفاده، شناسایی و غلظت هر یک از فلاونوئیدهای شناسایی شده بر اساس ابعاد لکه­ها و شدت رنگ آن‏ها در 366 نانومترUV (Camag UV Cabinet 254 & 366 nm) با استفاده از Chrogramatographic Map & UV Spectroscopy و منابع معتبر (37 و 38) انجام گردید که استفاده از حلال   CAW بهترین نتایج را به دست داد. شناسایی و ارزشیابی     نهایی به وسیله ی Rf، از روی ترسیم کروماتوگرافی،          اندازه­گیری لکه­های منظم دارای hRf یکسان،                  نقشه کروماتوگرافی مکان و رنگ لکه، طیف­ها             (Perkin-Elmer Lambda 15 UV/Viz Spectrophotometer)، مراجعه به منابع مناسب  (39 و 40) صورت گرفت.


 

شکل 2: نمایش کروماتوگرام های  TLC در حلال CAW برای استانداردها و نمونه های تحت تیمار و شاهد Coronilla varia . اعداد شماره تیمارها و تکرار برخی از آن ها است.

Abbreviations: Ru=Rutin, K= Kaempferol, Q=Quercetin, M= Myricetin, L=Luteolin, Rh=Rhamnetin, V=Vitexine, N=Naringenin, Ch=Chrysin, I-Rh=Isorhamnetin, A=Apigenin.

 

 

 

جدول 3: داده های حاصل از کروماتوگرافی کاغذی دو بعدی (2-DPC) و لایه نازک (TLC) نمونه های برگ گیاهان Coronilla varia تحت تیمارهای مختلف UV-C در مقایسه با گیاهان شاهد گلخانه ای و مزرعه ای این گونه.

Samples

Flavonoid type

 

Identification

Number of total flavonoids

Number of flavonoid sulphates

Number of flavone C-and C-/O-glucosides

Number of Aglycones

Rutin

Quercetin

Kaempferol

Myricetin

Narengenin

Rhamnetin

Iso rhamnetin

Chrysin

Apeginin

Vitexin

Luteolin

code

treatments

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

SCv1

GH control

5

3

2

-

 

-

+

-

+

+++

+++

+

++

+++

-

-

SCv2

UV+UV-1h

5

3

2

-

 

-

+

-

+

++

+++

+

+

+

+++

+++

SCv3

UV+UV-2h

4

2

2

-

 

-

+

-

+

+

++

+

++

+

++

+++

SCv4

UV-UV+1h

3

1

2

-

 

-

+

-

+

++

++

+

-

+

+++

++

SCv5

UV-UV+2h

6

4

2

-

 

-

++

-

++

+

+

++

-

+

+

+

SCv6

UV+UV+1h

2

1

1

-

 

-

+

-

+

++

++

+

-

+

+++

++

SCv7

UV+UV+2h

5

3

1

1

 

-

+

-

+

++

++

+

-

+

+

+

SCv8

F control

6

4

2

-

 

-

+

-

+++

+++

+++

+

+

+

-

-

SCv9

UV-UV+1h

5

3

2

-

 

-

+

++

-

-

-

-

-

-

++

+++

SCv10

UV-UV+2h

6

3

3

-

 

-

-

+

-

-

-

-

-

-

++

+++

Abbraviations: S=sample, Cv=Coronilla varia, GH=glass house, F=field, h=hour, numbers=treatment numbers.

Scored characters: -0 (non flavonoid), + 1 (few flavonoid), ++ 2 (high concentration of flavonoid).

 

 

 

 

نتایج

نتایج حاصل از این پژوهش در جدول 2 و شکل 1، کاهش میانگین مقدار کلروفیل موجود در برگچه­ها در گیاهان تحت تیمار UV-C در مقایسه با شاهدهای گلخانه­ای و مزرعه­ای ((SCv1, SCv8 را قبل از درمعرض قرار گرفتن و پس از درمعرض قرار گرفتن UV-C در همه نمونه­ها نشان می­دهند. همه نمونه­های تحت تیمار UV-C مقدار کلروفیل کمتری را نسبت به نمونه­های شاهد گلخانه­ای بذری و مزرعه­ای نشان می‏دهند که نمونه SCv10 کمترین مقدار کلروفیل را داراست و نمونه­های شاهد ((SCv1, SCv8 بیشترین مقدار کلروفیل را دارا هستند. اندازه­گیری کلروفیل نیز بلافاصله پس از تیمار UV-C در نمونه­های تحت تیمار نیز همین نتایج را در مقایسه با نمونه‏های شاهد نشان می­دهد. شکل 2 کروماتوگرام­های  TLCرا در حلال CAW برای استانداردها و نمونه­های تحت تیمار و شاهد Coronilla varia نشان می­دهد. داده­های حاصل از کروماتوگرافی کاغذی دو بعدی (2-DPC) و لایه نازک (TLC) نمونه­های برگ گیاهان Coronilla varia تحت تیمارهای مختلف UV-C در مقایسه با گیاهان شاهد گلخانه­ای و مزرعه­ای این گونه نیز در جدول 3 آورده شده است. شکل 3 نیز تعداد و تنوع فلاونوئیدهای موجود در برگچه­های هر یک از نمونه­های تحت تیمار پرتو  UV-Cرا در مقایسه با نمونه­های شاهد گلخانه‏ای و مزرعه­ای در هیستوگرام ستونی سه بعدی بر مبنای داده‏های جدول 3 با استفاده از ارزش­گذاری صفات کیفی نشان می‏دهد. در این نمودار وجود کامفرول در نمونه­های تحت تیمار UV-C مزرعه­ای و عدم وجود فلاونوئیدهای موجود در گیاهان شاهد اهمیت دارد.


 

 

شکل 3: تعداد و تنوع فلاونوئیدهای موجود در برگچه های هر یک از نمونه های تحت تیمار پرتو  UV-Cدر مقایسه با نمونه های شاهد گلخانه ای و مزرعه ای با استفاده از روش های کروماتوگرافی دوبعدی و لایه نازک.

Abbreviations: NTF= Number of total flavonoids, FSN=flavonoid sulphates number, FCN= flavone C-and C-/O-glucosides number, AN=aglycones number, Ru=Rutin, K= Kaempferol, Q=Quercetin, M= Myricetin, L=Luteolin, Rh=Rhamnetin, V=Vitexine, N=naringenin, Ch=chrysin, I-Rh=Isorhamnetin, A=Apigenin.

Scored characters for drowing 3-D column histogram in Excel based on Table 1 data: -0 (non flavonoid), + 1 (few flavonoid), ++ 2 (high concentration of flavonoid).

 

 


بحث

مطالعات مختلف در خصوص تاثیر  UV-Cبر گیاهان نشان می‏دهد که اثرات UV بر همه گیاهان یکسان نبوده و تاکنون اثرات بیولوژیکی بسیاری از تاثیر UV-B بر گیاهان خشکی­زی گزارش شده است. Singh (13)،Biggs  و همکاران (14) وKrizek  و همکاران (15) در مطالعات خود کاهش کلروفیل، پیچیدگی و مومی شدن برگ­ها، کاهش سطح برگ و افزایش فلاونوئیدها (16) را در گیاهان تحت تیمار UV در مقایسه با کنترل نشان دادند. چنانکه جدول 2 و شکل 1 نشان می­دهند میانگین مقدار کلروفیل موجود در برگچه­ها در گیاهان تحت تیمار UV-C در مقایسه با شاهدهای گلخانه­ای و مزرعه­ای ((SCv1, SCv8 کاهش یافته است و این کاهش در نمونه­های SCv7 و SCv10 که ساعات بیشتری در معرض UV قرار داشته­اند مشهودتر بود. در حالی که نمونه شاهد بذری (SCv1) و نمونه شاهد مزرعه­ای (SCv8) که تحت تیمار نبوده­اند بیشترین مقدار کلروفیل را دارا بودند. کاهش مقدار کلروفیل در گیاه ایجاد کلروز می­کند. این نتایج با یافته­های Teramura و همکاران (7) که نشان داد تغییرات ساختاری ایجاد شده در گیاهان به وسیله یUV در کلروپلاست­ها و پروتئین­های D1 و D2 در مرکز فتوسیستم 2 می­تواند منجر به کاهش ظرفیت فتوسنتزی و سرعت رشد شود قابل تایید است. فتوسنتز یکی از فرآیندهای فیزیولوژیکی است که در زمینه بررسی تابش UV-B بر رشد بسیار مطالعه شده است. هنگامی که Teramura (39) تابش بالای UV-B را همراه با نور سفید ملایم (شرایط معمولی اتاقک­های رشد) به کار برد، اثرات آن بر فتوسنتز، به عنوان جاذب CO2 در گیاهان حساس به UV-B به طور کلی زیان­آور بود (39). بنابراین حتی در حضور مقادیر بالای نورسفید در گلخانه و مزرعه کاهش بیش از 17 درصد در کولتیوار سویای حساس به UV-B هنگامی که مجهز به تخلیه 16 درصدی اُزن بود، در فتوسنتز مشاهده گردید (40). مطالعات رحمت زاده و همکاران (10) بر روی گندم نشان داد که تابش UV-C منجر به کاهش محتوای پروتئین و قند در نمونه­های تیمار شده با این پرتو شده است. همچنین، پرتو UV-C منجر به کاهش معنی‏داری در محتوای کلروفیل و کاروتنوئیدها در گیاهان تیمار شده با UV گردید (10). Tevini و همکاران (41) با مطالعاتی که با تاباندن پرتو UV-B مصنوعی و شبیه­سازی لایه اُزن و تخریب آن در گلخانه و اتاقک شیشه­ای بر روی گیاهان انجام داد کاهش در اندازه گیاه، طول برگ، وزن تر، وزن خشک، مقدار چربی و فعالیت­های فتوسنتزی گونه­های گیاهی حساس به این پرتو را مشاهده نمود. نتایج این پژوهش نشان می­دهد که پرتوهای UV با کاهش کلروفیل، فتوسنتز را تحت تاثیر قرار داده و کاهش فتوسنتز می­تواند فرآیند رشد را تحت تاثیر قرار داده و سبب کاهش رشد گردد.

تغییرات فیتوشیمیایی فلاونوئیدها نیز به عنوان یکی از مکانیسم‏ها و واکنش­های دفاعی گیاهان برای مقابله و یا سازش در برابر تنش­های محیطی شناخته شده است (8) و مطالعات بسیاری نیز در زمینه تاثیر UV و سایر تنش­ها بر گیاهان تا کنون صورت گرفته است. فلاونوئیدها از دسته ترکیبات پلی‏فنلیک در گیاهان هستند. فنلیک­ها دارای اعمال مختلفی در گیاهان می­باشند. افزایش متابولیسم فنیل پروپانوئید و مقدار ترکیبات فنلیکی می‏تواند تحت فاکتورهای محیطی مختلف و شرایط تنشی مشاهده شود. سنتز ایزوفلاون­ها و برخی فلاونوئیدهای دیگر، وقتی گیاهان آلوده یا مجروح شوند یا تحت دماهای پایین و شرایط کمبود تغذیه­ای قرار گیرند، القا می­شوند. گیاهان فلاونوئیدهای جذب کننده UV و دیگر ترکیبات فنلیکی را به طور عمده در واکوئل­های سلول­های اپیدرمی انباشته می‏کنند. ظاهرا گیاهان در طی تکامل خود را با سطوح مختلف تابش پرتوهای UV-B از طریق حداقل دو مکانیسم حفاظتی شامل برهم­کنش نوری و رنگیزه­های جاذب پرتوهای فرابنفش مانند فلاونوئیدها و فنیل پروپانوئیدها تطبیق داده­اند. برهم­کنش نوری از طریق ترمیم دیمرهای تیمین نوع سیکلوبوتان ممکن است مسئول بیشترین آسیب DNA القا شده به وسیله پرتو UV-B باشند (20). چنانکه جدول 3 و شکل 3 نشان می­دهند تغییر در تعداد و نوع فلاونوئیدهای برگ گیاهان تحت تیمار UV نسبت به شاهد مشاهده می­گردد. ایجاد لوتئولین و وی­سنین در گیاهان تحت تیمار و عدم وجود آنها در گیاهان شاهد، ایجاد کامفرول در نمونه­های مزرعه­ای تحت تیمار UV و عدم وجود آن در سایر نمونه­ها، وجود کریسین در نمونه­های شاهد و عدم وجود آن در نمونه­های تحت تیمار UV، حذف آپی­جنین، ایزورامنتین، رامنتین، نارنجنین، میرستین و کوئرستین در نمونه­های مزرعه­ای تحت تیمار UV نشان دهنده‏ی ایجاد تغییر در نوع فلاونوئیدهای موجود در این گیاهان در مقایسه با شاهد است که بیشترین تغییرات در نمونه‏ی SCv10 مشاهده گردید. در مطالعات Tevini و همکاران (24) عمل حفاظتی فلاونوئیدها در بهبودی آسیب وارده UV-B به فتوسنتز به طور واضح در جوانه‏های گندم سیاه به اثبات رسیده است، طوری که ایزوویتکسین­ها و سایر فنیل پروپانوئیدها منحصرا در لایه‏ی اپیدرمی انباشته شده‏اند. مطالعاتLi  و همکاران (27) و  Brittو همکاران (26) نشان داده است که موتان­های فاقد فلاونوئید Arabidopsis بسیار به پرتوهای UV کیهانی حساس هستند. محافظت از آسیب DNA ایجاد شده به وسیله ی UV-B توسط فلاونوئیدها در جوانه­های ذرت نشان داده شده است (28). همچنین مطالعات Caldwell  و همکاران (29) تحریک سنتز رنگیزه­های جاذب UV تحت تاثیر پرتوهای UV را در گیاهان نشان می­دهد. تجمع ترکیبات فنلی جاذب UV نیز در پاسخ گیاه به پرتوهای بالای خورشیدی نیز مشاهده شده است که می‏توانند گیاه را در برابر پرتوهای UV محافظت کنند (29 و 30). مطالعات میرزاتونی (31) نشان داد که اپیدرم برگ گیاهان عالی به دلیل داشتن ترکیبات جاذب مانند فلاونوئیدهای موجود در واکوئل­های سلول­های اپیدرمی، به عنوان یک لایه محافظ در برابر پرتوهای UV عمل می­کند. همچنین این مطالعات ثابت کرد که کاهش درصد اسانس در ریحان تحت تاثیر پرتوهای UV می­تواند به دلیل تغییر مسیر پیش ساخت­های ترکیبات اسانس باشد. یعنی اسیدهای آمینه آروماتیک که پیش­ساز مشترک ترکیبات فنلی اسانس و فلاونوئیدها هستند بیشتر به سمت سنتز ترکیبات جاذب UV مانند فلاونوئیدها هدایت می­شوند. بر مبنای مطالعات نوری و همکاران (34 و 42) فلاونوئیدها از جمله ترکیبات فیتوشیمیایی هستند که برای دفاع و مقابله با شرایط نامساعد محیطی مانند نور شدید، کم­آبی و آلاینده­ها و همچنین کاهش آسیب در برخی گیاهان ساخته شده و یا دچار تغییر می‏شوند. چنین مطالعاتی نقش فلاونوئیدها را به عنوان یکی از مکانیسم‏های دفاعی، سازش و مقابله گیاهان در برابر تنش­های محیطی مانند پرتوهای UV نشان می­دهد.

 

نتیجه گیری

نتایج حاصل از این پژوهش نشان می­دهد که تاثیر پرتو UV-C بر گیاهان تحت تیمار Coronilla varia تغییرات نامطلوبی را در آنها ایجاد می­کند که منجر به کاهش کلروفیل، فتوسنتز و رشد در آن‏ها شده که در نهایت با کلروز و نکروز گیاه سبب نابودی آنها می­گردد. گیاهان تحت تیمار نیز برای بقا با انجام تغییرات فیتوشیمیایی مانند تغییر در متابولیت­های ثانویه و از جمله فلاونوئیدها به دفاع و مقابله با این تنش محیطی می‏پردازند. چنانکه نتایج حاصله نیز نشان داد که گیاهان تحت تاثیر UV-C با حذف برخی از فلاونوئیدها و یا ایجاد برخی دیگر سبب تغییر در تعداد و نوع فلاونوئیدهای موجود در خود شده تا بدینوسیله در برابر آسیب­های ناشی از این تنش فیزیولوژیک سازش، مقابله و دفاع کنند.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان از حمایت مالی حوزه معاونت محترم پژوهشی دانشگاه اراک در انجام این پژوهش قدردانی می­کنند.

 

  1. Caldwell RR, Dave R, Steinhardt PJ. Cosmological Imprint of an Energy Component with General Equation of State. Phys. Rev. Lett. 1998; 80:1582–1585.
  2. Stapleton AE. Ultraviolet radiation and plant: buring questions. The Plant Cell. 1992; 4: 1353-1358.
  3. Searles PS, Flint SD, Caldwell MM. A meta-analysis of plant field studies simulatingstratospheric ozone depletion. Oecologia. 2001; 127: 1-10.
  4. Day TA, Ruhland CT, Grobe CW,  Xiong F. Growth and reproduction of Antarctic vascular plants in response to warming and UV radiation reductions in the field. Oecologia. 1999; 119: 24-35.
  5. Frohnmeyer H, Staiger D. Ultraviolet-B radiation-mediated responses in plants. Balancing damage and protection. Plant physiology. 2003; 133 (4): 1420-8.
  6. Casti P, Andreo CS. UV-B and UV-C induction of NADP-malic enzyme in tissues of different cultivars of Phaseolus vulgaris (Bean). Plant Cell and Environment. 2001; 24: 627-630.
  7. Teramura AH, Briggs WR. How plants respond to a changing UV-B radiation environment in regulation of plant growth and development by light? American Society of Plant Physiology. 1996; 164-170.
  8. Reddy AR, Chaitanya KV, Vivekanandan M. Drought induced responses of photosynthesis and antioxidant metabolism in higher plants. Journal of Plant Physiology. 2004; 161(11): 1189-1202.
  9. Santhos I, Fidalgo F, Almedia JM, Salema R. Biochemical and ultrastructural changes in leaves of potato plants grown under supplementary UV-B radiation. Plant Science. 2004; 167: 925-935.
  10. 10.  Rahmatzade S, Khara J. [Effects of UV-C on growth & some analytical & physiological parameters in symbiotic wheat plants with 3 species of mycorhizal fungi]. Iranian Biology J. 2009; 21(1): 52-62. (Persian).
  11. 11.  Iwanzik W, TeviniM, Dohnt G, Voss M, et al. Action of UV-B radiation on photosynthetic primary reactions in spinach chloroplasts. Physiol. Plant. 1983; 58: 401.
  12. 12.  Prasil O, Adie N, Ohad I. Dynamics of photosystem II: mechanisms of photoinhibition and recovery processes, in The Photosystems. Structure, Fundation and Molecular Biology. Barber, J,( eds). Amsterdam: Elsevier; 1992; 295.
  13. 13.  Singh A. Growth, physiological, and biochemical responses of three tropical legumes to enhanced UV-B radiation.-Can. J. Bot. 1996; 74: 135–139.
  14. 14.  Biggs R.H, Sisson W.B, Caldwell M.M. In Impacts of climatic change on the biosphere. Part I. Ultraviolet radiation effects, (D.S. Nachtwey, M.M. Caldwell, R.H. Biggs, (eds). Monogr 5. Climatic impact Assessment Program. US Dept. of Transportation Report No. DOT-TST-75-55. Nat. Techn. Info. Serv. Springfield, VA; 1975; 263-273.
 

15. Krizek DT, Karmer GF, Mirecki RM. Influence of UV-B radiation and putrescine on shoot and root growth of cucumber seedlings grown in nutrient solution. J. Plant Nutr. 1997; 20(6): 613-623.

  1. 16.  Balakrishnan V, Ravindran, KC, Venkatesan K, Karuppusamy S. Effect of UV-B supplemental radiation on growth and biochemical characteristics in Ccrotalaria juncea L. seedlings. EJEAFChe. 2005; 4 (6): 1125-1131.
  2. 17.  Mazza CA, Battista D, Zima AM, Szwarcberg – Bracchitta M, et al. Plant Cell Environ. 1999; 22: 61-70.
  3. 18.  Mackerness SAH, John CF, Thomas B. Early signaling components in ultraviolet-B responses: Distinct roles for different reactive oxygen species and nitric oxide. FEBS Lett. 2001; 489: 237-242.
  4. 19.  Diaz J, Bernal A, Pomar F, Merino F. Induction of shikimate dehydrogenase and peroxidase in pepper (Capsicum annuum L.) seedling in response to copper stress and its relation to lignification. Plant Science. 2001; 161: 179–188.
20. Quaite FE, Sutherland BM, Sutherland JC. Action spectrum for DNA damage in alfalfa lowers predicted impact of ozone depletion. Nature. 1992; 358: 576-578.

21. Bornman J.F, Reuber S, Cen Y.P, Weissenböck G. Ultraviolet radiation as a stress factor and the role of protective pigments, in Plant and UV-B: Responses to Environmental Change. Lumsden. P. J, (eds), Society for Experimental Biology seminar series 64. Cambridge: Cambridge University Press; 1997; 157.

  1. 22.  Tevini M, BraumJ, Fieser G. The protective function of the epidermal layer of rye seedlings against ultraviolet-B radiation. Photochem. Photobiol. 1991; 53: 329.
  2. 23.  Bornman JF, Vogelmann TC. Effects of UV-B radiation on leaf optical properties measured with fibre optics. J. Exp. Bot. 1991; 42: 547.
24.Tevini M, Mark U, Salie-Mark M. Effects of enhanced solar UV-B radiation on growth and function of crop plant seedlings. Randall, D. D, Blevius, D. G, (eds). Current Topics in Plant Biochemistry and Phys. Columbia: University of Missori; 1991; 9: 13.

  1. 25.  Braun J, Tevini M. Regulation of UV-protective pigment synthesis in the epidermal layer of rye seedlings (Secale cereal L. cv Kustro). Photochem. Photobiol. 1993; 57(2): 318.
  2. 26.  Britt AB, Chen JJ, Wykoff D, Mitchell DA. UV-sensitive mutant of Arabidopsis defective in the repair of pyramidine-pyrimidione (6-4) dimmers. Science. 1993; 261: 1571.
  3. 27.  Li J, Ou-Lee TM, Raba R, Amundson RG, et al. Arabidopsis flavonoid mutants are hypersensitive to UV-B irradiation. Plant Cell. 1993; 5(2): 171.
  4. 28.  Stapleton AE, Walbot V. Flavonoid can protect maize DNA from the induction of ultraviolet radiation damage. Plant Physiol. 1994; 105: 881.
  5. 29.  Caldwell MM, Flint SD, Searles PS. Spectral balance and UV-B sensitivity of soybean: A field experiment. Plant Cell Environ. 1994; 17: 267-276.
  6. 30.  Viet M, Bilger W, Muhlbeuer T, Brummet W, et al. Diurnal changes in flavonoids. J. Plant Physiol. 1996; 148: 478-482.
  7. 31.  Mirzatoni A. [Effects of UV on anatomical & ontogenical structure & quantitative & qualitative ocimum essential oil]. MSC Thesis. Islamic Azad University. 1998. (Persian).
32.Teramura AH, TeviniM, Iwanzik W. Effects of ultraviolet-B irradiance on plants during mild water stress. Effects on diurnal stomatal resistance. Physiol. Plant. 1983; 57(I): 175.

33.Tevini M, Iwanzik W, Teramura AH. Effects of UV-B radiation on plants during mild water stress. Effects on growth, protein and flavonoid content. J. Pflanzenphysiol. 1983; 110 (II): 459.

  1. 34.  Noori M, Malayeri BE, Jafari M. Determination of fluoride and its effects on flavonoids in some Legumes. Toxicological and Environmental Chemistry. 2009; 91 (3): 409-418.
35.Rechinger KH. Flora Iranica .Akademische Druch-Und verlagsantalt Graz. 1984; 157: 327-361.

  1. 36.  Ghahreman A. [Coromophytes of Iran (Plant Systematics)]. Tehran: Markaz Nashre Daneshgahi. 1993; 2:428-507. (Persian).
  2. 37.  Markham KR. Techniques of flavonoid identification. Academic press. 1982; 16-55.
  3. 38.  Mabry TJ, Markham KR, Thomas MB. The systematic identification of flavonoids. Berlin-Heidelberg, New York: Springer-verlag. 1970; 394.
  4. 39.  Teramura A.H. In stratospheric ozone reduction, solar ultraviolet radiation and plant life (R.C. Worrest and M. M. Caldwell, (eds). Nato ASI series, Vol. 8, Springer-Verlag, Berlin; 1986; 327-343.
  5. 40.  Murali NS, Teramura AH, Randall SK. Response differences between two soybean cultivars with contrasting UV-B radiation sensitivities. Photochem Photobiol. 1988; 48: 653.
  6. 41.  Tevini M. UV-B effects on plants. In: Agrawal SB, Agrawal M, (eds). Environmental Pollution and Plant Responses, pp.83-97. Lewis Publishers, Boca Raton, U.S.A. 2000.
  7. 42.  Noori M, ChehreghaniA, Hatami A. Nitrotoxins in 3 genera of Papilionoideae (Leguminosae) from central of Iran. Toxicological and Environmental Chemistry. 2007; 89 (3): 479-485.