بررسی ویژگی‏های چسبندگی و تکثیری جمعیت‏های مختلف سلول‏های اپیدرمی فولیکول مو در محیط کشت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

چکیده

هدف: "فرضیه‏ی فعال شدن بالژ" در زمینه‏ی چرخه‏ی فولیکول مو اخیرا توجه زیادی را  به خود جلب کرده است. یکی از جنبه‌های این فرضیه این است که سلول‏های پیش‌ساز اپیدرمی موجود در قاعده‏ی فولیکول سلول‏های تقسیم شونده‏ی موقتی هستند که طول فاز رشد فولیکول را محدود می‌کنند. در این مطالعه، الگوی تکثیر این سلول‌ها بررسی و با سلول‏های اپیدرمی مستقر در بخش بالای فولیکول مقایسه شد. مواد و روش‏ها: برای این کار سلول‏های اپیدرمی ناحیه‏ی پایینی و ناحیه‏ی بالایی فولیکول ویبریسا جدا شده و در محیط کشت رشد داده شدند و طی کشت ویژگی‏های رشد این دو نوع سلول برای چندین هفته اندازه‌گیری گردید. نتایج: یافته‌های این تحقیق نشان داد که سلول‏های اپیدرمی پایینی نسبت به همتایان خود که از ناحیه‏ی بالای فولیکول مشتق شده بودند خیلی دیر به بسترچسبیده و بطور آهسته‌تر رشد می‏کنند. به علاوه، هر چند که اکثریت سلول‏های پائینی فولیکول قادر نیستند که برای مدت طولانی به رشد خود ادامه دهند اما برخی از آنها کلنی‌های سلولی بزرگی را تشکیل داده و توانستند برای بیش از 10 هفته رشد کنند و تا چندین بار نیز بازکشت شدند. نتیجه‌گیری: بر خلاف تصور رایج، در اینجا نشان داده شد که در محیط کشت، حداقل تعدادی از سلول‏های قاعده‏ی فولیکول، دارای توانایی تکثیری هستند که این توانایی از طول فاز رشد فولیکول بسیار بیشتر است و بنابراین خاتمه‏ی فاز رشد فولیکول نمی‌تواند ارتباطی به قابلیت تکثیر این سلول‏ها داشته باشد.    

کلیدواژه‌ها


مقدمه

فولیکول مو در پستانداران یک سیستم ترمیم شونده‏ی دینامیک و بی­نظیری است که در سرتاسر حیاتش چرخه­های تکراری متشکل از فاز رشد (anagen)، فاز پسرفت (catagen) و فاز استراحت (telogen) را پشت سر می گذراند (1). این فعالیت چرخه­ای جز ویژگی ذاتی فولیکول بوده و ناشی از برهم­کنش های بین بخش های درمی و اپیدرمی فولیکول می­باشد. در فولیکول موهای پوششی، بعد از اینکه ماتریکس اولیه (جمعیت سلول های اپیدرمی قاعده ی فولیکول) در طی رشد و نمو جنینی از پلاکود اپیدرمی تشکیل شد (2)، نسل بعدی سلول های ماتریکس پیاز یا بولب (bulb) از ناحیه‏ی برآمدگی یا "بالژ" (bulge) مستقر در غلاف خارجی ریشه­ (outer root sheath) یا ORS منشا می­گیرند (3). سلول های موجود در بالژ از زمانی که کاتسرالیس و همکارانش (4) نشان دادند که آن ها می­توانند مواد رادیواکتیو را برای مدت طولانی در خود نگه دارند موضوع تحقیقات زیادی قرار گرفته­اند. برعکس، مطالعات نشانه گذاری با مواد رادیواکتیو نشان داده که سلول‏های ناحیه‏ی ماتریکس بولب فاقد چنین قابلیتی هستند (5). محققین براین باورند که توانایی  یک سلول برای نگهداشت و حفظ طولانی مدت ماده‏ی نشاندار مبین این است که این سلول دارای چرخه‏ی سلولی آهسته است، و این یکی از ویژگی های سلول های بنیادی است. بعدها مطالعات دیگری نیز انجام و نشان داده شد که سلول های مستقر در بالژ دارای تمام ویژگی ها و مارکرهای  مربوط به سلول های بنیادی هستند (10-6).  بر طبق عقیده‏ی حاضر و تحت شرایط هومئوستازی طبیعی سلول های ناحیه ی بالژ در پاسخ به برهم­کنش های مزانشیمی-اپیدرمی در شروع فاز رشد به سمت پایین مهاجرت کرده و بخش اپی­تلیالی قاعده‏ی فولیکول مو را بوجود می­آورند (11). اما، آنها همچنین می­توانند در پاسخ به جراحت وارده به اپیدرم پوست به طرق بالا نیز مهاجرت کنند (12و 13). در طی این مهاجرت سلول های بالژ نه تنها به انواع مختلف سلول های اپی­تلیال تبدیل می­شوند بلکه می­توانند به انواعی از سلول های غیراپی­تلیالی نیز تمایز یابند که این نیز ویژگی چندتوانه بودن آنها را آشکار می‏کند (14).

در طول فاز رشد چرخه‏ی مو، اپی­تلیال زاینده      (germinative epithelial) یا GE و سلول‏های ماتریکس بولب از سلول‏های واقع در بالژ منشاء می­گیرند ولی زمان و نحوه‏ی بکارگیری این سلول‏ها در ناحیه‏ی بولب  هنوز مورد بحث است (15). سلول‏های GE در انتهایی‏ترین بخش قاعده‏ی بولب فولیکول قرار داشته و در تماس مستقیم با پاپیلای درمی (dermal papilla) هستند (16). این سلول‏های زاینده از نظر ویژگی‏های تمایزی بعنوان حدواسط بین سلول‏های بالژ و ماتریکس در نظر گرفته شده و آن‏ها هستند که به ماتریکس تکثیر شونده تبدیل می­شوند (17). سلول‏های ماتریکس متعاقبا بطور سریع تقسیم و تکثیر پیدا کرده و از زاده­های آن‏ها لایه‏های متعدد و متحدالمرکز رشته‏ی مو ایجاد می­گردد. سلول‏های ماتریکس در انتهای فاز رشد، از تقسیم و تکثیر باز ایستاده و متعاقبا فولیکول از طریق یک مرحله‏ی موقتی پسرفت وارد فاز استراحت می­شود. گمان می­رود که این قابلیت تکثیر سلول های ماتریکس بولب است که طول فاز رشد فولیکول مو را دیکته می‏کند و دلیل اینکه فولیکول‏های مناطق مختلف بدن دارای طول فاز رشد متفاوتی هستند این است که قابلیت تکثیر این سلول‏ها در آنها با هم فرق می‏کند. یکی از چالش‏هایی که در زیست‏شناسی مو وجود دارد این است که بفهمیم چه عاملی باعث می‏شود که سلول‏های اپی­تلیال ماتریکس بولب به یکباره از تکثیر باز ایستاده و در آغاز فاز پسرفت شروع به پشت سرگذاشتن روند مرگ سلولی برنامه ریزی شده (apoptosis)  می­کنند (18).

یکی از جنبه­های "فرضیه‏ی فعال­شدن بالژ" که در ابتدای دهه‏ی1990 مطرح شد این است که دلیل توقف رشد مو در انتهای فاز رشد پایان یافتن  قدرت تکثیر سلول‏های ماتریکس است و آن‏ها دیگر قادر به ادامه‏ی تقسیم سلولی نیستند.  بر طبق این فرضیه سلول‏های اپیدرمی ماتریکس فولیکول مو در حقیقت سلول‏های "تقسیم شونده‏ی موقتی" (transientamplifying) یا TA هستند و با توجه به تعریف از پتانسیل تکثیری محدودی برخوردارند. این عقیده وجود دارد که تفاوت‏هایی که در طول فاز رشد در بین انواع فولیکول‏های مختلف دیده می شود  ناشی از تفاوت در پتانسیل تکثیر این سلول‏های TA موجود در ماتریکس فولیکول ها است (19). در فولیکول‏هایی مثل فولیکول‏های پوششی موش که دارای طول فاز رشد کوتاهی هستند، عقیده بر این است که در شروع فاز رشد جمعیتی از سلول‏ها از ناحیه ی بالژ به قاعده‏ی فولیکول مهاجرت کرده و این سلول‏ها هستند که منبع لازم برای تکثیر و ایجاد رشته‏ی مو را فراهم کرده و با پایان یافتن قدرت تکثیر این سلول‏ها، فاز رشد نیز خاتمه می­یابد (20). اما، فولیکول‏هایی همچون فولیکول‏های موی سر انسان و ویبریسا (موهای زیر و غیر پوششی پشت لب فوقانی بعضی پستانداران) دارای فاز رشد طولانی­تری هستند و از این رو به تامین و مهاجرت مداوم سلول از ناحیه‏ی بالژ نیاز دارند (21). چیزی که سبب توقف مهاجرت سلول‏ها از بالژ بسمت بولب می­شود هنوز ناشناخته مانده است چراکه در شروع فاز پسرفت زاده­های بالژ که قبلا از طریق ORS بطرف بولب مهاجرت کرده بودند قادرند که دوباره به بالژ برگردند (22).

در عمل فراهم آوردن اطلاعات در زمینه ی اینکه آیا سلول‏های ماتریکس واقعاً از نوع TA بوده و دارای پتانسیل تکثیر محدودی هستند یک هدف چالش انگیز است زیرا تعیین کمی قدرت تکثیر این سلول‏ها بطور مستقیم در in vivo مشکل است. با توسعه‏ی تکنیک ها برای کشت سلول‏های اپی­تلیال فولیکول، محققین این توانایی را بدست می­آورند تا ظرفیت تزاید این سلول‏ها را در محیط کشت (in vitro) مورد ارزیابی و سنجش قرار دهند. در این مطالعات، توانایی­های سلول بنیادی اپیدرمی معمولا از روی پتانسیل کلنی­زایی و یا قابلیت اتصال آنها به بستر مورد سنجش قرار می­گیرد (10 و 23). اتصال سریع سلول های اپی­تلیال به بستر به بیان بالای گیرنده­های مخصوص ترکیبات خارج سلولی همچون کلاژن IV و لامینین در سطح سلول بستگی دارد (24). برای مثال، نشان داده شده که در سطح سلول های بنیادی اینتگرین α6β1، یک گیرنده‏ی لامینین، وجود دارد (25). با این وجود، اخیرا نشان داده شده که چسبندگی سریع سلول‏های اپی­تلیال ضرورتا قابلیت زنده مانی بیشتر به سلول‏ها اعطا نمی­کند (26).

همانگونه که در این تحقیق نشان داده خواهد شد و قبلا نیز دیگران گزارش کرده­اند، سلول‏های اپیدرمی ماتریکس واقع در ناحیه‏ی بولب فولیکول دارای پتانسیل کلنی­زایی کمتری در مقایسه با سلول‏های اپیدرمی موجود در بخش بالایی فولیکول هستند (27، 28و29). با وجود پیشرفت هایی که در کشت سلول‏های اپیدرمی فولیکول مو، از جمله ماتریکس، صورت گرفته (30 و 31) پتانسیل رشد و تکثیرسلول‏های اجدادی موجود در انتهای ماتریکس بولب به روشنی مشخص نشده است. بنابراین، ما در این مطالعه تلاش نمودیم تا ویژگیهای رشد و پتانسیل تکثیر این سلول‏ها را با سلول‏های بالژ واقع در ORS فولیکول ویبریسای موش صحرایی (rat) مقایسه نماییم.

 

مواد و روش‌ها

فولیکول‏های ویبریسا در میانه‏ی فاز رشد از لب بالای موش صحرایی نژاد PVC (inbred Piebald Virol Glaxo rat) با روش مرسوم جدا شدند (32). بعد از زدودن بافت‏های همبند اطراف، فولیکول‏ها با دو برش عرضی به سه قطعه تقسیم شدند، بدین ترتیب که یک برش درست بالای پیاز یا بولب فولیکول و برش دیگر درست زیر نقطه‏ی ورود عصب به داخل کپسول کلاژنی فولیکول انجام شد. سپس قطعه‏ی میانی دور انداخته شد ولی قطعه­های پایینی (حاوی سلول‏های اپیدرمی پائین فولیکول یا قاعده ی بولب) (End Bulb) یا EB، و قطعه‏ی بالایی (حاوی سلول‏های اپیدرمی بخش بالای فولیکول) (Upper Follicle) یا UF جداگانه به داخل ظرف های پلاستیکی 35 میلی­متری حاوی محیط کشت یکسان منتقل شدند (شکل 1). برای پرهیز از تکرار و ساده نمودن توصیحات از این به بعد از علامت اختصاری EB به جای سلول‏های اپیدرمی پایینی قاعده‏ی بولب  و از UF برای سلول‏های بالایی استفاده می‏گردد.

برای خارج کردن بافت اپیدرمی از UF، ابتدا با استفاده از سوزن سرنگ کپسول کلاژنی اطراف فولیکول به نرمی و آرامی پاره و جدا شد تا اینکه اجزا داخلی فولیکول که شامل یک مغز اپیدرمی و یک غلاف درمی (dermal sheath) ضخیم است آشکار گردند. این اجزا داخلی بعد از جدا شدن از کپسول کلاژنی به داخل پتری 5 میلی­متری حاوی 2 میلی لیتر محلول کلاژناز/دیسپیس (گیبکو، انگلستان) (50/50( با غلظت 1 میلی‏گرم بر میلی­لیتر منتقل شده و پتری مذکور به مدت 20 دقیقه در دمای 37 درجه سانتی‏گراد قرار گرفت. پس از گذشت این مدت غلاف درمی با کمک پنس‏های بسیار ریز از مغز اپیدرمی جدا گردید. مغز اپیدرمی باقیمانده بعد از آن به یک لوله‏ی مخروطی 30 میلی­لیتری برای تریپسینه شدن منتقل گردید.

به منظور جدا نمودن جزء اپیدرمی از EB، ابتدا با کمک یک پنس ظریف لبه‏ی کپسول کلاژنی اطراف بولب گرفته شده و با استفاده از پنس دیگر قاعده ی بولب بطرف بالا فشار داده شده تا به این کار محتویات داخل کپسول که در اینجا شامل پاپیلای درمی مرکزی و غلاف سلول های اپیدرمی ماتریکس هستند از کپسول خارج گردد. سپس با احتیاط و دقت زیاد سلول‏های اپیدرمی از پاییلای درمی جدا و برای تریپسینه شدن به  لوله‏ی مخروطی 30 میلی­لیتری منتقل شدند.

عمل تریپسینه کردن سلول‏های اپیدرمی با محلول 05/0 درصد تریپسین (گیبکو انگلستان) خام برای مدت 1 ساعت انجام گرفت. بعد از آن سوسپانسیون سلولی حاصله در دور rpm1800  و به مدت 3تا 5 دقیقه سانتریفوژ شد. توده ی سلولی موجود در انتهای لوله (پلت) سپس در محیط کشت مخصوص سلول های اپیدرمی مجددا به حالت سوسپانسیون درآمد. بعد از آن سلول ها شمارش شدند و به تعداد (104×4/2) در هر ظرف کشت و بدون استفاده از لایه ی تغذیه کننده (3T3 feeder layer)، قرار داده شدند. ظروف کشت سپس در داخل انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و شرایط 95 درصد اکسیژن و 5 درصد دی‏اکسید‏کربن قرار داده شدند.

محیط کشت مورد استفاده برای رشد سلول های اپیدرمی بر اساس روش رینولدز (33) تهیه شد. این محیط شامل محیط کشت عاری از کلسیم (گیبکو انگلستان) حاوی آنتی بیوتیک ها به همراه 20 درصد سرم گاوی جنینی (fetal calf serum) یا FCS، 5 میکرو گرم/میلی­لیتر ترنسفرین، 4/0 میکروگرم بر میلی­لیتر هیدروکورتیزون، 01/0 میکروگرم بر میلی­لیتر فاکتور رشد فیبروبلاست (EGF)، محلول 9-10مولار سم وبا (تماما فراهم شده از سیگما، انگلستان) و 140 میکروگرم بر میلی لیتر  عصاره‏ی هیپوفیزی جنین موش صحرایی بود (33).

در این تحقیق  تعداد 12 ظرف کشت از هر کدام از سلول‏های اپیدرمی EB و UF به روش فوق تهیه و در انکوباتور به مدت   4تا 8 روز بدون هیچ گونه تماسی گذاشته شد. بعد از این زمان ظروف مذکور از انکوباتور خارج و در زیر میکروسکوپ فاز کنتراست اینورت مورد مشاهده قرار گرفتند و در هر ظرف تعداد 5تا 7 کلنی انتخاب و با کمک قلم مخصوص نشانه گذاری شدند. بعد از آن ظروف کشت بطور مرتب در فواصل 2تا 3روز در زیر میکروسکوپ با عدسی × 10 مشاهده و با استفاده از یک گراتیکول مدرج نصب شده بر روی عدسی چشمی قطر کلنی­های علامت گذاری شده اندازه گیری گردید. کار اندازه­گیری تا زمانیکه محیط کلنی­ها بهم می­رسیدند ادامه می­یافت (این زمان بین 30 تا 80 روز در تغییر بود). بعد از این مرحله سلول‏ها بازکشت شده (پاساژ داده شده) و به فلاسک های 25سانتی متر مربع منتقل شدند.

 

 

 

شکل 1: نمایی شماتیک از چگونگی ایجاد برش در فولیکول های ویبریسا برای استفاده در کشت. (A) برش عرضی فولیکول ویبریسا و تبدیل آن به سه قطعه. یکی از برش ها درست در بالای بولب و دیگری درست زیر محل ورود عصب اصلی به فولیکول. (B) قطعه ی پائینی فولیکول یا قاعده ی بولب و بخش بالایی فولیکول برای کشت نگهداری شده و قطعه ی میانی دور انداخته شد. (C) بعد از برداشت مکانیکی کپسول کلاژن، غلاف درمی بخش بالایی فولیکول از غلاف خارجی ریشه بوسیله ی محلول کلاژناز/دیسپیس جدا گردید. در مورد قطعه یا بخش پایینی، بخش اپیدرمی از غلاف درمی و پاپیلای درمی با کمک پنسهای ظریفی جدا شد. اپی­تلیوم غلاف خارجی ریشه‏ی بخش بالایی فولیکول  و بخش اپیدرمی قاعده‏ی بولب سپس هر دو تریپسینه شدند تا سلول های منفرد ایجاد گردد و این سلول های منفرد سپس بطور مجزا در محیط کشت مخصوص سلول های اپیدرمی رشد داده شدند. EB]= قطعه‏ی پایینی فولیکول یا قاعده ی بولب، UF= بخش بالایی فولیکول، MF= قطعه‏ی میانی فولیکول، DS= غلاف درمی،DP= پاپیلای درمی، ORS= غلاف خارجی ریشه، C/D= محلول کلاژناز/دیسپیس، T=تریپسینه کردن، M= بخش اپیدرمی پایین فولیکول[.

 

 

برای مشاهده‏ی بهتر کلنی­ها، از هر یک از دو نمونه در مراحل مختلف چند ظرف کشت خارج و با محلول گیمسا (محلول 20 بار رقیق شده از محلول 8 در هزار ذخیره)  رنگ­آمیزی شدند. همچنین برای اینکه مشخص گردد عمل تقسیم سلولی در کدام ناحیه از کلنی­ انجام می‏گیرد در چند مورد کلنی­ها با برمودزکسی­یوریدین نشاندار (BrdU) نشانه‏گذاری شدند. برای این کار بعد از دور ریختن محیط کشت از روی کلنی­ها، 2 میلی‏لیتر MEM حاوی 10میکرومول بر لیتر BrdU (سیگما انگلستان) به ظروف کشت حاوی کلنی اضافه گردید و ظروف فوق برای مدت 1 ساعت در دمای37 درجه سانتی‏گراد    خوابانده شدند. بعد از این مدت محیط کشت حداقل (Minimum Essential Medium) یا MEM  حاوی BrdU  را از روی سلول‏ها دور ریخته و 2 میلی‏لیتر محیط MEM تازه به سلول‏ها اضافه شد. ظروف مذکور سپس به مدت 10تا 15 دقیقه مجددا در همان دما قرار گرفتند. بعد از آن محیط روی سلول ها خارج شده  و سلول‏ها برای مدت 30تا 45 دقیقه و در دمای 20- درجه سانتی‏گراد در اتانول 70 درصد (حاوی 50 میلی مول بر لیتر گلیسین، 2pH=) تثبیت شدند. سلول‏های نشاندار شده سپس با استفاده از میکروسکوپ فلورسنس    (Zeiss Axiovert 135) مورد مشاهده قرارگرفتند.

در مواردی تعدادی از ظروف کشت برای رنگ­آمیزی با قرمز روغنی O (oil red O) (سیگما، انگلستان) آماده شدند. برای این کار پس از اینکه سلول‏ها برای مدت 20 دقیقه با فرمالین نمکی 4درصد در دمای4 درجه سانتی‏گراد تثبیت شدند، آنها برای30 دقیقه در محلول اشباع شده‏ی قرمز روغنی O  که با ایزوپروپانول/آب (سه/ دو) تهیه شده بود قرار گرفتند. سلول‏ها سپس با ایزوپروپانول60 درصد شسته شده تا اینکه زمینه‏ی قرمز زدوده شود. متعاقبا سلولها با هماتوکسیلین مایر برای مدت زمان 5 دقیقه رنگ شدند. سپس سلولها با آب مقطر شسته و با کمک اتانول در چند مرحله آب‏گیری گردیدند. در نهایت سلول ها با چسب پوشاننده، پوشیده شدند. تمام مراحل این تحقیق با توجه به پروتکول­های تعریف شده و با رعایت موازین اخلاقی تایید شده برای کار روی حیوانات انجام گرفته است. 

 

 

نتایج

در این تحقیق 12 جفت (UF و EB) ظرف کشت از سلول‏های اپیدرمی تهیه و رفتار آنها در طول آزمایش مورد بررسی و مطالعه قرار گرفت. در هر دو سری از کشت‏ها سلول‏ها به بستـر ظرف

چسبیده و کلنی­هایی تولید نمودند.

مشاهده‏ی ظروف کشت بین 1 تا 3 روز بعد از شروع کشت نشان داد که فقط در حدود 1 درصد از سلول‏های UF به کف ظرف کشت چسبیده و در حال پهن شدن بودند. در روز چهارم، این سلول ها شروع به تکثیر کرده و کلنی­های کوچکی با حدود 20  سلول ایجاد نمودند (شکل A2). مشاهدات مشابهی که بر روی سلول های مشتق شده از  EB انجام گرفت مشخص کرد که در همین زمان (1 تا 3روز) تعداد بسیار کمتری (تقریباً 01/0درصد) به بستر خود چسبیدند، اما برخلاف سلول های UF بسیاری از این سلولها هنوز بر روی کف ظرف پهن نشده­ و ظاهر گردی را به نمایش می­گذاشتند (شکل B2). این پیشنهاد می‏کند که سرعت چسبندگی این سلول ها کمتر از همتایان خود در UF بودند. بررسی ظروف کشت EB چهار روز بعد از شروع کشت نمایان ساخت که بیشتر سلول های چسبیده دارای ظاهری پهن و کشیده بودند. تعداد کمی از این سلول ها پیشاپیش تقسیم سلولی نیز انجام داده در حالی که بسیاری از آنها هنوز بصورت سلول های واحد باقی مانده بودند (شکل C2). بعد از 7 روز، کشت های حاصله از UF دارای کلنی­های مشخصی بودند (شکل D2) در حالیکه در همین زمان سلول های EB حداکثر فقط چند تقسیم سلولی را پشت سرگذرانده بودند (شکل E2). بعد از 12تا 15روز در ظروف UF کلنی­هایی با ظاهر گرد و با سلول های متراکم، هم در مرکز و هم در پیرامون کلنی، دیده می­شدند (شکل F2). در همین زمان، در ظروف مشتق شده از ناحیه‏ی EB کلنی­های بسیار کوچکتر ولی با سلول های بسیار متراکم در مرکز و پیرامون وجود داشت (شکل G2). اختلاف سرعت رشد بین کلنی­های UF و UB با گذشت زمان نیز ادامه پیدا کرد، بطوری که در روز بیستم (شکل H2) کلنی­های ظروف UF بسیار بزرگ تر از همتایان خود در ظروف حاصل از EB بودند (شکل I2). با گذشت زمان، در هر دو نوع کشت نشانه­های تمایز نهایی مشاهده می­شد به‏طوری که که جمعی از کلنی­ها همچنان که سلول هایشان تمایز پیدا می کرد رشد خود را متوقف  نمودند (شکل J2 و K2). با این وجود، کلنی­های باقی ماتده در ظروف UF بازهم سریعتر از کلنی­های باقی مانده در کشت EB رشد می­نمودند بطوریکه 35 تا 45 روز پس از شروع کشت مرز خارجی کلنی­ها با یکدیگر تماس برقرار کرده و به هم ملحق می‏شدند. در مقایسه، عمل به هم رسیدن و الحاق کلنی­ها در ظروف مشتق شده از EB 70 تا 80 روز طول می­کشید.

 

 

شکل 2: مشاهدات میکروسکوپی تشکیل کلنی بوسیله‏ی سلول‏های اپیدرمی بخش بالایی فولیکول یا UF و بخش پائینی فولیکول یا قاعده ی بولب یا EB. تصاویر  A, D, F, H, J مربوط به کشت سلول های حاصل از بخش بالایی می­باشد که در مراحل زمانی مختلف تهیه شده است در حالی که تصاویر B, C, E, G, I, K مربوط به کشت سلول های حاصل از بخش پایینی می­باشد. طی چهار روز از گذشت بذرپاشی سلولهای بالایی تقسیم شده­ و کلنی­های کوچکی را تشکیل داده­اند، در حالی که سلول های پایینی سه روز (B) یا چهار روز (C) وقت نیاز داشتند تا پهن شده و شروع به تقسیم سلولی نمایند. متعاقبا، در روز هفتم کلنی­های سلول های بالایی بزرگتر از کلنی­های سلولهای پائینی بودند (D را با E مقایسه کنید). این وضعیت در روزهای 15-12 نیز دیده می­شد (شکلF حاصل از سلولهای پایینی را با شکل G حاصل از سلولهای بالایی مقایسه کنید). مقایسه ی کلنی­ها در روز بیستم نیز نشان داد که کلنی های حاصل از سلول های بالایی بزرگتر از سلول های پایینی بودند (شکل H و I). این مشاهدات نشان­دهنده ی رشد سریعتر سلول های بالایی نسبت به همتایان پایینی می­باشد. هر دو گروه از سلول ها کلنی­هایی نیز تولید کردند که در آنها سلولها بعد از چندی از رشد باز ایستاده و روند تمایزیافتگی را شروع کردند (شکلJ حاصل از سلول های پایینی و شکل K حاصل از سلول های بالایی است). خطوط نشانه: A/D/E/J/K برابر با 100 میکرومتر، B/C برابر با 50 میکرومتر، F/C برابر با 150 میکرومتر و H/I برابر با 200 میکرومتر.

 

 

 

اندازه­گیری قطر تک تک کلنی­ها در 8 جفت از ظروف کشت در طی یک زمان طولانی تفاوت بین کشت های UF و EB را تصدیق کرد. در حدود 90 درصد کلنی­های ظروف EB دارای طول عمر کوتاهی بوده و فقط برای 10 تا 15روز رشد می­کردند ولی درصد کمی از آنها قادر بودند تا 70 روز و حتی بیشتر نیز رشد کنند (شکل A3). از نظر رشد، کلنی­های UF در سه گروه قرار می­گرفتند؛ کلنی­های با طول عمر کوتاه، کلنی­های با طول عمر متوسط، و کلنی­های با طول عمر دراز (شکل B3). حدود 25تا 30 درصد کلنی­های UF عمر کوتاهی (10 تا 15روز) داشتند، کلنی­های با عمر متوسط که برای 25 تا 30 روز رشد می کردند حدود 30 تا 35 درصد از کلنی­ها را تشکیل می دادند ولی تقریبا 35 تا 40 درصد از کلنی­ها را کلنی‏های با عمر دراز تشکیل می­دادند که به‏طور پیوسته رشد می­کردند. مرز خارجی یا پیرامون این کلنی­ها همیشه صاف بود و عمدتا از سلول های کوچک، گرد و متراکم تتشکیل می­شدند.

همانطور که در بالا ذکر شد، کلنی­های EB نسبت به همتایان UF خود، رشدشان را دیرتر شروع کرده و آهسته­تر رشد می‏نمودند، اما آنها قادر بودند برای مدت درازی به این رشد آهسته‏ی خود ادامه دهند (شکل B3). 

 

 

 

شکل 3: ویژگی های رشد سلول های اپی­تلیال فولیکول. (A) نمودار روند رشد چهار کلنی مشتق شده از کلنی­های سلول های اپیدرمی پایینی را در یکی از ظروف کشت به عنوان نماینده نشان می‏دهد. سه کلنی رشد خود را حدود روز بیستم متوقف کردند، در حالی که یکی از کلنی­ها برای بیش از 70 روز به رشد خود ادامه داد. (B) نمودار روند رشد کلنی­های سلول های اپیدرمی بالایی را در یکی از ظروف کشت بعنوان نماینده نشان می­دهد. با نگاهی به نمودار A و B می توان چگونگی روند رشد کلنی­های با عمر دراز دو ظرف را با هم مقایسه کرد. کلنی­های حاصل از سلول های اپیدرمی بالای فولیکول با سرعت بیشتری نسبت به همتایان پایینی خود در محیط کشت رشد می­نمودند.

 

 

شکل 4: ویژگی‏های تکثیری سلول های اپیدرمی بالایی و پایینی فولیکول در محیط کشت. نشانه­گذاری BrdU سلول های کلنی­ها برای تشخیص تقسیمات میتوزی در آنها. اکثر BrdU در سلول های پیرامون کلنی دیده شده و به‏طور نسبی درصد سلول های نشاندار شده با BrdU در کلنی­های حاصل از سلول های بالایی (A) بیشتر از درصد نشاندار شدن کلنی­های حاصل از سلول های پایینی (B) بود. (C) ظروف رنگ­آمیزی شده با گیمسا که تعداد و اندازه ی کلنی­های اپیدرمی موجود در ظروف حاصل از بخش بالایی و بخش پایینی را نشان می دهد. (D) ظرف حاوی سلول های اپیدرمی متراکم وکانفلوئنت از بخش بالایی فولیکول. (E) ظرف حاوی سلول های متراکم و کانفلوئنت از بخش پایینی فولیکول. هر چند که در این دو ظرف (D و E) مورفولوژی سلول ها با هم مشابه است ولی سلول‏های پایینی برای رسیدن به حالت تراکم به زمان بسیار بیشتری نسبت به سلول های بالایی نیاز دارند. (F) سلول های واکوئوله­ای که در ظروف کشت حاصل از بخش بالایی در حالت رنگ نشده  با قرمز روغنی  O دیده می شوند. (G) تصویر سلول های واکوئوله حاصل از بخش بالایی فولیکول بعد از رنگ آمیزی با رنگ قرمز روغنی O. خطوط نشانه: A/B برابر با 50 میکرومتر، C برابر با 6 میلی­متر، D برابر با 140 میکرومتر، E برابر 70 میکرومتر، و F/G برابر با 60 میکرومتر. UF]= سلول های بخش بالایی فولیکول و EB= سلول های بخش پایینی فولیکول[.

 

آزمایشات BrdU که بعد از گذشت 25 تا 30روز از شروع کشت بر روی سلول‏ها صورت گرفت مشخص کرد که BrdU فقط در کلنی­های با سلول‏های متراکم یافت می­شود و در کلنی­های با عمر کوتاه دیده نمی­شود. کلنی­های UF (شکل A4) نسبت به کلنی­های EB (شکلB4) واجد تعداد بیشتری سلول‏های BrdU- مثبت بودند و این منعکس کننده‏ی تفاوت‏های مشاهده شده در سرعت رشد کلنی است. در هر دو مورد، کراتینوسیت‏های نشاندار شده با BrdU عمدتا به نواحی پیرامونی کلنی­ها محدود می­شدند و این ماده‏ی نشاندار بندرت در سلول‏های واقع در مرکز کلنی دیده می­شد.    

ظروف کشت حاصل از UF و EB این قابلیت را داشتند که بازکشت شوند و در ظروف جدید به تراکم نهایی یا کانفلوئنت برسند. اما زمان بازکشت برای کشت های UF، 30 تا 40 روز بعد از بذرپاشی بود در حالی که این کار برای کشت های EB حدود 70 روز طول می­کشید (شکلC4). در هر دو مورد، سلول ها حتی بعد از بازکشت شدن نیز از نظر سرعت تشکیل کلنی و سرعت رشد ویژگیهای منشا خود را منعکس می­کردند. سلولهای UF بازکشت شده قادر بودند در ظروف جدید طی 10تا 15دوباره به حد تراکم نهایی برسند (شکل D4)، در مقابل سلولهای بازکشت شده ی EB، 50 روز زمان نیاز داشتند تا بار دیگر به تراکم نهایی دست پیدا کنند (شکل E4). هر دو سری از کشت‏ها این قابلیت را داشتند که طی چند ماه برای چندین بار متوالی بازکشت شوند و هر بار در ظروف جدید به حد تراکم نهایی برسند. یکی از ویژگی های کشت های UF وجود سلول های واکوئوله بود (شکل F4) که با قرمز روغنی O (oil red O) رنگ می­گرفتند (شکل G4). چنین سلول هایی هرگز در کشت های EB مشاهده نشد (شکل نشان داده نشده است).

 

بحث

این تحقیق نشان داد که در فولیکول مو جمعیت کوچکی از سلول‏های اپیدرمی واقع در ماتریکس بولب دارای قابلیت تولید کلنی در محیط کشت بودند. اما علاوه بر این، تحقیق حاضر نشان داد که سلول های EB زمان بیشتری برای چسبیدن به بستر نیاز دارند و دیرتر تقسیمات خود را شروع کرده و سرعت رشد کلنی­های آنها نسبت به همتایانشان از UF آهسته­تر بود. تعدادی از کلنی­هایی EB دارای طول عمر درازی بودند و سلول‏های آنها این توانایی را داشتند که برای چندین بار بازکشت شوند، اما حتی بعد از باز کشت شدن نیز آنها همچون کشت اولیه سرعت تقسیمات پایین­تری نسبت به سلول‏های حاصله از UF از خود به نمایش گذاشتند. این نتایج چند سوال را در ذهن متبادر می­نماید: 1) ارتباط بین توانایی سلول‏های اپی­تلیال برای چسبیدن سریع به بستر و قابلیت کلنی­زایی سلول‏های بنیادی چیست؟ 2) آیا سلول های بنیادی در بولب وجود دارند؟ و 3) آیا طول فاز رشد چرخه ی فولیکول مو بوسیله‏ی ظرفیت تکثیر سلول‏های EB تعیین می‏شود؟

قابلیت کلنی­زایی سلول‏های اپیدرمی نواحی مختلف فولیکول در شرایط in vitro بوسیله‏ی تعدادی از محققین مورد مطالعه قرار گرفته است (27، 29، 34، 35 و36). اما در اینجا ما نشان دادیم که تمام انواع سلولی با قابلیت تزاید و تمایز متفاوت در داخل بولب وجود دارند، چنان‏که کلنی­های متفاوتی در کشت های حاصل از این ناحیه ایجاد شد. ما همچنین نمایان ساختیم که در میان این انواع سلولی، جمعیت کوچکی از سلول‏ها وجود داشتند که ظرفیت بالایی برای ایجاد کلنی از خود نشان می‏دادند و به نسبت از رشد آهسته­ای برخوردار بودند. یک احتمال این است که سلول‏هایی با قابلیت تکثیر محدود متعلق به قسمت های بالایی ماتریکس بوده­ باشند در حالی که سلول های با قابلیت کلنی­زایی بالا از ناحیه‏ی تحتانی بولب یا به‏عبارتی از ناحیه‏ی زاینده‏ی اپی­تلیومی یا GE که به پاپیلای درمی متصل است مشتق شده­ بودند. این فرضیه به‏وسیله ی این حقیقت تایید می‏شود که در مطالعات سایرین (27، 29، 31و 37) این  ناحیه‏ی از بولب از آزمایشات حذف می­شده چرا که این محققین از موی کنده شده از فولیکول برای کشت استفاده کرده­اند و این ناحیه (GE) در هنگام کندن مو به همراه آن  بیرون نمی­آید. اما محققینی که در آزمایشات آنها سلول‏های تحتانی بولب یا GE وجود داشته تصدیق کرده­اند که سلول‏های بولب می توانند تحت شرایط مناسب در محیط کشت کلنی تشکیل دهند (16، 28، 35 و 38). یک گروه از محققین که روی کلنی­زایی سلول‏های اپیدرمی نواحی مختلف فولیکول ویبریسا کار می‏کردند برای اولین بار گزارش داده­اند که 95 درصد از کل کلنی­های تشکیل شده از نواحی مختلف فولیکول مو از ناحیه‏ی "بالژ" مشتق شده و فقط کمتر از 5 درصد از کلنی­ها از سلول‏های ناحیه ی بولب بوجود می­آیند، ولی با این وجود کلنی­های مشتق شده از ناحیه‏ی بولب می‏توانند به دفعات متعدد بازکشت شوند (28). بعدها همین گروه نشان دادند که تعداد سلول های کلنی­زا در ناحیه ی بولب در مراحل مختلف چرخه‏ی فولیکولی متفاوت بودند (21). یکی از ویژگی‏های سلول‏های بنیادی، چند توانه بودن آنها است و در همین سال های اخیر محققین مشخص کرده­اند که سلول های بولب در صورت پیوند شدن به پشت موش های بدون تیموس می توانستند به تمام انواع سلول های پوستی و فولیکولی تمایز پیدا کنند (39).

یکی از جنبه­های سلول های بنیادی ظرفیت نامحدود آنها برای خود-نوسازی (self-renewal) و داشتن  چرخه‏ی سلولی آهسته در in vivo است. به‏طور کلی چنین تصور می­شود که سلول‏های کراتینوسیت بنیادی ویژگی‏های متفاوتی را در محیط کشت به نمایش می­گذارند، به این ترتیب که به سرعت به بستر خود چسبیده، از قدرت کلنی­زایی بالایی برخوردارند و به سرعت تکثیر می­شوند (23 و 40). اما نظر فوق که برای مدت مدیدی مورد قبول محققین بود اکنون بتدریج به چالش کشیده می­شود (41) و عملا پیشنهاد شده که اتصال سریع به کلاژن و کلنی‏زایی بالا ضرورتا ویژگی تکثیر بالا در in vitro یا قدرت نوسازی بیشتر در in vivo را به سلول ها اعطا نمی­کند (26). در حقیقت، نشان داده شده که کراتینوسیت­هایی که ویژگی چسبندگی و قدرت  کلنی­زایی کمتری دارند، در شرایط in vitro عمر طولانی داشته و از قابلیت نوسازی بهتری برخوردار می باشند (26). شاید جالب­ترین یافته‏ی این مطالعه این باشد که سلول های اپی­تلیال بولب که کلنی تشکیل می­دهند، از جمله آن‏هایی که دارای طول عمر بلند و با رشد آرام بودند، خیلی آهسته به بستر می­چسبیدند و میل زیادی برای شروع تقسیم از خود نشان نمی­دادند. در حقیقت، آهسته بودن این فرآیند چسبیدن و شروع تقسیم چنان بود که گاهی این احساس ایجاد می­شد که این سلول‏ها قرار نیست که رشد کنند چراکه تا دیر زمانی بصورت سلول‏های گرد و بی تغییر در کف ظرف دیده می­شوند. ولی هنگامی که ظروف کشت برای چند روز بعد مورد مشاهده واقع می­شدند مشخص می­شد که این سلول ها رشد را خود را آغاز کرده­اند. این موضوع جالب است چراکه به‏ نظر می­رسد تاییدی بر این ادعا است که سلول های بنیادی می­توانند در خارج از بدن رفتار متفاوتی از خود نشان دهند (26).

یکی از مشاهداتی که در این تحقیق صورت گرفت ولی در مطالعات قبلی (28) مورد توجه قرار نگرفته است سرعت رشد کلنی­ها است. برخلاف مطالعات قبلی، ما در این تحقیق از لایه‏ی تغذیه استفاده کننده نکردیم و دریافتیم که کلنی­های ناحیه‏ی بولب آهسته تر از کلنی­های UF رشد می‏کنند و این سرعت رشد آهسته در سرتاسر دوره‏ی کشت سلول‏ها در محیط کشت تداوم داشت. اگرچه ما نسبت سلول های تکثیر شونده را در کلنی­های مختلف مورد سنجش قرار ندادیم اما با روش ایمنوهیستوشیمی و با استفاده از BrdU نشان دادیم که در کلنی­های بولب در هر لحظه تعداد کمتری سلول در حال تکثیر نسبت به کلنی­های UF وجود دارد و این خود دوباره آهسته بودن فرآیند رشد در کلنی­های بولب را تایید می کرد. البته یک مطالعه‏ی جامع کمی از تکثیر سلولی لازم است در آینده مد نظر قرار گیرد اما یافته‏های ما پیشنهاد می کند که کلنی­های با رشد آهسته واجد سلول‏های شبه بنیادی بودند. این پیشنهاد با طبیعت سلول‏های بنیادی در شرایط in vivo نیز مطابقت دارد چراکه طبق تعریف سلول‏های بنیادی سلولهایی هستند که در  in vivo از چرخه‏ی تقسیم آهسته­ و طول عمر زیادی برخوردار هستند. این‏که در این تحقیق نشان داده شد حتی بعد از بازکشت نیز سلول‏های حاصل از UF نسبت به سلول های EB رشد بیشتری دارند منعکس کننده‏ی تفاوت های ذاتی است که بین این دو جمعیت از سلول‏ها وجود دارد. مشاهده‏ی سلول‏های لیپیددار در کشت‏های UF و عدم وجود آنها در نمونه­ های EB تاییدی بر نتیجه­گیری فوق می­باشد. ناحیه‏ی UF واجد غدد چربی است و لذا این سلول ها، سلول‏های اجدادی هستند که در حال پشت سرگذراندن روند تمایز به سلول‏های چربی (sebocyte) می‏باشند.

در این مطالعه پس از مدتی ادامه‏ی اندازه­گیری قطر کلنی­های با رشد آهسته‏ی بولب غیرممکن می­شد چراکه کلنی­ها بهم متصل و در هم ادغام می­شدند. ولی از آنجا که ما بعضی از ظروف کشت را 80 روز پس از بذرپاشی بازکشت کردیم این به‏طور قطعی نشان می دهد که این سلول ها حداقل قادرند برای مدت 80 روز در محیط کشت رشد و تکثیر یابند. حتی اگر بپذیریم که قدرت تکثیر این سلول ها فقط 80 روز است این مدت باز هم از طول فاز رشد فولیکول های ویبریسا که در حدود 60 روز است (42) بیشتر می­باشد.

 

نتیجه­گیری

با توجه به نتایج حاصل از این مطالعه ما معتقدیم که جمعیت کوچکی از کلنی­های با عمر دراز حاصل از بولب دارای ظرفیت تکثیر بیشتر از آن چیزی هستند که برای سلول‏های "تقسیم شونده‏ی موقتی" (TA) تعریف شده است. نتایج حاصل از این مطالعه به همراه اطلاعات ارائه شده توسط اوشیما و همکاران (21) پیشنهاد می‏کند که حداقل در مورد فولیکول‏های ویبریسا، طول فاز رشد فولیکول به‏وسیله ی قابلیت تکثیر سلول‏های موجود در ماتریکس بولب محدود و تعیین نمی­شود و این‏که از دست رفتن ظرفیت تکثیری دلیل توقف فاز رشد در فولیکول‏های ویبریسا نیست. به عبارتی سلول‏های اپیدرمی موجود در انتهای قاعده­ای فولیکول (EB) سلول‏های TA نیستند بلکه ویژگی های را نشان می‏دهند که بیشتر شبیه سلول‏های بنیادی است.  

1. Chase HB. Growth of the hair. Physiol Rev, 1954; 34(1): 113-126.

2. Nowak JA, Polak L, Pasolli HA, Fuchs E. Hair follicle stem cells are specified and function in early skin morphogenesis. Cell Stem Cell. 2008; 3(1): 33-43.

3. Sun TT, Cotsarelis G, Lavker RM. Hair follicular stem cells: the bulge activation hypothesis. J Invest Dermatol. 1991; 96(5): 77S-78S.

4. Cotsarelis G, Sun TT, Lavker RM. Label-retaining cells reside in the bulge area of pilosebaceous unit: implications for follicular stem cells, hair cycle, and skin carcinogenesis. Cell. 1990; 61(7):1329-1337.

5. Lavker RM, Cotsarelis G, Wei ZG, Sun TT. Stem cells of pelage, vibrissae, and eyelash follicles: the hair cycle and tumor formation. Ann N Y Acad Sci. 1991; 642: 214-224.

6. Liu Y, Lyle S, Yang Z, Cotsarelis G. Keratin 15 promoter targets putative epithelial stem cells in the hair follicle bulge. J Invest Dermatol. 2003; 121(5): 963-968.

7. Cotsarelis G, Kaur P, Dhouailly D, Hengge U, et al. Epithelial stem cells in the skin: definition, markers, localization and functions. Exp Dermatol. 1999; 8(1): 80-88.

8. Li A, Simmons PJ, Kaur P. Identification and isolation of candidate human keratinocyte stem cells based on cell surface phenotype. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998; 95(7): 3902-3907.

9. Lyle S, Christofidou-Solomidou M, Liu Y, Elder DE, et al. The C8/144B monoclonal antibody recognizes cytokeratin 15 and defines the location of human hair follicle stem cells. J Cell Sci. 1998; 111 (21):  3179-3188.

10. Ohyama M, Terunuma A, Tock CL, Radonovich MF, et al. Characterization and isolation of stem cellenriched human hair follicle bulge cells. J Clin Invest. 2006; 116(1): 249-260.

11. Morris RJ, Liu YL, Marles Z, Yang C, et al. Capturing and profiling adult hair follicle stem cells. Nat Biotechnol. 2004; 22(4): 411-417.

12. Blanpain C, Lowry WE, Geoghegan A, Polak L, et al. Self renewal, multipotency, and the existence of two cell populations within an epithelial stem cell niche. Cell. 2004; 118(5): 635-648.

13. Taylor G, Lehrer MS, Jensen PJ, Sun TT, et al. Involvement of follicular stem cells in forming not only the follicle but also the epidermis. Cell, 2000; 102(4): 451-461.

14. Amoh Y, Li L, Katsuoka K, Penman S, et al. Multipotent nestin-positive, keratin-negative hair-follicle bulge stem cells can form neurons. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(15): 5530-5534.

15. Panteleyev AA, Jahoda CA, Christiano AM. Hair follicle predetermination. J Cell Sci. 2001; 114(19): 3419-3431.

16. Reynolds AJ, Jahoda CA. Hair follicle stem cells? A distinct germinative epidermal cell population is activated in vitro by the presence of hair dermal papilla cells. J Cell Sci. 1991; 99 (2): 373-385.

17. Legue E, Nicolas JF. Hair follicle renewal: organization of stem cells in the matrix and the role of stereotyped lineages and behaviors. Development. 2005; 132(18): 4143-4154.

18. Paus R, Muller-Rover S, Botchkarev VA. Chronobiology of the hair follicle: hunting the "hair cycle clock". J Investig Dermatol Symp Proc. 1999; 4(3): 338-45.

19. Lavker RM, Miller S, Wilson C, Cotsarelis G, et al. Hair follicle stem cells: their location, role in hair cycle, and involvement in skin tumor formation. J Invest Dermatol. 1993; 101(1): 16S-26S.

20. Hanakawa Y, Li H, Lin C. Stanley JR, Cotsarelis G. Desmogleins 1 and 3 in the companion layer anchor mouse anagen hair to the follicle. J Invest Dermatol. 2004; 123(5): 817-822.

21. Oshima H, Rochat A, Kedzia C, Kobayashi K, et al. Morphogenesis and renewal of hair follicles from adult multipotent stem cells. Cell. 2001; 104(2): 233-45.

22. Hsu YC, Pasolli HA, Fuchs E. Dynamics between stem cells, niche, and progeny in the hair follicle. Cell. 2011; 144(1): 92-105.

23. Dunnwald M, Tomanek-Chalkley A, Alexandrunas D, Fishbaugh J, et al. Isolating a pure population of epidermal stem cells for use in tissue engineering. Exp Dermatol. 2001; 10(1): 45-54.

24. Bickenbach JR, Chism E. Selection and extended growth of murine epidermal stem cells in culture. Exp Cell Res. 1998; 244(1): 184-195.


25. Kaur P, Li A. Adhesive properties of human basal epidermal cells: an analysis of keratinocyte stem cells, transit amplifying cells, and postmitotic differentiating cells. J Invest Dermatol. 2000; 114(3): 413-420.

26. Strachan LR, Scalapino KJ, Lawrence HJ, Ghadially R. Rapid adhesion to collagen isolates murine keratinocytes with limited long-term repopulating ability in vivo despite high clonogenicity in vitro. Stem Cells. 2008; 26(1): 235-243.

27. Moll I. Proliferative potential of different keratinocytes of plucked human hair follicles. J Invest Dermatol. 1995; 105(1): 14-21.

28. Kobayashi K, Rochat A, Barrandon Y. Segregation of keratinocyte colony-forming cells in the bulge of the rat vibrissa. Proc Natl Acad Sci U S A. 1993; 90(15): 7391-7395.

29. Moll I. Differential epithelial outgrowth of plucked and microdissected human hair follicles in explant culture. Arch Dermatol Res. 1996; 288(10): 604-610.

30. Limat A, Noser FK. Serial cultivation of single keratinocytes from the outer root sheath of human scalp hair follicles. J Invest Dermatol. 1986; 87(4): 485-488.

31. Jones LN, Fowler KJ, Marshall RC, Ackland ML. Studies of developing human hair shaft cells in vitro. J Invest Dermatol. 1988; 90(1): 58-64.

32. Gharzi A, Abbasi M, Jahoda CAB. [Study of expression of α-SMA in dermal cells of skin appendages by immunohistochemistry]. Journal of Cell &Tissue. 2011; 1(2): 65-74. (persian).

33. Reynolds AJ. In vivo and in vitro studies of isolated and interacting dermal and epidermal components of the integument, in Department of Biological Sciences. 1989; University of Dundee.

34. Yang JS, Lavker RM, Sun TT. Upper human hair follicle contains a subpopulation of keratinocytes with superior in vitro proliferative potential. J Invest Dermatol. 1993; 101(5): 652-629.

35. Rochat A, Kobayashi K, Barrandon Y. Location of stem cells of human hair follicles by clonal analysis. Cell. 1994; 76(6): 1063-1073.

36. Roh C, Tao Q, Photopoulos C, Lyle S. In vitro differences between keratinocyte stem cells and transit-amplifying cells of the human hair follicle. J Invest Dermatol. 2005; 125(6): 1099-1105.

37. Wells J, Sieber VK. Morphological characteristics of cells derived from plucked human hair in vitro. Br J Dermatol. 1985; 113(6): 669-675.

38. Detmar M, Schaart FM, Blume U, Orfanos CE. Culture of hair matrix and follicular keratinocytes. J Invest Dermatol. 1993; 101(1): 130S-134S.

39. Claudinot S, Nicolas M, Oshima H, Rochat A, et al. Longterm renewal of hair follicles from clonogenic multipotent stem cells. Proc Natl Acad Sci USA. 2005; 102(41): 14677-14682.

40. Barrandon Y, Green H. Three clonal types of keratinocyte with different capacities for multiplication. Proc Natl Acad Sci USA. 1987; 84(8): 2302-2306.

41. Kaur P, Li A, Redvers R, Bertoncello I. Keratinocyte stem cell assays: an evolving science. J Investig Dermatol Symp Proc. 2004; 9(3): 238-247.

42. Ibrahim L, Wright EA. The growth of rats and mice vibrissae under normal and some abnormal conditions. J Embryol Exp Morphol. 1975; 33(4): 831-844.