اثر پراکسید هیدروژن و ملاتونین بر بلوغ هسته ای اووسیت در شرایط برون تنی

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر غلظت های مختلف ملاتونین در کاهش تنش اکسیداتیو ناشی از هیدروژن پراکسید بر بلوغ هسته ای اووسیت های نابالغ گوسفند بود. مواد و روش ها: تخمدان ها از کشتارگاه جمع آوری و استحصال اووسیت به روش استاندارد انجام گرفت، کشت اووسیت ها در الف: TCM199 به علاوه 10 درصد FBS، 5 میکروگرم در میلی لیتر FSH، 0.01 واحد بین المللی در میلی لیتر LH، 100 واحد بین المللی در میلی لیتر پنی سیلین و 100 واحد بین المللی در میلی لیتر استرپتومایسین، ب: الف + H2O2 300 میکرومولار با دمای 38.5 درجه سانتی گراد، پ: ب + 1 میکرومولار ملاتونین و ت: ب+ 10 میکرومولار ملاتونین انجام شد. نتایج: این مطالعه نشان داد که H2O2، بلوغ هسته ای را بطور معنی داری (Pنتیجه گیری: نتایج این مطالعه نشان داد که ملاتونین هنگام تنش اکسیداتیو بلوغ آزمایشگاهی اووسیت های گوسفند را بهبود می بخشد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

عوامل مختلفی در محیط کشت مانند تعادل تغذیه‏ای و هورمونی و همچنین تنش‏های متنوع مثل اکسیداتیو، گرما و ... در بلوغ آزمایشگاهی تخمک اثرگذار می‏باشند (1). کشت تخمک در محیط آزمایشگاهی به دلیل تغییر در شرایط رشد مانند افزایش نور، اکسیژن، غلظت بالای متابولیت‏ها و سوبستراها سبب افزایش تولید رادیکال‏های آزاد در طول مدت زمان متابولیسم هوازی تخمک می‏شوند و در نتیجه تنش اکسیداتیو افزایش می‏یابد. رادیکال‏های آزاد، اتم‏ها یا مولکول‏هایی هستند که به سبب دارا بودن یک یا چند الکترون جفت نشده، از فعالیت زیادی برخوردارند و به دلیل داشتن تک الکترون، هنگام گردش خون، می‏توانند به ماکرومولکول‏های حیاتی مانند لیپیدها، پروتئین‏ها،DNA جانداران و کربوهیدرات‏ها متصل شده و آسیب جبران ناپذیری وارد کنند (2).

ROS(Reactive Oxygen Species) شامل هیدروژن پراکساید، یون اکسیژن و هیدروکسیل رادیکال می‏باشد (3) که افزایش غلظت مولکول‏های ROS در محیط کشت سبب تنش اکسیداتیو شده و به غشای سلول و DNA آسیب زده و از طرفی سبب آپوپتوزیس خواهد شد (4). رادیکال‏های آزاد سبب از کارافتادن میتوکندری‏ها، آسیب DNA و RNA و پروتئین ها می شود (5). کاهش غلظت مولکول‏های ROS در محیط کشت جهت بلوغ تخمک ضروری می‏باشد (6). سلول‏های کومولوس با فعالیت آنتی اکسیدانتی خود به کمک گلوتاتیون پراکسیداز و کاتالاز سبب خنثی شدن آسیب‏های ناشی از تنش اکسیداسیون می‏شوند (7).

یکی از راه‏های کاهش تنش اکسیداتیو در محیط کشت آزمایشگاهی بلوغ تخمک، استفاده از آنتی اکسیدانت‏ها می‏باشد. ملاتونین، مهم‏ترین هورمون غده صنوبری، در ابتدا به عنوان هورمون موثر در فیزیولوژی تولید مثل، در حیوان‏هایی که تولید مثل فصلی داشتند شناسایی شد. اخیرا گزارش شده است که ملاتونین بطور مستقیم رادیکال‏های آزاد را از بین می‏برد و بطور غیر مستقیم نیز با تحریک آنزیم‏های آنتی اکسیدانت، در از بین بردن رادیکال‏های پراکسید هیدروژن دو برابر قوی تر از ویتامین E عمل می‌کند (8). ملاتونین در برخی مواقع ممکن است سبب ترمیم برخی از مولکول‏هایی که اکسیده شده شود (9). بطور کلی ملاتونین بیوانرژتیک سلول را بهبود بخشیده، مکانیسم‏های ترمیم کننده ژنوم میتوکندری را فعال کرده و تولید ATP را افزایش می‏دهد (10). از طرف دیگر ملاتونین لیپید را در غشا، پروتئین را در سیتوزول وDNA  را در هسته از آسیب رادیکال‏های آزاد حمایت می‏کند (11). ملاتونین از طریق افزایش آنزیم‏های اصلی آنتی اکسیدانت مانند گلوتاتیون ردوکتاز، گلوکز 6 فسفات دهیدروژناز سبب کاهش رادیکال‏های آزاد یا ROS می‏شود و همچنین مولکول‏های مخالف تنش اکسیداتیو را افزایش می‏دهد. برخی از اثرات ملاتونین از طریق غشا میانجی‏گری می‏شود و احتمالا گیرنده‏های غشایی و هسته ای در تسهیل اثرات آنتی اکسیدانتی ملاتونین درگیر می‏باشند بطوری که ملاتونین به راحتی از غشاهای بیولوژیک وارد سلول شده و تاثیر می‏گذارد (12). پیشنهاد شده است که بافت‏های حساس مانند تخمدان، بیضه، مغز استخوان و لوله‏های گوارشی که در معرض تنش‏های اکسیداتیو قرار دارند می‏توانند به سرعت ملاتونین تولید نمایند (13).

با تفاسیر به عمل آمده می‏توان انتظار داشت که ملاتونین هنگام تنش اکسیداتیو، اووسیت را از گامه‏ی بلوغ تا تبدیل شدن آن به رویان قابل انتقال، از تنش اکسیداتیو حفظ نموده و قابلیت رشد و نمو آن را بهبود بخشد. هدف از این مطالعه بررسی اثر غلظت‏های مختلف ملاتونین در کاهش تنش اکسیداتیو ناشی از هیدروژن پراکسید بر بلوغ هسته‏ای اووسیت‏های نابالغ گوسفند بود.

 

مواد و روش‌ها

به منظور تهیه اووسیت‏های گوسفندی، تخمدان‏ها بلافاصله پس از کشتار از لاشه دام جدا و در درون فلاسک حاوی سرم فیزیولوژی 9/0 درصد  نرمال به همراه 100 واحد بین‏المللی پنی سیلین و 100 واحد بین‏المللی استرپتومایسین در هر میلی لیتر و در دمای       34-30 درجه سانتی‏گراد در مدت کمتر از یک ساعت به آزمایشگاه منتقل شد. کمپلکس‏های کومولوس- اووسیت               (Cumulus – Oocyte Complexes)  با روش آسپیره کردن از فولیکول‏های آنترال با قطر 6-2 میلی متر با استفاده از سوزن      20 گرم که به دستگاه مکش متصل بود انجام شد. سپس COC ها  در محیط کشت H-TCM199+10 درصد FBS، 50 میکرو لیتر هپارین، 100 واحد بین المللی در میلی‏لیتر پنی سیلین و 100 واحد

 بین المللی در میلی لیتر استرپتومایسین بود جمع آوری شد. پس از ارزیابی، فقط COC هایی که دارای سیتوپلاسم یکنواخت با سلول‏های پوشیده از کومولوس بود انتخاب شد و پس از 4 بار شستشو در محیط بدون هپارین، در قطره های 50 میکرولیتری از محیط کشت بلوغ در گروه‏های 10-8 تایی قرار داده شد و روی آن‏ها با روغن معدنی پوشانده شد. سپس درون انکوباتوری که دمای آن 5/38 درجه سانتی‏گراد بوده و دارای 5 درصد گازکربنیک و هوای بسیار مرطوب بود به مدت 27 ساعت بالغ شدند. محیط بلوغ آزمایشگاهیTCM199 +10 درصد FBS، 5 میکرو گرم در میلی‏لیترFSH ، 01/0 واحد بین المللی در میلی لیتر  LH، 100 واحد بین المللی در میلی‏لیتر پنی سیلین و 100 واحد بین المللی در میلی‏لیتر استرپتومایسین بود. گروه‏های آزمایشی نیز به این صورت بود: گروه1: تنش اکسیداتیو (H2O2، 300 میکرومولار) ، گروه2: تنش اکسیداتیو + 1 میکرومولار ملاتونین، گروه3: تنش اکسیداتیو +10 میکرومولار ملاتونین، گروه4: کنترل.

برای ارزیابی مرحله بلوغ هسته‏ای، بعد از بلوغ، اووسیت‏ها با اسید استیک و اتانول به نسبت 1 به 3 بر روی اسلاید فیکس و با  اورسئین 1 درصد رنگ آمیزی شد و سپس برای ارزیابی کروموزم‏های متافاز میوز-2، از میکروسکوپ اینورت با بزرگ نمایی X 400 استفاده شد. داده‏های بدست آمده پس از ارزیابی بلوغ هسته‏ای، با آزمون کای اسکوار  و با استفاده از رویه GENMOD در برنامه 1/9SAS  مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

 

نتایج

اثر تنش اکسیداتیو و غلظت‏های مختلف ملاتونین بر بلوغ هسته‏ای اووسیت‏های نابالغ گوسفند، پس از 27 ساعت کشت در جدول و شکل 1 نشان داده شده است.

در این مطالعه 447 تخمک نابالغ و سالم از تخمدان‏های کشتارگاهی گوسفندان جمع آوری گردید و در سه گروه آزمایشی و گروه شاهد ارزیابی شدند. در گروه شاهد از 139 تخمک نابالغ که به مدت 27 ساعت در انکوباتور کشت شد 57/98 درصد از تخمک های نابالغ از سرگیری تقسیم میوز مشاهده شد. در حالیکه در 43/1 درصد تخمک‏ها، پس از کشت هیچگونه علائمی از آغاز میوز رویت نشد که از نظر آماری نسبت به گروه‏های آزمایشی یک، دو و سه دارای اختلاف معنی‏داری بود (05/0P<). از بین این میزان 47/6 درصد هسته شکسته شده بود(GVBD)  و 19/7 درصد در مرحله بین بلوغ و هسته شکسته‏ها قرار داشت و 9/84 درصد تخمک‏ها تا مرحله متافاز 2 پیشرفته و به مرحله بلوغ رسیده بودند.

 

 

 

 

 

GV                                    GVBD

 

                                                              مرحله متافاز2                                         Intermediate

شکل 1: GV مرحله ایست که پس از طی مدت زمان کشت هیچگونه تغییری درهسته آن دیده نمی شود. مرحله GVBD که در این حالت غشای اطراف هسته شکسته شده است ولی به مرحله بلوغ نهایی نرسیده است.  Intermediateمرحله ای است مابین هسته شکسته و بلوغ کامل و مرحله متافاز دو زمانی است که بلوغ اووسیت رخ داده و جسم قطبی در آن قابل مشاهده است.

 

جدول 1: اثر تنش  اکسیداتیو و غلظت های مختلف ملاتونین بر بلوغ هسته ای اووسیت های نابالغ گوسفند، پس از 27 ساعت کشت

گروهها

اووسیت

نابالغ

H2O2
(میکرو مولار)

ملاتونین

(میکرو مولار)

GV

GVBD

Intermediate

M-II

شاهد

139

0

0

2(1/0±43/71)a

9(6/0±47/34)a

10(7/0±19/33)a

118(84/0±9/24)a

تیمار1

102

300

0

55(53/0±94/2)c

20(19/0±6/25)b

12(11/0±76/21)a

15(14/0±7/28)c

تیمار2

97

300

1

6(6/0±2/42)ab

9(9/0±27/35)a

40(41/0±24/21)b

42(43/0±29/2)b

تیمار3

109

300

10

7(6/42 0±/39)b

11(10/0±09/32)ab

32(29/0±36/21)b

59(54/0±12/19)b

 

a،b،c: اختلاف معنی­داری بین تیمارها را در هر ستون در سطح 5 درصد (05/0=α) نشان می­دهد. GV: اووسیت­هایی که در مرحله کیسه‌ی زاینده هستند. GVBD: اووسیت­هایی که در مرحله‌ی ناپدید شدن کیسه‌ی زاینده هستند. Intermediate: اووسیت ­هایی که در مرحله‌ی بین  GVBDو  M-II مانده­اند و M-II: اووسیت­هایی که در مرحله‌ی متافاز-2 قرار دارند. نتایج به صورت Means±S.E در داخل پرانتز گزارش شده است.

 

 

 


میزان بلوغ در گروه شاهد نسبت به تیمارهای یک، دو و سه از نظر آماری دارای اختلاف معنی داری می‏باشد (05/0P<).

در گروه آزمایشی اول 102 تخمک نارس سالم کشت شد که پس از گذشت 27 ساعت در 94/53 درصد از تخمک ها هیچ تغییری مشاهده نشد و از سرگیری میوز در 06/46 درصد از تخمک‏های نابالغ رویت گردید که 6/19 درصد آنها هسته شکسته بود و 76/11 درصد در مرحله بین هسته شکسته و بالغ (مرحله میانی) متوقف شده بودند همچنین 7/14 درصد به مرحله متافاز 2 رسیده و بالغ شده بودند که از نظر آماری با تیمارهای دو، سه و گروه شاهد دارای اختلاف معنی‏داری بود (05/0P<) .

در گروه آزمایشی دوم از 97 تخمک نارس سالم کشت شده،  پس از گذشت 27 ساعت 2/6 درصد در مرحله نابالغ متوقف شده بودند و از سرگیری میوز در 08/93 درصد از تخمک‏های نابالغ رویت گردید که 27/9 درصد آنها هسته شکسته بود و 24/41 درصد در مرحله بین هسته شکسته و بالغ متوقف شده بودند. همچنین 29/43 درصد به مرحله متافاز 2 رسیده و بالغ شده بودند که از نظر آماری با تیمارهای یک و گروه شاهد دارای اختلاف معنی‏داری بود (05/0P<) و با تیمار سه دارای اختلاف معنی‏داری نداشت.

در گروه آزمایشی سوم 109 تخمک نارس سالم کشت شد. پس از گذشت 27 ساعت 42/6 درصد در مرحله نابالغ متوقف شده بودند و از سرگیری میوز در 58/93 درصد از تخمک‏های نابالغ رویت گردید که 09/10 درصد آنها هسته شکسته بود و 36/29 درصد در مرحله میانی متوقف شده بودند همچنین 12/54 درصد به مرحله متافاز 2 رسیده و بالغ شده که از نظر آماری با تیمارهای یک و گروه شاهد دارای اختلاف معنی‏داری بود (05/0P<) و با تیمار دو دارای اختلاف معنی‏داری نداشت.

تنش اکسیداتیو پس از 27 ساعت کشت، بلوغ هسته‏ای اووسیت‏های گوسفند را بطور معنی داری (05/0P<) نسبت به گروه کنترل کاهش داد (7/14در مقابل 9/84). غلظت ملاتونین در سطوح 1 و 10 میکرومولار توانست هنگام تنش اکسیداتیو بلوغ میوزی اووسیت‏های گوسفندی را بطور معنی‏داری بهبود بخشد (به ترتیب 7/14در مقابل 29/43 و 12/54) و میزان اووسیت‏هایی را که به مرحله متافاز-2 می‏رسند را افزایش دهد (05/0P<). اما با افزایش غلظت ملاتونین از 1 به 10 میکرو مولار میزان بلوغ اووسیت تغییر نیافت. علی‌رغم پیشرفت‏های زیاد در تکنولوژی تولید مثلی، کاهش کیفیت اووسیت به عنوان یک مشکل در ناباروری حیوانات ماده باقی مانده است.

 

بحث

ROS بویژهH2O2 ، در طول فرایند تخمک‌ریزی در داخل فولیکول تولید می‌شود. استفاده از پراکسید هیدروژن به میزان 100 میکرو مولار، موجب مرگ سلولی  اووسیت‌های همستر و تخمک موش در محیط کشت in vitro شد )14 و 15.( غلظت داخل فولیکولی ملاتونین در فولیکول‌های بالغ نسبت به فولیکول‏های کوچک آترزیی شده بیشتر است که در فولیکول‌های پیش از تخمک‌ریزی تقریبا 3 برابر بیشتر از سطح سرمی آن است. ملاتونین به عنوان یک آنتی اکسیدانت نقش اساسی در حمایت از اووسیت در مقابل ROS دارد. ملاتونین آسیب DNA و پروتئین میتوکندری‌ها را کاهش می‌دهد و فعالیت زنجیره انتقال الکترون را بهبود می‌بخشد. ملاتونین ممکن است بطور مستقیم از آسیب به میتوکندری در اووسیت جلوگیری کند که منجر به بهبود کیفیت اووسیت می‌شود (16). نتایج این مطالعه اثرات مضر H2O2 را روی بلوغ اووسیت گوسفند تایید کرد و ملاتونین اثرات مضرH2O2 را خنثی می‏کند که با یافته‌های تامورا و همکارانش (16) مطابقت داشت.

تخمک بالغ پستانداران در مرحله متافاز IIآزاد می‏شود و تا زمان ورود اسپرم به داخل تخمک تحرکات لازم برای رهایی از این توقف و آزادسازی جسم قطبی به عنوان ادامه میوز صورت می‏پذیرد. در این مطالعه مشخص شد که ملاتونین با غلظت1 و 10 میکرومولار بلوغ آزمایشگاهی و از سرگیری میوز را در تخمک‏های نارس گوسفند افزایش می‏دهد؛ به این ترتیب که میزان بلوغ آزمایشگاهی در گروه های آزمایشی دو و سه نسبت  به گروه یک که فاقد این ماده هستند، افزایش قابل توجهی را نشان داد.

ملاتونین نقش مهمی را در حفاظت سلول از آسیب اکسیداتیو دارد که بواسطه افزایش آنزیم‏های مانند گلوتاتیون ردوکتاز، گلوکز 6 فسفات دهیدروژناز میزان رادیکال‏های آزاد یا ROS را کاهش می‏دهد.

احتمالا ملاتونین از عوامل کلیدی موثر در کاهش پراکسیدهای داخل سلولی است. در این مطالعه نیز مشخص شد که اضافه کردن ملاتونین به عنوان یک آنتی اکسیدانت به محیط کشت بلوغ تخمک‏های نارس گوسفند، بلوغ آزمایشگاهی و از سرگیری میوز افزایش یافت و با افزایش غلظت ملاتونین در محیط کشت اثرات منفی تنش اکسیداتیو کاهش یافت.

ملاتونین بر فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانت وآنزیم‏های سطوح سلولی تاثیر می‏گذارد از طرفی ممکن است ملاتونین با تاثیر مستقیم از وارد شدن آسیب به میتوکندری تخمک‏ها ممانعت نماید و سبب افزایش کیفیت تخمک گردد (17) که از اثرات ضد آپوپتوزی ملاتونین بر انواع سلول‏های مختلف ناشی می‏شود  (18 و 19).

 برخی مطالعات نشان داده‏اند که ملاتونین نرخ زنده مانی جنین و میزان باروری آزمایشگاهی را افزایش دهد (20). ملاتونین، فعالیت تخمدان و فولیکول سازی را توسعه می‏دهد (21) متابولیت‏های ملاتونین، رادیکالهای آزاد را حذف می‏کنند و در افزایش تولید برخی از آنزیم آنتی اکسیدانتی نقش فراوانی ایفا می‏نماید (22).

نتایج این مطالعه نشان داد که تیمار محیط کشت با ملاتونین میزان بلوغ را در مقایسه با گروه شاهد افزایش می‏دهد که با نتایج وازکوز و همکاران (22) تاثیر مثبت ملاتونین بر بلوغ تخمک‏های گوسفند را گزارش نمودند مطابقت می‏نماید.

 

نتیجه گیری

بطور کلی این پژوهش نشان داد که تنش اکسیداتیو سبب اثرات سمی در بلوغ آزمایشگاهی اووسیت شده و جنبه ممانعت کنندگی در بلوغ اووسیت دارد. از طرفی ملاتونین بلوغ آزمایشگاهی اووسیت‏های نابالغ گوسفند را هنگام تنش اکسیداتیو  بهبود می‏بخشد. بهبود بلوغ آزمایشگاهی اووسیت‏های گوسفند هنگام تنش اکسیداتیو در این پژوهش را شاید بتوان به اثرات مفید و چندگانه ملاتونین ارتباط داد.

1. Abedelahi M, Salehnia A, Allameh A, Davoodi D. Sodium selenite improves the in vitro follicular development by reducing the reactive oxygen species level and increasing the total antioxidant capacity and glutathione peroxide Activity. Human Reproduction. 2010; 25(4): 977–985.

2. Hallwell B, Gutteridge JMC. The antioxidants of human extracellular fluids. Arch. Biochem. Biophys. 1990; 280,1-3.

3. Jung-Taek K, Ok-Jae K, Dae-Kee K, Hee-Jung P, et al. Effects of melatonin on in vitro maturation of porcine oocyte and expression of melatonin receptor RNA in cumulus and granulosa cells J. Pineal Res. 2009; 46: 22–28.

4. Bedaiwy MA, Falcone T, Mohamed MS, Aleem AA, et al. Differential growth of human embryos in vitro: role of reactive oxygen species. Fertil Steril 2004; 82: 593–600.

5. Peter CKL, Adashi Ey, The Ovary Second Edition Elsevier Inc. 2004; 113-130.

6. Morado SA, Cetica PD, Beconi MT, Dalvit GC. Reactive oxygen species in bovine oocyte maturation in vitro. Reprod Fertil Dev. 2009; 21: 608–614.

7. Combelles CM, Gupta S, Agarwal A. Could oxidative stress influence the in-vitro maturation of oocytes? Reprod Biomed Online. 2009; 18: 864–880.

8. Pieri C, Marra M, Moroni R, Recchioni. M, et al. Melatonin: a peroxyl radical Scavenger Mor effective than vitamin E. Life Sci. 1994; 55: 271-276.

 

9. Luther JS, Redmer DA, Reynolds LP, Choi JT, et al. Ovarian follicular development and oocyte quality in anestrous ewes treated with melatonin, a Controlled Internal Drug Release (CIDR) device and follicle stimulating hormone. Theriogenology. 2005; 63(8): 2136-46.

10. Malgorzata K, Reiter RJ. Effect of melatonin in protection ageist cellular damage coused by Ionizing radiation. P.S.E.B.M. 2000; 225: 9-22.

11. Reiter RJ. Melatonin and human reproduction. Ann Med. 1998; 30:103–108.

12. Reiter RJ. Melatonin: clinical relevance. Best Pract Res Clin Endocrinol Metab. 2003; 17: 273–285.

13. Russel J, Reiter SD, Paredest A, Ahmet K, et al. Melatonin combats molecular terrorism at the mitochondrial level Interdisc Toxicol. 2008; 1(2): 137–149.

14. Bladier C, Wolvetang EJ, Huchinson P, de Hann JB, et al. Response of a primary human fibroblast cell line to H2O2: Senescence-like growth arrest or apoptosis? Cell Growth Differ. 1997; 8: 589-598.

15. Chan PJ, Calinisan JH, Corselli JU, Patton WC, et al. Updating quality control assays in the assisted reproductive technologies laboratory with a cryopreserved hamster oocyte DNA cytogenotoxicity assay. J. Assi Rep and Gen. 2001; 18: 129-134.

16. Tamura H, Takasaki A, Miwa I, Taniguchi K, et al. Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate. J. Pineal Res . 2007; 44: 280–287.

17. Hiroshi T, Akihisa T, Ichiro M. Oxidative stress impairs oocyte quality and melatonin protects oocytes from free radical damage and improves fertilization rate. J Pineal Res. 2008; 44(3): 280-343.

18. Ju JC, Jiang S, Tseng JK, Parks JE, et al. Heat shock reduces developmental competence and alters spindle configuration of bovine oocytes. Theriogenology. 2005; 64: 1677–1689.

19. Juknat AA, Mendez Mdel V, Quaglino A, Fameli CI. Melatonin prevents hydrogen peroxide-induced Bax expression in cultured rat astrocytes. J Pineal Res. 2005; 38(2): 84-92.

20. Valasi F, Tsiligianni T, Papanikolaou T, Dimitriadis I, et al. Melatonin improves the developmental competence of sheep oocytes. Reprod Domest Anim. 2006; 41:341.

21. Tan DX, Manchester LC, Terron MP, Flores LJ, et al. One molecule, many derivatives: A never-ending interaction of melatonin with reactive oxygen and nitrogen species? J Pineal Res. 2007; 42(1): 28-42.

22. Vazquez MI, Abecia JA, Forcada F, Casao A. Effects of exogenous melatonin on in vivo embryo viability and oocyte .0competence of undernourished ewes after weaning during the seasonal anestrus. Theriogenology. 2010; 74(4): 618-26.