تاثیر آهن بر تقسیم سلولی و سنتز رنگیزه‌های کلروفیل و بتاکاروتن درون سلولی در جلبک سبز تک‌سلولی Dunaliella

نویسندگان

1 دانش آموخته کارشناسی ارشد، دانشگاه اصفهان ، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اصفهان، ایران

2 دانشگاه اصفهان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اصفهان، ایران

3 دانشگاه لرستان، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، خرم آباد، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی تاثیر آهن بر روی میزان رشد سلولی و مقادیر رنگیزه‌های کلروفیل و بتاکاروتن درون سلولی در جلبک سبز تک‌سلولی Dunaliella می‏باشد. مواد و روش‌ها: غلظت‏های 4، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن بر دو گونه D.salina وD.bardawil اعمال و سپس میزان بتاکاروتن و کلروفیل کل درون سلولی و همچنین تقسیم سلولی در یک دوره رشدی اندازه‌گیری گردید. جلبک‏ها به اتاقک کشت با دمای شبانه روزی 2±26 با فتوپریود 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی انتقال داده شدند. نتایج: در هر دو گونه بیشترین رشد سلولی در غلظت 4 میکرومولار مشاهده گردید و با افزایش غلظت آهن، رشد سلولی و مقدار کلروفیل کاهش یافت که شدت کاهش در غلظت 512 میکرومولار از بقیه تیمارها بیشتر بود. بالاترین میزان بتاکاروتن سلولی  نیز در غلظت 128 میکرومولار مشاهده گردید. نتیجه‌گیری: نتایج حاکی از آنست که حضور آهن در هر دو گونه جلبکی احتمالا باعث افزایش تولید رادیکال‏های آزاد می‏گردد و سلول‏ها جهت مقابله، میزان کلروفیل سلولی و در نتیجه رادیکال‏های حاصل از آن‏را کاهش داده و از طرفی جهت مقابله با رادیکال‏های آزاد تولید شده توسط تنش آهن مقادیر زیادی بتاکاروتن را به‏عنوان آنتی اکسیدان تولید می‏نماید. به‏نظر می‏رسد D.salina به‌واسطه استفاده از تولید بتاکاروتن در سطح پایین و احتمالا استفاده از تولید سایر آنتی اکسیدان‏ها و کاهش میزان کلروفیل در سطح موثرتری کارائی بهتری در مقاومت در برابر آهن نسبت به D. bardawil را دارد.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

جلبک سبز تک سلولی Dunaliella مقاوم به شوری بوده و مدل سیستم گیاهی مناسبی جهت بررسی انواع تنش‌ها می‌باشد (1). این جلبک قادر است تحت برخی شرایط استرس‌زا نظیر نور شدید، شوری بالا و کمبود مواد غذایی جهت مقابله با رادیکال‏های آزاد، بتاکاروتن را احتمالا به‏عنوان آنتی اکسیدان تولید نماید (2، 3 و 4). آهن یک عنصر کم‌مصرف ضروری برای گیاهان و جلبک‌ها بوده که توسط عناصر دیگر قابل جایگزین شدن نیست و از عوامل محدود کننده‌ی رشد محسوب می‌گردد (5). این عنصر به‏عنوان دهنده و گیرنده الکترون در واکنش‌ها عمل‏کرده و در زنجیره‌های انتقال الکترون فتوسنتزی و تنفسی نقش به‏سزایی را ایفا می‌نماید (6). اگرچه آهن یک ماده غذایی ضروری برای گیاهان وجلبک‌ها محسوب می‌گردد، اما تجمع زیاد آن درون سلول می‌تواند ایجاد سمیت نموده و مانع رشد ‌گردد (7) آهن آزاد می‌تواند در واکنش فنتون (رابطه1) به‏عنوان کاتالیزور تولید رادیکال هیدروکسیل و گونه‏های اکسیژن فعال عمل کند (8، 9 و 10).                                                 

Fe2+ , Fe 3+                                                                                                       H2O2 + O−•2   ® OH + HO + O2               1     رابطه

با توجه به اینکه یون آهن در غلظت‏های بالا می‌تواند تولید رادیکال‌های آزاد نماید و از طرفی برخی گونه‏های جلبک Dunaliella در پاسخ به تولید رادیکال‏های آزاد ناشی از شرایط استرس زا، بتاکاروتن را به‏عنوان یک آنتی‌اکسیدان سنتز می‏نمایند لذا در این تحقیق اثر غلظت‌های بالای آهن بر روی سنتز بتاکاروتن و کلروفیل کل درون سلولی و میزان تقسیم سلولی در دو گونه D. salinaو D. bardawil مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‏ها

دو گونه جلبکی Dunaliella salina سویه UTEX200 و گونه Dunaliella bardawilسویه UTEX 2538 از کلکسیون دانشگاه تگزاس آمریکا تهیه گردیده‌اند. در ابتدا جلبک‌ها در شرایط کاملا استریل درمحیط کشت تغییر یافته‌ی جانسون و همکاران توسط Shariati و همکارش (1) در pH برابر 5/7 و در غلظت 5/1 مولار نمک  NaCl در اتاقک کشت با شدت نور100 میکرو مول فوتون بر متر مربع بر ثانیه و فتوپریود 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی در دمای 2±26 درجه‌ی سانتی‏گراد کشت داده شدند سپس به‏منظور شروع آزمایش‏های اصلی سوسپانسیون‌های جلبکی هر دو گونه به‏طور جداگانه حاوی غلظت‌های‌ به‏ترتیب 4، 32، 64، 128، 256، 512 میکرومولار آهن به ‏همراه EDTA با نسبت 5 به 2به FeCl3در 3 تکرار تهیه شدند. تعداد سلول‌های نمونه‏های جلبکی به گونه‌ای تنظیم گردید که در نهایت تعداد سلول‌های سوسپانسیون جلبکی در لحظه‌ شروع آزمایش به‏میزان تقریبی 104×24 سلول در هر میلی‌لیتر برسد این عمل جهت یکسان‌سازی شرایط و ایجاد شباهت در نقطه‏ی اولیه منحنی‌های رشد سلول‌های جلبکی مورد استفاده صورت گرفت. جهت اندازه‌گیری پارامترهای ذکر شده‌ی نمونه برداری در روز‌های 0، 1، 5، 9، 15، 21و 26 بعد از شروع آزمایش انجام گرفت. تعداد سلول با استفاده از لام توما (هموسایتومتر) توسط میکروسکوپ نوری(OLYMPUS OPTICAL CO, LTD, MODEL CH3ORF2000) شمارش گردید (11 و 12). سنجش میزان رنگیزه‌های کلروفیل و بتاکاروتن نیز با استفاده از دستگاه اسپکتروفتومتر (SHIMADZU UV-160A) در طول موج‌های 412، 431، 460، 480 نانومتر بر حسب پیکوگرم بر سلول محاسبه گردید (13).

 

نتایج

نمودار 1 میانگین تعداد سلول‌های جلبکی در گونه‌های D.salina(1، الف) و D.bardawil (1، ب) را در غلظت‌های مورد نظر آهن نشان می‌دهد. همانطور که ملاحظه می‌گردد در گونه D. salinaنزدیک‌ترین میزان تقسیم سلولی نسبت به شاهد (غلظت 4 مولار) در غلظت‌ 32 میکرومولار دیده شد. با افزایش غلظت آهن نسبت به شاهد، میزان تقسیم سلولی کاهش می‌یابد به‌طوری‌که بیشترین کاهش در غلظت 512 میکرومولار آهن مشاهده ‌گردید. نتایج مشابهی در گونه D.bardawil نیز دیده شد.

نمودار 2 مقدار کلروفیل کل سلولی را در گونه D.salina      (2، الف) و D.bardawil (2، ب) در غلظت‌های متفاوت آهن نشان می‌دهد. همانطور که ملاحظه می‌گردد در گونه D.salinaبا افزایش غلظت آهن مقدار کلروفیل کل سلولی در روز اول کاهش می‌یابد که شدت کاهش در طی افزایش غلظت آهن، افزایش می‌یابد به‌طوری که بیشترین کاهش در غلظت 512 و بعد از آن در غلظت 256 میکرومولار آهن مشاهده می‌گردد. کاهش مقدار کلروفیل کل سلولی در این‏گونه تا روز پنجم ادامه یافته و بعد از آن از روند نسبتا ثابتی برخوردار می‌گردد. با بررسی نمودار 2- ب ملاحظه می‌گردد در گونه ‌D.bardawilمقدار کلروفیل کل در روزهای اولیه با شیب تندی افزایش می‌یابد به‌طوری‏که در روز پنجم به بالاترین مقدار خود رسیده است. شدت افزایش میزان کلروفیل‌کل سلولی با افزایش غلظت آهن کاهش می‌یابد به‌طوری‏که کمترین افزایش در غلظت 512 و بعد از آن در غلظت 256 میکرومولار آهن ملاحظه می‌گردد. از روز پنجم به بعد میزان کلروفیل کل سلولی کاهش یافته و سپس از روند نسبتا ثابتی برخوردار می‌گردد.

 

 

نمودار 1: اثر غلظت‌های 4(شاهد)، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3بر روی تعداد سلول در جلبک الف) D. salina ب)D. bardawil . میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد

 

 

نمودار 2:   اثر غلظت‌های 4(شاهد)، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3بر روی میزان کلروفیل سلولی در جلبک    الف) D. salina   ب)D.bardawil ‏. میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد

 

 

نمودار 3 میزان بتاکاروتن سلولی را در دو گونه D. salina     (3، الف) و D. bardawil (3، ب) در غلظت‌های مختلف آهن نشان می‌دهد. همانطور که ملاحظه می‌گردد در گونه D. salina در روز اول میزان بتاکاروتن سلولی کاهش یافته که شدت این کاهش در غلظت 512 میکرومولارآهن نسبت به سایر تیمارها بالاتر بوده و بعد از آن بیشترین کاهش در غلظت 4 و 32 میکرومولار ملاحظه گردید و کمترین میزان کاهش در غلظت 128 میکرومولار و بعد از آن در غلظت‌های 64 و256 میکرومولار دیده شد. از روز اول تا پنجم این مقادیر با شیب کندی کاهش یافته و از روز پنجم به بعد با شیب کمی افزایش می‌یابد. در گونه D.bardawil در روز اول مقدار بتاکاروتن افزایش یافته به‌طوری که بیشترین افزایش در غلظت 64، 128 و 256 و در مرتبه بعد در غلظت 4 و 32 و در آخر کمترین افزایش در غلظت 512 میکرومولار مشاهده می‌شود. این روند افزایشی تاروز پنجم در غلظت‌های 64، 128 و 256 میکرومولار ملاحظه می‌گردد به‏طوری‏که بالاترین افزایش بترتیب در غلظت‌های 128، 64 و 256 میکرومولار دیده شد اما در غلظت‌های 4، 32 و 512 میزان بتاکاروتن سلولی در روز پنجم روند کاهشی از خود نشان داده است. از روز پنجم به بعد در غلظت‌های 64، 128 و 256 نیز میزان بتاکاروتن سلولی کاهش یافته به‌طوری‏که در روز نهم بالاترین میزان بتاکاروتن در غلظت 128 میکرومولار و کمترین مقدار در غلظت 512 میکرومولار دیده شد و از این روز به بعد شیب افزایشی کندی در تمامی تیمارها مشاهده می‌گردد.

 

 

نمودار3: اثر غلظت‌های 4(شاهد)، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3بر روی میزان بتاکاروتن سلولی در جلبک     الف) D. salina   ب)D. bardawil  . میزان شوری محیط کشت 5/1 مولار NaCl می‌باشد. مقادیر میانگین سه تکرار ± انحراف معیار می‌باشد

 

 

در ادامه جهت بررسی مقاومت دو گونه D.salinaوD.bardawil نسبت به آهن در صد تغییرات نرخ رشد، کلروفیل و بتاکاروتن تیمارها نسبت به شاهد در دو گونه با یکدیگر مقایسه گردید.

در نمودار 4، درصد تغییرات میزان تقسیم سلولی در غلظت‌های مورد مطالعه آهن نسبت به شاهد در روز بیستم نشان داده شده است. همان‌طور که ملاحظه می‌گردد درصد کاهش نرخ رشد در گونه D.salinaنسبت به D.bardawil به‌خصوص در غلظت‌های بالای آهن کمتر است. در نمودار 5، درصد تغییرات کلروفیل سلولی را نسبت به شاهد در روز پنجم نشان می‌دهد. همان‌گونه که ملاحظه می‌شود مقادیر کلروفیل سلولی نیز در هر دو گونه نسبت به شاهد کاهش یافته به‌طوری‌که شدت کاهش در گونه D. bardawil نسبت به D. salina بالاتر بوده و با افزایش غلظت آهن این تفاوت مشهودتر می‌گردد. در نمودار 6 نیز در صد تغییرات بتاکاروتن سلولی در دو گونه D.salina و D.bardawil در روز پنجم نشان داده شده است. همانطور که ملاحظه می‌گردد با افزایش میزان آهن تا غلظت 128 میکرومولار یک روند افزایشی در مقدار بتاکاروتن سلولی در هر دو گونه مشاهده می‌شود که شدت افزایش در گونه               D.bardawil نسبت به D.salinaبالاتر می‌باشد. در غلظت 256 میکرومولار نیز در هر دو گونه مقدار بتاکاروتن نسبت به شاهد افزایش یافته اما این افزایش نسبت به میزان افزایش در غلظت 128 میکرومولار کمتر می‌باشد. در غلظت 512 در هر دو گونه مقدار بتاکاوتن سلولی کاهش یافته که این کاهش در گونه D. bardawil نسبت به D. salina کمتر می‌باشد.

 

    D. bardawil

   D. salina

 

 

 

نمودار 4: درصد تغییرات میزان تقسیم سلولی غلظت‌های 4، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3نسبت به شاهد (4 میکرومولارآهن) در روز بیستم در دو گونه D.salina و D.bardawil.

 

 

 

 

    D. bardawil

   D. salina

 

 

 

نمودار 5: درصد تغییرات کلروفیل سلولی در غلظت‌های 4، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3 نسبت به شاهد (4 میکرومولارآهن)در روز پنجم در دو گونه D.salina و D.bardawil.

 

 

 

    D. bardawil

   D. salina

 

 

 

نمودار 6: درصد تغییرات بتاکاروتن سلولی در غلظت‌های 4، 32، 64، 128، 256 و 512 میکرومولار آهن به‏فرم نمک  FeCl3نسبت به شاهد (4 میکرومولارآهن) در روز پنجم در دو گونه D. salina و D. bardawil.

 

 

بحث

همانگونه که در نمودار 1 ملاحظه گردید با افزایش مقدار آهن محیط در هر دو گونه میزان تقسیم سلولی کاهش می‌یابد. به‌نظر می‌رسد این کاهش به‏واسطه تولید رادیکال آزاد توسط فلز آهن باشد. در واقع فلز آهن با شرکت در واکنش فنتون باعث تولید رادیکال هیدروکسیل می‌گردد که این رادیکال بسیار فعال و مخرب بوده و موجب تخریب لپید، پروتئین وDNA  و در نهایت مرگ سلول می‌گردد  (14). با بررسی نمودار 2 نیز مشاهده شد که در هر دو گونه با افزایش غلظت آهن میزان کلروفیل سلولی کاهش می‌یابد که این کاهش نیز به‌واسطه اثر مخرب آهن توجیه می‌گردد به‌طوری‏که به‏نظر می‏رسد آهن منجر به تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن شده که این امر نیز به نوبه خود باعث تجزیه و کاهش رنگدانه‌ها می‌شود (15). از طرفی احتمالا‌ گونه‌های فعال اکسیژن تولید شده، پراکسیداسیون لپیدهای غشا را تحریک کرده و همچنین باعث افزایش پراکندگی تیلاکوئیدها می‌شود (6، 16، 17 و 18). علاوه بر این می‌توان بیان نمود که کاهش میزان کلروفیل سلولی در هر دو گونه احتمالا یک استراتژی در جهت کاهش الکترون‌های برانگیخته ناشی از کلروفیل و در نتیجه کاهش تولید رادیکال‌های حاصل از آن می‌باشد. با بررسی نمودار 3 به‏نظر می‏رسد علت افزایش بتاکاروتن سلولی در غلظت بالای آهن (حدود 128 میکرومولار) در هر دو گونه نیز به‏واسطه‌ی استرس اکسیداتیو و رادیکال هیدروکسیل ناشی از غلظت بالای آهن باشد زیرا یکی از نقش‌های مهم بتاکاروتن، حفاظت از دستگاه فتوسنتزی در برابر استرس‌های محیطی و به‌خصوص استرس اکسیداتیو می‌باشد. همچنین در تایید این نتایج گزارش شده است که جلبکDunaliella  تحت تاثیر فلز سنگین مس قادر به افزایش تولید بتاکاروتن می‌باشد (19). از طرفی کاهش میزان بتاکاروتن سلولی در غلظت‌های بالاتر از 128 میکرومولار آهن، می‏تواند به این علت باشد که سلول توانایی جاروب نمودن رادیکال‌های آزاد تولیدی بیشتر را نداشته و در اثر رادیکال‌های آزاد خنثی نشده، متابولیسم سلول و مسیرهای سنتز آنتی‏آکسیدانی آسیب دیده و قادر به تولید آنتی اکسیدان نمی‏باشد ‌(20). جهت مقایسه میزان مقاومت دو گونه نسبت به آهن، درصد تغییرات تقسیم سلولی، میزان کلروفیل و بتاکاروتن تمامی تیمارها نسبت به شاهد محاسبه گردید. طبق نمودار 4 به‏نظر می‏رسد که گونه            D.salina نسبت به D.bardawil  دارای مقاومت بیشتری به غلظت های بالای آهن (256 و 512 میکرومولار) داشته باشد (21) زیرا میزان شدت کاهش تقسیم در غلظت های بالای آهن در D.salina کمتر می باشد. با توجه به نمودار 5 و 6 به نظر می رسد که در هر دو گونه افزایش سنتز بتاکاروتن و همچنین کاهش میزان کلروفیل به‏‏منظور کاهش کلروفیل برانگیخته و در نتیجه کاهش میزان تولید رادیکال های آزاد در ایجاد مقاومت در برابر غلظت‏های بالای آهن موثر است. با توجه به اینکه نتایج نشان می‌دهد که در غلظت‏های بالای آهن مقاومت در گونهD.salinaنسبت به D.bardawil بالاتر است و از طرفی افزایش سنتز بتا کاروتن و همچنین کاهش میزان کلروفیل در این‏گونه نسبت به D.bardawil کمتر می‌باشد به‏نظر می‌رسد D.salina احتمالا از طریق تولید بیشتر آنتی اکسیدان‌هایی غیر از بتاکاروتن نیز در برابر غلظت‏های بالای آهن مقاومت می‏نماید.

 

 نتیجه گیری

با توجه به نتایج فوق به‏طور کلی می‏توان بیان کرد که در هر دو گونه با افزایش غلظت آهن تا حدود غلظت 128 میکرومولار به‏دلیل افزایش تولید رادیکال‏های آزاد میزان کلروفیل سلولی و رادیکال‏های آزاد ناشی از آن کاهش و همچنین میزان بتاکاروتن احتمالا به‏عنوان آنتی اکسیدان افزایش می‏یابد ولی در غلظت‏های بالاتر (512 میکرو مولار) به‏دلیل ایجاد اختلال در متابولیسم سلولی توسط  رادیکال‏های آزاد تولیدی جاروب نشده، تعداد سلول‏ها و همچنین مقدار کلروفیل و بتاکاروتن سلولی در هر دو گونه کاهش می‏یابد. همچنین نتایج نشان داد که مقاومت گونه D.salina نسبت به D.bardawilدر غلظت‌های بالای آهن بالاتر می‌باشد به‏نظر می‏رسد این امر احتمالا به‌واسطه استفاده D.salina از تولید بیشتر آنتی اکسیدان‏هایی غیر از بتاکاروتن جهت جاروب رادیکال‌های آزاد تولیدی نسبت به استفاده بیشتر از بتاکاروتن و کاهش بیشتر میزان کلروفیل در D.bardawil  باشد.

 

تشکر و قدردانی

 بدین‏وسیله از تحصیلات تکمیلی دانشگاه اصفهان به‏خاطر حمایت مالی در انجام این تحقیق قدردانی می‌گردد. نویسندگان مقاله از قطب تنش‏های گیاهی در دانشگاه اصفهان نیز تشکر و قدردانی می‏نمایند

  1. Shariati M, Lilley McC. Loss of intracellular glycerol from Dunaliella by electroporation at constant osmotic pressure: subsequent restoration of glycerol content and associated volume changes. Plant, Cell and Environment. 1994; 17(12): 1295-1304.
  2. Ben-Amotz A. New mode of Dunaliella biotechnology: two-phase growth for b-carotene production. Journal of Applied Phycology. 1995; 7(1): 65-68.
  3. Gokpinar S, koray T, Akcicek E, Goksan T, et al. Algae antioxidant. EU Journal of Fisheries and Aquatic Sciences. 2006; 23: 85-89.
  4. Gomez-Pinchetti JL, Ramazanov Z, Fontes A, Garcia reina G. photosynthetic characteristice of Dunaliella salina (Chlorophyceae, Dunaliellales) in relation to b-carotene content. Journal of Applied Phycology. 1992; 4(1): 11-15.
  5. Keshtacher-Liebson E, Hadar Y, Chen Y. Fe nutritional demand and utilization by the green alga Dunaliella bardawil. Plant and Soil. 1999; 215:175-192.
  6. Yruela I, Alfonso M, Baron M, Picorel R. Copper effect on the protein composition of photosystem II. Physiologia Plantarum. 2000; 110: 551-70.
  7. Connolly EL, Guerinot ML. Iron stress in plants. Genome Biology. 2002. 3(8): 1-4.
  8. Becana M, Aparicio-Tejo PM, Sanchez-Diaz M. Nitrate and hydrogen peroxide metabolism in medicago sativa nodules and possible effect on leghaemoglobin function. Physiologia Plantarum. 1988; 72: 755-761.
  9. Kobayashi M, Kakizono T, Nagai S. Enhanced carotenoid biosynthesis by oxidative stress in acetate-induced cyst cells of a green unicellular. Applied and Environmental Microbiology. 1993; 59(3): 867-873.
10. Yu J, Hu S, Wang J, Wong GKS, et al. A draft sequence of the rice genome (Oryza sativa L. ssp. indica). Science Direct. 2002; 296: 79-92.

11. Schoen, S. Cell counting, In Lobban C, Champan D, Kremer BP,(eds). Experimental phycology. Cambridge: Cambridge University Press; 1988.

12. Fujii S. The growth and intracellular ionic composition of Dunaliella tertiolecta in magnesium rich media. Plant Cell Physiology.1991; 32: 549-554.

13. Eijckelhoff C, Dekker JP. A routine method to determine the chlorophyll a, pheophytin and β-carotene contents of isolated photosystem II reaction center complexes. Photosynthesis Research. 1997; 52: 69-73.

14. Xiaoling Y, Jinyao G. Regulation of Fe growth and material accumulation of Dunaliella salina. Chinese Agricultural Science Bulletin. 2010; 10: 109.

 

15. Sairam RK, Deshmukh PS, Saxna DC. Role of antioxidant systemes in wheat genotype tolerance to water stress. Biologia Plantrum. 1998; 41(3): 387-394.

16. Devi SR, Prasad MNV. Copper toxicity in Ceratophyllum demersumL. (Coontail), a free floating macrophyte: response of antioxidantenzymes and antioxidants. Plant Sciences.1998; 138: 157-165.

17. Patsikka E, Aro EM, Tyystjarvi E. Mechanism of copper-enhanced photoinhibition in thylakoid membranes. Plant Physiology. 2001; 113: 142-50.

18. Vassilev A, Lidon F, Campos PS, Ramalho JC, et al. Cu-induced changes in chloroplast lipids and photosystem II activity in barley plants. Journal of Plant Physiology. 2003; 29, 33-43.

19. Shariati M, Yahyaabadi S. The effect of heavy metal copper on betacarotene synthesis in unicellular alga  Dunaliella salina. Iranian Journal of Biology. 2002; 11,37-48. persian.

20. Mojaat M, Pruvost J, Foucault A, Legrand J. Effect of organic carbon sources and Fe2+ ions on growth and b-carotene accumulation by Dunaliella salina. Biochemical Engineering Journal. 2008; 39: 177-194.

21. Vorst P, Baard RL, Mur LR, Korthals H, et al. Effect of growth arrest on carotene accumulation and photosynthesis in Dunaliella. Microbiology. 1994; 140: 1411-1417.