بررسی تاثیر نانواکسید روی بر برخی شاخص‌های رشد و فیزیولوژی گیاه پریوش (Catharantus roseus)

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، ، دانشکده علوم ، گروه زیست شناسی، اراک، کدپستی8349-8-38156

2 دانشجوی کارشناسی ارشد، دانشگاه اراک، دانشکده علوم، گروه زیست شناسی، اراک، کدپستی8349-8-38156

چکیده

هدف: این تحقیق به‏منظور مطالعه تاثیر غلظت‌های مختلف نانوذرات اکسید‌روی بر روی برخی شاخص‌های رشدی، مقدار پرولین، ‌آلکالوئیدها و همچنین تغییرات فعالیت برخی آنزیم‏های آنتی اکسیدانی انجام گرفت. موادوروش‏ها: آزمایش در شرایط کشت گلخانه، به‏صورت کاملا تصادفی با 3 تکرار طراحی شد. گیاهان در معرض غلظت‌های مختلف2، 4، 5، 10و 15میکرومولار از نانوکود اکسیدروی قرار گرفتند و تاثیر این غلظت‌ها بر روی گیاه، با گیاه شاهد که از محلول غذایی کامل که حاوی سولفات روی است مقایسه شد. همچنین به‏منظور بررسی علائم کمبود روی، از غلظت صفر میکرومولار استفاده شد.  نتایج: تیمار گیاه با نانواکسیدروی در غلظت 2 سبب افزایش و در غلظت‌های بالاتر از 2 میکرومولار به‏طور معنی‌داری سبب کاهش در وزن تر و خشک و طول ریشه شدند. فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی در گیاهان تیمار شده با نانو اکسید روی نسبت به گیاه کنترل با افزایش غلظت نانواکسیدروی در محلول غذایی افزایش یافت. همچنین مقدار پرولین و آلکالوئیدهای کل با افزایش شدت تنش در گیاه افزایش یافت. نتیجه‏گیری: با افزایش غلظت نانو اکسیدروی جذب روی در مقیاس نانو بیشتر صورت گرفته است. به‏دلیل سمیت ایجاد شده، شاخص‌های رشدی گیاه کاهش  یافته و تنش اکسیداتیو در گیاه القا شده است. گیاه برای مبارزه با رادیکال‏های آزاد تولید شده فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی خود را افزایش داده است. همچنین میزان پرولین نیز که به هنگام تنش در گیاهان افزایش می‌یابد، افزایش یافت.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

عناصر معدنی ضروری گیاه که هر کدام دارای نقش‌های فیزیولوژیکی مشخصی هستند، بر اساس غلظت نسبی آن‌ها در بافت‌های گیاهی به عناصر کم مصرف و پرمصرف تقسیم می‌شوند. از آنجایی‏که اغلب عناصر کم مصرف مانند روی، مس، کبالت و غیره جز فلزات سنگین نیز طبقه‌بندی می‌شوند زمانی‏که غلظت آن‌ها در خاک و بافت‌های گیاهی بالاتر از حد کفایت گیاهی باشد به‏علت ایجاد مسمومیت، رشد و عمل‏کرد گیاه را تحت تاثیر قرار می‌دهند. در بسیاری از مناطق تحت کشت گیاهان، آلودگی فلزات سنگین سبب ایجاد اثرات مخرب بر بیوسفر و اختلال در اکوسیستم‌های آبی و خشکی آن‌ها شده است (1) یکی از بارزترین اثرات این عناصر فلزی سنگین در گیاهان القای تنش اکسیداتیو و ایجاد رادیکال‌های فعال اکسیژن می‌باشد. انواع اکسیژن فعال (ROS) به‏عنوان عوامل اصلی بروز تنش اکسیداتیو از توان اکسیدکنندگی بالایی برخوردار هستند، مولکول‌های زیستی را مورد تهدید قرار داده، فرایندهای مختلف سلولی را تحت تاثیر قرار داده و با ایجاد اختلال در متابولیسم طبیعی سلول گیاهی منجر به مرگ سلول نیز می‌شوند. میزان آسیب سلول‌های تحت تنش فلزات سنگین بستگی به‏میزان تولید رادیکال‌های آزاد و ROS و همچنین کارایی مکانیسم‌های سم‌زدایی در گیاهان دارد (2). برای کاهش سمیت فلز در گیاهان، سیستم‌های آنتی‌اکسیدان همچنین به عنوان مکانیسم تحمل مورد بررسی قرار می‌گیرند. سیستم‌های آنتی‌اکسیدانی شامل آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان مثل سوپر‌اکسید‌دیسموتاز (SOD)، کاتالاز (CAT)، فنل‌پراکسیداز (POX)، آسکوربات‌پراکسیداز (APX)، گایاکول‌پراکسیداز (GPX) و مولکول‌های آنتی‌اکسیدان غیر ‌آنزیمی که شامل آسکوربات، آلفا‌توکوفرول، کاروتنوئیدها، فلاونوئیدها و گلوتاتیون می‌باشد (3). سمیت روی باعث القای تنش اکسیداتیو به‏وسیله تولید رادیکال‌های آزاد و گونه‌های اکسیژن فعال (ROS) می‌شود (4). مقدار بالای ROS  تحت شرایط تنش ایجاد می‌شود و تولید زیاد این‌ROS ‌ها مانند سوپر‌اکسید، H2O2 و OH- در گیاهان تحت تنش فلز ایجاد می‌شود (5). آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی درسلول‌های گیاهی H2O2 را به H2O تبدیل می‌کنند و اثر سمیت H2O2 را تنظیم می‌کنند اما آنزیم‌های CAT، APX و GPX به‏نظر می‌رسد که اهمیت بیشتری دارند (6). نتایج حاصل نشان می‌دهد که افزایش سطوح آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی القا شده به‏وسیله روی ممکن است به‏عنوان مکانیسم دفاعی ثانویه در قبال تنش اکسیداتیو باشد. نانوتکنولوژی، فناوری ‌است که ‌از کنش‌ها و واکنش‌هایی‌ که در سطح اتم اتفاق می‌افتد منشا گرفته و فناوری جدیدی ‌است که تمام علوم را درخواهد نوردید، به تعبیر دقیق‌تر "نانوتکنولوژی ‌انقلابی جدید برای همه علوم در آینده ‌است". این نانوتکنولوژی قادر به بهبود روش‌های ‌ارزیابی، مدیریت و کاهش خطرات برای محیط زیست بوده و فرصت‌هایی‌ را برای ‌تولید محصولات جدید فراهم خواهد ‌ساخت. نانوتکنولوژی در‌واقع مهندسی در سطح اتم و یا گروهی‌ از اتم‌ها می‌باشد. از همین ‌تعریف ساده بر‌می‌آید که نانوتکنولوژی ‌یک رشته جدید نیست، بلکه رویکرد جدیدی در تمام رشته‌هاست. بنابراین علم نانو‌تکنولوژی ‌توانمندی ‌تولید مواد، ابزارها و سیستم‌های جدید برای در دست گرفتن کنترل در سطوح مولکولی و اتمی، با استفاده از خواصی ‌که در آن سطوح ظاهر می‌شود، را دارد (7). علم نانو می‌تواند تمام عرصه علوم را تحت تاثیر قرار دهد و علم کشاورزی نیز استثنا نمی‌باشد یکی از کاربردهای علم نانو در کشاورزی مدیریت تغذیه‌ گیاهی است. با بهره‌گیری‌ از نانو‌کودها، عناصر غذایی ‌به ‌آرامی و با سرعتی مناسب ‌در تمام طول فصل رشد گیاه‌ آزاد می‌شوند و بنابر‌این به‏دلیل کاهش شدید آبشویی عناصر، گیاهان قادر به جذب بیشترین مقدار مواد غذایی خواهند بود. تا به‏حال کاربردهای متعددی از فناوری نانو در کشاورزی ، صنایع غذایی و علوم دامی مطرح شده است؛ از جمله ایجاد سیستم‏های هوشمند برای پیشگیری و درمان بیماری‏های گیاهی و بازیافت ضایعات حاصل از محصولات کشاورزی. از بین تدابیر موجود در مدیریت آفات کشاورزی استفاده از آفت کش‏ها و سموم سریع‏ترین و ارزان‏ترین روش برای واکنش به یک وضیت اضطراری است. روش‏های کنترل زیستی در حال حاضر بسیار هزینه بر هستند . در این روش ها کنترل آفت از طریق یکی از دشمنان طبیعی آن آفت صورت می‏گیرد. امروزه مصرف بی رویه آفت کش‏ها مشکلات زیادی را ایجاد کرده‏اند این مشکلات شامل اثرات سو بر سلامت انسان (ایجاد مسمومیت های حاد یا بیماری های مزمن)، تاثیر این مواد بر حشرات گرده افشان و حیوانات اهلی مزارع و همچنین ورود این مواد به آب و خاک و تاثیر مستقیم وغیر مستقیم آن در این نظام‏های زیستی می باشد.

بررسی‏ها نشان داده‌اند که نانواکسیدروی بر میزان جذب عناصر تاثیر دارد. با افزایش مصرف نانواکسیدروی میزان روی نیز در گیاه افزایش می‌یابد. افزایش غلظت روی در ذرت با کاربرد سولفات‌روی گزارش شده است (8). آزمایشات مختلف نشان داده‌اند که با افزایش کاربرد روی، غلظت روی در ریشه، ساقه و برگ ذرت افزایش می‌یابد به‏طوری‏که مقدار آن در اندام‌های هوایی بیشتر از ریشه می‌باشد (9). افزایش غلظت نانواکسیدروی بر میزان جذب پتاسیم فسفر و آهن نیز موثر است. پتاسیم نقش ویژه‌ای در حیات و بقای گیاهان تحت شرایط تنش محیطی بازی می‌کند و در شرایط کمبود پتاسیم حساسیت گیاهان به تنش‌های محیطی افزایش می‌یابد. به‏طوری‏که در شرایط تنش، تولید رادیکال‌های فعال اکسیژن در گیاهان به شدت تحریک می‌گردد. محققان نیاز به پتاسیم بالا را به نقش بازدارندگی پتاسیم در مقابل تولید رادیکال‏های فعال اکسیژن در طی فتوسنتز و اکسیده شدن NADPH نسبت داده‌اند (5). اثر مطلوب کاربرد روی بر غلظت پتاسیم در برنج گزارش شده است. برهم‏کنش مثبت و معنی‌داری بین روی و پتاسیم در گندم نیز مشاهده شده است (10). در مطالعه دیگری نیز کاربرد روی باعث افزایش عناصر بور و پتاسیم در بافت گیاهی برنج گردید (11).  یکی از علائم سمیت روی در گیاهان اختلال در جذب فسفر، منیزیوم و منگنز می‌باشد (12). هنگامی‏که روی و فسفر در حد توازن در گیاه وجود دارند سبب افزایش عمل‏کرد می‌شوند ولی وقتی بین فسفر و روی توازنی وجود نداشته باشد این دو عنصر دارای اثرات متقابل می‌شوند. اثر متقابل عنصر روی و فسفر در داخل سیستم گیاهی به این‏صورت است با افزایش مقدار یکی، دیگری در اندام‌های گیاهی کم می‌شود یعنی رابطه روی و فسفر یک رابطه ضدیتی است .بر‌همکنش روی–فسفر در خاک ممکن است به‏دلیل اختلال در انتقال از خاک به سطح ریشه، افزایش جذب سطحی روی در خاک‌های حاوی اکسیدهای‌آهن و آلومینیم و کاهش پخشیدگی این عناصر به سمت ریشه نیز باشد. امروزه پذیرفته شده است که بر‌همکنش روی و فسفر در گیاهات اتفاق می‌‌افتد. روی این قابلیت را دارد که احتمالا با انجام وظایفی در غشا سلولی آهنگ جذب فسفر به‏وسیله ریشه را کنترل کند. اثر بازدارندگی روی بر تغذیه فسفری گیاهان به‏طور گسترده توسط محققان گزارش شده است (10). در شرایط کمبود روی (غلظت صفر میکرومولار) فسفر از ریشه‌ها به قسمت‌های هوایی گیاه منتقل می‌شود و علت را آسیب‌دیدگی سیستم کنترل آزاد شدن فسفر از سلول‌های ریشه به آوندهای چوبی ذکر می‌کنند بنابراین با افزایش نفوذپذیری دیواره سلولی ریشه، غلظت فسفر افزایش می‌یابد اما افزایش نفوذپذیری دیواره سلولی همان‌گونه که می‌تواند جذب عناصر را زیاد کند، خروج آن‌ها از ریشه را نیز بایستی افزایش دهند. بنابراین در این بررسی در شرایط صفر میکرومولار احتمالا خروج فسفر از سلول‌های ریشه صورت گرفته است و مقدار فسفر کاهش یافته است. عنصر روی از طریق تاثیر بر میزان جذب و جابه‏جایی عناصر ضروری و نیز اثر بر میزان فعالیت برخی از آنزیم‌ها در جایگاه عمل‏کردشان موجب اختلال در متابولیسم گیاه می‌شود. واکنش متقابل میان فلز روی و آهن در بسیاری از مطالعات گزارش شده است (13). طبق نتایج به‏دست آمده در این پژوهش، افزایش نانواکسیدروی در محلول غذایی منجر به کاهش سطح آهن در اندام‌های هوایی گیاه پریوش شده است. محققین نشان داده‌اند که مصرف روی غلظت آهن را کاهش می‌دهد (14).

پریوش یکی ‌از گیاهان دارویی مهم و از تیره خرزهره می‌‌‌باشد. تمام بخش‌های این گیاه دارای آلکالوئید است حتی دانه آن دارای‌ آلکالوئیدهای مهمی ‌از جمله ‌اجمالیسین، سرپنتین، وین‌بلاستین و وین‌‌‌کریستین است. آلکالوئیدهای وین‌بلاستین و وین‌کریستین از اهمیت ویژه‌ای ‌برخوردارند: این دو آلکالوئید از طریق اتصال به میکروتوبول‌ها و توقف تقسیم سلولی در طی متافاز میتوز، خاصیت ضد توموری داشته و بیش از ۴۰ سال است که در شیمی درمانی‌ بسیاری ‌از سرطان‌ها کاربرد دارند (15).

پژوهش حاضر به‏منظور بررسی مقایسه پاسخ‌های رشدی و بیوشیمیایی گیاه پریوش به دو فرم روی (سولفات‌روی موجود در محیط هوگلند و نانوسولفات‌روی) طراحی و اجرا شد.

 

مواد و روش‌ها

تهیه و آماده‌سازی بذر: بذر گیاه پریوش (Catharanthus roseus) از شرکت پاکان بذر اصفهان در مهر ماه‌ سال 1391 تهیه شد. ‌این بذرها ابتدا توسط هیپوکلریت‌سدیم 2 درصد به‏مدت 5 دقیقه ضد‌عفونی سطحی و سپس 2 بار با آب مقطر شستشو داده شدند. بذرهای ضدعفونی شده در بین دو کاغذ صافی مرطوب و استریل قرار گرفتند و به محض جوانه‌زنی به گلدان منتقل شدند.

تهیه و آماده‌سازی نانوذرات اکسید‌روی:نانوذرات اکسید‌روی از شرکت پیشگامان نانو مواد مشهد خریداری شدند. برای ساخت غلظت‌های مورد نیاز (2، 4، 5، 10، 15 میکرومولار) ابتدا 16/0 گرم ماده وزن شد و در ml100 آب مقطر دو بار تقطیر حل شدند و محلول 2 میلی‌مولار نانواکسیدروی به‏دست آمد. سپس در دستگاه اولتراسونیک (100 W, 40 KHz)  به مدت نیم ساعت به منظور پراکنده شدن ذرات قرار گرفتند، سپس یک مگنت مغناطیسی درون محلول قرار داده شد و به‏مدت یک ساعت بر روی دستگاه استیرر قرار گرفت تا مانع آگلومره شدن نانو‌ذرات شود. از این محلول برای ساخت مقادیر مورد نیاز استفاده شد. برای ساخت غلظت 2 میکرومولار 1 میلی‏لیتر از سوسپانسیون تهیه شده را در 1000 میلی‏لیتر محلول هوگلند بدون روی حل شد و به‏همین ترتیب برای ساخت غلظت 4 میکرومولار 2 میلی‏لیتر، 5 میکرومولار 5 میلی‏لیتر، 2، 10 میکرومولار 5 میلی‏لیتر و 15 میکرومولار 5/7 میلی‏لیتر، از سوسپانسیون آماده شده به1000 میلی‏لیتر هوگلند بدون روی منتقل شدند. در تیمار صفر از هوگلند فاقد روی استفاده شد و از هوگلند کامل دارای سولفات روی هم به‏عنوان شاهد استفاده شد (16).

کاشت گیاه و اعمال تیمارها:گلدان‌های با ارتفاع 20 سانتی‌متری با نسبت مساوی خاک و پرلیت پر شدند سپس بذرهایی که روی کاغذ صافی جوانه زده بودند، به گلدان‌ها منتقل شدند. کلیه گیاهان در شرایط آزمایشگاهی با دمای 3±25 درجه سانتی‌گراد در روز و 2±20 درجه سانتی‌گراد در شب و دوره روشنایی 12 ساعت روشنایی و 12 ساعت تاریکی رشد داده شدند و اعمال تیمارها به‏صورت یک روز در هفته و به‏مدت 10 هفته ادامه یافت. برای کم کردن اثرات محیطی، جابه‏جایی تصادفی گلدان‌ها در طول دوره رشد انجام گرفت. این طرح به‏صورت کاملا تصادفی با سه تکرار انجام شد. در پایان دوره گیاهان برای بررسی تاثیر نانواکسید‌روی برداشت شدند.

اندازهگیری فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی:فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کل با معرف DPPH (1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl;)، SOD، CATو GPX به‏ترتیب از روش‌های کامکار و همکاران (17)، جیانوپلیتیس و راس (18)، کاک‌ماک و مارسچنر (19) اندازه‌گیری شد. میزان پرولین و آلکالوئیدهای کل نیز به‏ترتیب از روش‏های بیتس و همکاران (20) و عظیمی و همکاران (21) اندازه گیری شد.

ارزیابی مهار فعالیت رادیکال DPPH (Inhibitory percentage, %I):100 میلی‏گرم نمونه‌ برگ تازه در اتانول 90 درصد هموژنیزه شده و به‏مدت 24 ساعت در دمای 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری و سپس سانتریفوژ شدند. 20میکرولیتر از محلول رویی با 800 میکرولیتر از DPPH محلول در اتانول (5/0 میلی‏مولار) مخلوط شدند. میزان جذب محلول در 517 نانومتر و پس از 30 دقیقه نگهداری در تاریکی قرائت شد. در صد مهار رادیکال DPPH (%I) با استفاده از فرمول زیر محاسبه شد.

12%I=ط¢ط²ظ…ط§غŒط´ظ…ظˆط±ط¯ظ†ظ…ظˆظ†ظ‡ط¬ط°ط¨-ط´ط§ظ‡ط¯ظ†ظ…ظˆظ†ظ‡ط¬ط°ط¨ط´ط§ظ‡ط¯ظ†ظ…ظˆظ†ظ‡ط¬ط°ط¨أ—100'>

تجزیه و تحلیل آماری

 نتایج مورد استفاده در این پژوهش میانگین حداقل 5 تکرار در هر آزمایش است. اطلاعات به‏دست آمده توسط روش ANOVA با استفاده از نرم افزار SPSS v.16 و 05/0> P مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفتند.

 

نتایج

اثر نانواکسیدروی بر وزن تر و خشک و طول ریشه در جدول1 نشان داده شده است. اندازه‌گیری‌ها نشان داد که روی در غلظت‌های پایین نانواکسیدروی (2 میکرومولار) باعث افزایش میزان وزن تر و خشک ریشه نسبت به نمونه شاهد می‌شود، اما این افزایش نسبت به نمونه شاهد معنی‌دار نیست. این در حالی است که با افزایش غلظت نانواکسیدروی (2میکرومولار به بالا) وزن تر و خشک ریشه نسبت به نمونه شاهد کاهش معنی‌داری پیدا می‌کند. علاوه بر این در غلظت صفر میکرومولارکه فاقد روی بوده است نیز وزن تر و خشک ریشه کاهش یافته است و این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار بوده است. در مورد طول ریشه نیز بیشترین میزان طول ریشه به غلظت 2 میکرومولار نانواکسیدروی مربوط است که این افزایش نسبت به گروه شاهد معنی‌دار است و با افزایش شدت تنش از طول ریشه کاسته می‌شود. طول ریشه در غلظت صفر میکرومولار نیز نسبت به گیاه شاهد کاهش معنی‌داری داشته است. نتایج حاصل از اندازه‌گیری مقدار پرولین گیاهان تیمار شده با نانواکسیدروی روند افزایشی را نشان می‌دهد با افزایش شدت تنش میزان پرولین گیاه نیز افزایش یافته است. در غلظت‏های صفر، دو و چهار میکرومولار میزان پرولین گیاه کاهش یافته است ولی این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار نبوده است (شکل1). نتایج آنالیز واریانس اثر معنی‌داری) 01/0 (p≤را بر میزان آلکالوئیدهای کل گیاهان پریوش 70 روزه نشان می‌دهد. با توجه به شکل 2 میزان آلکالوئیدهای کل اندازه‏گیری شده در غلظت صفر میکرومولار نانواکسیدروی 7 درصد نسبت به شاهد کاهش یافته است. اما این کاهش معنی‏دار نبوده است. به‏تدریج با افزایش تنش روی میزان آلکالوئیدهای کل افزایش می‌یابد به‏طوری‏که غلظت‌های 2، 4، 5، 10و 15 میکرومولار نانواکسیدروی به‏ترتیب 14، 16، 28، 28 و 45 درصد نسبت به شاهد افزایش را نشان داده است که البته در غلظت‏های 0 و 2 نسبت به شاهد معنی‏دار نبودند. نتایج آنالیز واریانس اثر معنی‌دار) 01/0 (p≤ غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی را بر میزان I% )درصد تخریب رادیکال DPPH) را نشان داد. با افزایش شدت تنش میزان I%در گیاهان تحت تیمار نسبت به گیاهان شاهد افزایش یافت به‏طوری‏که بیشترین میزان I% در غلظت 15 میکرومولار نانواکسیدروی مشاهده شد (شکل3، الف). همانطور که در شکل مشاهده می‌شود میزان فعالیت آنزیم‌های سوپر‌اکسید‌دیسموتاز وکاتالاز و گایاکول‌پراکسیداز نیز با افزایش میزان نانو ذرات، به‏ترتیب از 2، 4 و 10 میکرو مول، افزایش یافته است ( شکل 3ب، ج و د) این نتایج حاکی از این است که افزایش تیمار نانواکسیدروی موجب القای تنش اکسیداتیو و در نتیجه تولید بیشتر گونه‌های فعال اکسیژن در گیاه پریوش شده است. در غلظت صفر میکرومولار  میزان فعالیت این آنزیم‏های آنتی اکسیدان کاهش یافته است و این کاهش در فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانی کل و گایاکول پراکسیداز نسبت به نمونه شاهد معنی‌دار بوده است. اما کاهش فعالیت آنزیم‏های آنتی اکسیدانی کاتالاز و سوپراکسیددیسموتاز نسبت به نمونه شاهد معنی‌دار نبوده است.

 

 

جدول1: مقایسه میانگین اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر وزن تر و خشک و طول ریشه گیاه پریوش 70 روزه. حروف مشابه نشان‌دهنده عدم اختلاف معنی‌دار بین میانگین‌ها مطابق آزمون دانکن است. داده‌ها میانگین 3 تکرار± SE است.مقایسه برای هر ستون جداگانه انجام شده است.

غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی (میکرومتر)

 

 

وزن تر

 

وزن خشک

طول ریشه

کنترل

 

a0033/0±1/0

 

a0027/0±014/0

a76/1±33/17

0

 

b 0115/0±03/0

 

c0017/0±005/0

b45/1±67/6

2

 

ab0252/0±12/0

 

ab0003/0±016/0

a88/0±0/19

4

 

b0033/0±03/0

 

bc0003/0±006/0

b2/1±67/18

5

 

b0088/0±03/0

 

bc0014/0±006/0

b73/2±67/8

10

 

b012/0±03/0

 

bc0012/0±006/0

b08/2±0/7

15

 

b012/0±02/0

 

c0003/0±004/0

b73/2±33/5

 

 

شکل 1: اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی (0، 2، 4، 5، 10 و 15 میکرومولار) بر میزان پرولین برگ گیاهان پریوش 70 روزه. خطوط نشان‌دهنده خطای استاندارد (SE ) است حروف مشابه نشان‌دهنده عدم تفاوت معنی‌دار اختلاف میانگین‌ها برای هر شاخص می‌باشد.

 

شکل 2: اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی (0، 2، 4، 5، 10 و 15 میکرومولار) بر میزان آلکالوئید برگ گیاهان پریوش 70 روزه. خطوط نشان‌دهنده خطای استاندارد (SE ) است حروف مشابه نشان‌دهنده عدم تفاوت معنی‌دار اختلاف میانگین‌ها برای هر شاخص می‌باشد.

 

 

 

 

شکل 3: اثرات غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی (0، 2، 4، 5، 10 و 15 میکرومولار) بر میزان الف)  I%ب  SOD (ج) CAT و د) GPOX برگ گیاهان پریوش 70 روزه. خطوط نشان‌دهنده خطای استاندارد (SE ) است حروف مشابه نشان‌دهنده عدم تفاوت معنی‌دار اختلاف میانگین‌ها برای هر شاخص می‌باشد.

 

 

 

بحث

در غلظت 2 میکرومولار نانو‌اکسید‌روی وزن تر و خشک ریشه افزایش جزئی نسبت به شاهد داشته است اما این افزایش معنی‌دار نبوده است. کاهش میزان وزن تر و خشک در دو بخش هوایی و ریشه در غلظت‌های بالای نانواکسیدروی به تنهایی حاکی از عدم ورود آب به درون بافت‌های گیاهی است. یافته‌های اخیر حاکی از آن است که کانال‌های آبی محدود به سلول‌های جانوری نبوده و در سلول‌های گیاهی نیز وجود دارند. عناصر سنگین از طریق بلوکه کردن کانال‌های آبی به‏واسطه برهم‏کنش با گروه‌های سولفیدریل کانال‌های آبی سبب بسته شدن کانال‌های آبی و عدم نفوذ آب به درون بافت‌های گیاهی می‌شوند، عناصر سنگین با اثر سریع با ارتباطات آبی سلول‌های گیاهی به‏علت کاهش سریع قابلیت هدایت آبی سلول‌ها سمیت خود را آشکار می‌نمایند و تاثیر بر کاهش قابلیت انتقال آبی غالبا سریع‌تر و بیشتر از تاثیر سمیت عناصر سنگین بر غشای پلاسمایی در گیاهان آشکار می‌گردد (22). کاهش وزن می‌تواند به‏دلیل افت محتوی آب گیاه و تاثیر آن بر فرایندهای فیزیولوژیکی نظیر تعرق، تنفس و فتوسنتز رخ داده باشد. نتایج حاصل از کاهش وزن‌ تر ریشه با نتایج مورد مطالعه بر روی گیاه آرابیدوپسیسArabidopsis thaliana  همخوانی دارد (23). تیمار گیاه(Vigna radiata) در غلظت‌های بیش ازppm 200 نانواکسیدروی رشد ریشه این گیاه را کاهش داده است (24). همچنین به‏کار بردن غلظت‌های ‌بالای نانوذرات اکسید‌روی در گندم، توقف رشد، کاهش بیوماس را به‏همراه داشت (25). در این آزمایش در غلظت صفر میکرومولار وزن تر و خشک ریشه کاهش یافته است و این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار بوده است. کمبود روی به‏ویژه منجر به کاهش رشد گردیده، زیست توده کمتری تولید شده و در نهایت عمل‏کرد گیاه کاهش می‌یابد (26). اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی، به استثنا غلظت 2 میکرو‏مول، بر طول ریشه گیاه پریوش در سطح 05 درصد معنی‌دار است. در شرایط تنش روی، رشد طولی ریشه‌ها کاهش می‌یابد علل بازدارندگی رشد ریشه را می‌توان حساسیت زیاد مریستم راس ریشه به فلزات سنگین و اثر روی بر آنزیم ایندول‌استیک‌اسید‌اکسیداز در سطح ریشه اشاره کرد (27). کاهش رشد ریشه‌ها که با کاهش طول و وزن تر آن مشخص می‌شود منجر به عدم توسعه و گسترش مناسب سیستم ریشه‌ای شده و با کاهش سطوح جذب کننده و تغییر در ساختار غشای سلولی، جذب آب کاهش یافته، محتوی آب گیاه افت می‌کند که این امر بر فرآیندهای فیزیولوژیکی نظیر تعرق، تنفس و فتوسنتز اثر کرده نهایتا موجب کاهش رشد در سایر بخش‌های گیاه می‌شود. در این پژوهش نیز در غلظت صفر میکرومولار طول ریشه 61 درصد نسبت به شاهد کاهش یافت و این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار بوده است. طی مطالعاتی مشاهده شده است که کمبود روی باعث کاهش رشد ریشه می‌شود (28).

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر میزان پرولین

پژوهش‌ها نشان می‌دهد که با افزایش غلظت روی مقدار پرولین اندام هوایی افزایش می‌یابد. پرولین در بهبود استرس‌های محیطی از جمله استرس‌های فلزات سنگین در گیاهان و میکروارگانیسم‌ها نقش مهمی دارد (29). تجمع پرولین در گیاهان تحت تنش با کاهش خسارت در غشای سلولی و پروتئین‌ها می‌باشد (30). سنتز پرولین در کاهش پتانسیل اسمزی سیتوپلاسمی و حفظ نسبتNADP/NADPH+ دخالت دارد (31). همچنین پرولین به‏عنوان یک اسمولیت، جاروب‌کننده‌ی رادیکال‌ها، تثبیت‌کننده ماکرومولکول‌ها و یک جز دیواره سلولی عمل می‌کند (32). پرولین تثبیت‌کننده پروتئین و کلات‌کننده فلزات است و از پراکسیداسیون لیپیدها و گونه‌های فعال اکسیژن جلوگیری می‌کند (33). بنابراین در هنگام تنش فلزات سنگین تولید پرولین افزایش می‌یابد تا گیاه را در مقابل سمیت حفظ نماید. در شرایط تنش گلوتامات که پیش‌ساز سنتز کلروفیل و پرولین است به سمت تولید پرولین پیش می‌رود. چهار دلیل برای افزایش تجمع پرولین در حین تنش پیشنهاد شده است که عبارتند از :الف) تحریک سنتز آن از اسید‌گلوتامیک ب) کاهش صادرات آن از طریق آوند آبکش ج) جلوگیری از اکسیداسیون آن در طول تنش د) تخریب و اختلال در فرآیند سنتز پروتئین (34). انباشتگی پرولین آزاد در پاسخ به روی، کادمیم و مس در میخک مقاوم و غیر‌مقاوم مورد مطالعه قرار گرفت و مشخص شد که غلظت پرولین در برگ‌های اکوتیپ مقاوم در برابر فلزات مزبور، پنج تا شش برابر بیشتر از اکوتیپ‌های غیر‌مقاوم است (35). در این پژوهش نیز با افزایش غلظت‌های نانواکسیدروی در محلول غذایی، مقدار پرولین در اندام هوایی گیاه پریوش افزایش یافت. در غلظت صفرمیکرومولار میزان پرولین گیاه کاهش یافته است ولی این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار نبوده است.

 

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی برمیزان آلکالوئیدهای کل

در مطالعه حاضر میزان تجمع آلکالوئیدهای کل با افزایش غلظت نانواکسید روی افزایش یافته است و این افزایش در غلظت‌های بیشتر از 4میکرومول در سطح 1 درصد نسبت به نمونه شاهد معنی‌دار است. آلکالوئیدها در تمام اندام‌های گیاهی یافت می‌شوند. میزان آن در بافت گیاه به‏میزان بیوسنتز و کاتابولیسم گیاه بستگی دارد و این خود نیز به مرحله رشد، وظیفه هر اندام گیاهی و عوامل محیطی دارد. گزارش‌های زیادی در مورد اثر عوامل محیطی بر میزان آلکالوئیدها وجود دارد. شرایط محیطی بر رشد گیاه و همچنین تشکیل آلکالوئیدها موثر است. بسیاری از آلکالوئیدها در بافت‌های جوان در حال رشد تشکیل شده، عوامل موثر بر رشد این بافت‌ها، مانند نفوذ نور، منبع نیتروژن، پتاسیم، فسفر و سایر مواد معدنی، درجه حرارت، رطوبت خاک، و ارتفاع از سطح دریا بر میزان تولید آلکالوئیدها اثر می‌گذارد (36). در آزمایشی که برای بررسی تاثیر فلزات سنگین بر تجمع آلکالوئیدها در گیاه پریوش انجام شد محققان مشاهده کردند که استفاده از  نیکل، سرب، منگنز و کادمیم در غلظت‌های 5 میلی‌مولار میزان آلکالوئیدهای کل در ریشه این گیاه افزایش یافت. تیمار کادمیم و نیکل دو برابر و سرب سه برابر میزان آلکالوئید را افزایش داد (37). در آزمایشی دیگر که بر روی گیاهان پریوش که در معرض نیتروژن اضافی قرار گرفته بودند مشاهده شد میزان چهار آلکالوئید وین‌بلاستین، وین‌کریستین، وین‌دولین و کاتارانتین افزایش یافت. آزمایشات نشان داد که گیاهان پریوش که تحت تنش خشکی قرار گرفته بودند شاخص‌های رشدی آن‌ها کاهش یافت اما محتوای آجمالیسین افزایش یافت. در آزمایشی دیگر نیز مشاهده شد طی تنش خشکی، میزان ایندول‌آلکالوئید در این گیاه (پریوش) افزایش یافته است (38). در طی تنش زخمی (قطع قسمت هایی از گیاه)  نیز میزان آلکالوئیدها در بافت‌های در حال رشد افزایش می‌یابد. اما در گیاهانی که بیش از 50  درصد زیتوده از آن‌ها جدا شده است میزان آلکالوئیدهای گیاه کاهش می‌یابد (39). در گیاهان پریوش که تحت تنش آب دریا قرار گرفته بودند و نسبت جذب سدیم به پتاسیم در آن‌ها افزایش یافته بود مشاهده شد میزان آلکالوئیدهای وین‌بلاستین، وین‌کریستین، وین‌دولین و کاتارانتین افزایش یافت (40). در این تحقیق غلظت صفر میکرومولار مقدار آلکالوئیدهای کل نسبت به شاهـد کاهش یافته

است اما این کاهش معنی‌دار نبوده است.

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر مقدار و فعالیت آنتی‌اکسیدانی کل

DPPH یک رادیکال آزاد پایدار با اتم مرکزی نیتروژن بوده که با احیا توسط فرایندهای گرفتن هیدروژن یا الکترون، رنگ آن از ارغوانی به زرد تبدیل می‌شود. ترکیب‌هایی که قابلیت انجام این عمل را دارند به‏عنوان یک آنتی‌اکسیدان مطرح می‌شوند. افزایش میزان I% (درصد تخریب رادیکال آزاد) همراه با تنش روی به این معنی است که با افزایش شدت تنش مقدار آنتی‌اکسیدان بیشتری تولید شده و رادیکال‌های DPPH بیشتری را تخریب کرده است. مطابق با گفته‌های بالا گیاهان از طریق سیستم دفاعی آنتی‌اکسیدانی در برابر آسیب‌های ناشی از تنش از خود محافظت می‌کنند. به‏عنوان مثال فعالیت تخریب رادیکال DPPH در گیاه برنج تحت تنش گرما (2)  و در گیاه Cakile maritime تحت تنش شوری به‏طور معنی‌داری نسبت به گیاهان شاهد افزایش یافت (41). به‏کارگیری سیلیکون و شوری به صورت جدا بر روی گیاهSorghum bicolor فعالیت تخریب رادیکال DPPH را نسبت به گیاهان شاهد افزایش داد (42). در غلظت صفر میکرومولار نانواکسیدروی میزان I% نسبت به شاهد کاهش را نشان داد و این کاهش نسبت به شاهد معنی‌دار بوده است. همانطور که ذکر شد با افزایش درصد رادیکال‌های آزاد مقدار DPPH در گیاهان افزایش می‌یابد (43). در تیمار صفر مقدار رادیکال آزاد کمتری تولید شده، در نتیجه تخریب رادیکال آزاد نیز کمتر صورت گرفته است و در نهایت میزا نI%  کاهش یافته است.

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر مقدار و فعالیت آنتی‌اکسیدانی سوپراکسیددیسموتاز

در مطالعه حاضر میزان فعالیت SOD با افزایش شدت تنش افزایش یافته است و این افزایش در غلظت 15 میکرومولار نانواکسید‌روی نسبت به شاهد در سطح 05 درصد معنی‌دار بوده است. فراوان‌ترین ایزوزیم سوپراکسید‌دیسموتاز در گیاهان عالی، نوع واجد روی و مس (Cu/Zn SOD) است که در آن روی نقش ساختاری و مس نقش کاتالیتیکی دارد روی به‏همراه مس بخش اصلی آنزیم سوپراکسیددیسموتاز را به‏عنوان جاروب کننده رادیکال‌های آزاد تشکیل می‌دهد. با افزودن روی تولید اکسیژن رادیواکتیو و مراحل فتواکسیداسیون کاهش پیدا می‌کند زیرا فعالیت سوپراکسیددیسموتاز در حضور روی افزایش می‌یابد (44). مشاهده شده است تحت شرایط تنش روی میزان فعالیت SOD در گیاه توت alba Murus افزایش می‌یابد (45). در این آزمایش در غلظت صفر میکرومولار نانو اکسیدروی 19 درصد فعالیت SOD نسبت به شاهد کاهش یافته است اما این کاهش نسبت به شاهد معنی دار نبوده است.

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر مقدار و فعالیت آنتی‌اکسیدان کاتالاز

با افزایش شدت تنش روی آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی از جمله کاتالاز افزایش می‌یابد (46). کاتالاز آنزیم مهمی است که در سیستم دفاعی برای تبدیل H2O2 به H2O و O2 به‏کار می‌رود. بدین شکل از تولیدROS ‌ها جلوگیری می‌نماید و بنابراین، با بالا رفتن سطوح فعالیت این آنزیم گیاه کمتر مورد تهاجم ROS‌ها قرار می‌گیرد. افزایش میزان فعالیت آنزیم کاتالاز در غلظت‌های بالای روی در گیاه ذرت ) Zea mays) نیز به اثبات رسیده است (47). در آزمایشی بر روی گیاه داروییFogopyrum esculentom تحت تیمارهای مختلف نانواکسیدروی مشاهده شدکه میزان فعالیت این آنزیم تا غلظت‌های بالای 100 میلی‏گرم بر لیتر افزایش می‌یابد (48). در این آزمایش در غلظت صفر میکرومولار نانواکسیدروی 35 درصد فعالیت CAT نسبت به شاهد کاهش یافته است اما این کاهش نسبت به شاهد معنی‏دار نبوده است.

اثر غلظت‌های مختلف نانواکسیدروی بر مقدار و فعالیت آنتی‌اکسیدان گایاکول‌پراکسیداز

در مطالعه حاضر میزان فعالیت GPX با افزایش شدت تنش افزایش یافته است و این افزایش نسبت به شاهد در سطح 1/0 درصد معنی‌دار بوده است. در تنش روی با افزایش غلظت روی میزان فعالیت گایاکول‌پراکسیداز در بسیاری از گونه‌های گیاهی افزایش می‌یابد در آزمایش‏ها انجام شده بر روی گیاه ذرت ) Zea mays) مشاهده شده است که با افزایش شدت تنش روی میزان فعالیت گایاکول‌پراکسیداز افزایش می‌یابد (46). در این مطالعه در غلظت صفر میکرومولار روی فعالیت گایاکول‌پراکسیداز کاهش یافته است و این کاهش نسبت به نمونه شاهد معنی‌دار است. اخیرا گزارش شده است در شرایط کمبود روی در گونه‌های گندم ، لوبیا و برنج  فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدان کاهش یافته است (48).

 

نتیجه گیری

با توجه به این موضوع که مقدار پرولین در طی تنش افزایش می‌یابد مشاهده می‌شود که در این آزمایش نیز با افزایش غلظت، جذب روی در مقیاس نانو بیشتر صورت گرفته،  تنش روی ایجاد شده است و با افزایش شدت تنش میزان آلکالوئیدهای کل و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانی نیز افزایش یافته است.

 

تشکر و قدردانی

از حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک که حمایت مالی و اجرایی این تحقیق را به‏عهده داشتند صمیمانه تشکر و قدردانی می‌شود.

1. Bonnet M, Camares O, Veisseire P. Effect of Zinc and influence of Acremonium Lolli on growth parameters, chlorophyll a fluorescence and antioxidant enzyme activity ofryegrass. Expremental botany . 2005; 51: 945–953.

2. Kang HM, Saltiveit ME. Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling (leaves and roots) and differentially affected by salicylic acid. Physiologia Plantarum. 2002; 115(15): 577-576.

3. Apel K, Hirt H.Reactive oxygen species: Metabolism, oxidative stress, and signal transduction. Plant Biology. 2004; 55: 373-379.

4. Weckx JE J, Clijsters H.Zn phytotoxicity induces oxidative stress in primary leaves of Phaseolus vulgaris. Plant Physiol and Biochemistry. 1997; 35(5): 405–410.

5. Galligo SM, Benavides MP, Tomoro ML. Effect of Cd ions on antioxidant   defense system in sunflower cotyledons. Plant Biology. 1999; 42:  49-55.

6. Kersie BD, Leshem Y. Stress and Stress Coping in Cultivated Plants. Kluwer Academic Publish. 1994;1-180.

7. Andreta E. Nanosciences and nanotechnologies: what future for research. Future Conference and Expo, Chiba-shi, Chiba, Tokyo. 2003.

8. Yilmaz A, Ekis H, Cakmak I. Effect of different zinc application methods on grain yield and zinc concentration in wheat. Plant Nutrition. 1997; 20:461-471.

9. Hong, W, Ji-Yun J. Effects of zinc deficiency and drought on plant growth and metabolism of reactive oxygen species in maize (Zea mays L.). Agricultural Sciences in China. 2007; 6(8): 988-995.

 

10. Verma TS, Neue HU. Effect of soil salinity and zinc application on electrochemical and chemical kinetics and growth and yield of rice. Commun. Soil Science. 1984; 15: 553-571.

11. Gupta VK, Dabas DS. Efficiency of sparingly soluble and chelated zinc sources on yield, nutrient composition and nutrient ratio in berseem. Tropical Agricultural Science. 1983; 1:73-80.

12. Chaney RL. Zinc phytotoxicity. In: Robson AD, ed. Zinc in soil and plants. Dordrecht, the Netherlands: Kluwer Academic Publishers. 1993; 135–150.

13. Rosen JA, Pike CS, Golden ML. Zinc, iron and chlorophyll metabolism in Zinc toxic Corn. Plant Physiology. 1977; 59(6): 1085–1087.

14. Ming C, Yin CR. Effect of Mn and Zn-fertilizers on nutrient balance anddeficiency diagnosis of winter wheat crop in pot experiment. International Symposium on the Role of Sulphur, Magnesium, and Micronutreints in Balance. Plant Nutrition. 1992; 369-379.

15. Huxter TJ, Thorpe TA, ReidDM. Shoot initiation in light- and dark-grown tobacco callus: The role of ethylene. Physiol. Plantarum. 1981; 53(3): 319-326.

16. Prasad T NVKV, Sudhakar P, Sreenivasulu Y, Latha P, et al. Effect of nanoscale zinc oxide particles on the germination, growth and yield of Peanut. Journal of Plant Nutr .2012; 35(6): 905-927.

17. Kamkar A, Shariatifar N, Jamshidi AH, Mohammadian M. investigated the antioxidant Aqueous, methanol and ethanol cumin and Blghst in vitro. Journal of Medical Sciences and Health Services Gonabad.1389; 16(2): 45-3

18. Giannopolitis CN, Ries SK. Superoxide dismutases: I. occurrence in higher plants. Plant Physiol. 1977; 59(2): 309-314.

19. Cakmak I, Marschner H. Manesium deficiency and high light inensity enhance activities of superoxide dismutase, ascrobate peroxidase, and glutatione reductase in bean leaves. Plant Physiology. 1992; 98(4): 1222-1227.

20. Bates LS, Waldron RP, Teare ID. Rapid determination of free proline for water-stress studied. Plant and soil.1973; 39: 205-207.

21. Ataei-Azimi A, Delnavaz Hashemloian B, Ebrahimzadeh H, Majd A. High in vitro production of ant-canceric indole alkaloids from periwinkle (Catharanthus roseus) tissue culture. African Journal of Biotechnology. 2008;7(16): 2834-2839

22. Barcelo J, Poschenrieder C. Structural and ultrastructural changes in heavy metal exposed plants. In: Prasad MNV (eds) Heavy metal stress in plants, 3rd edn. Springer, Berlin 2004; 223–248.

23. Luderid D, Hofte H, Himelblau E, Chrispeels M. The expression pattern of the tono plast intrinsic protein Y- TLP in Arabidopsisthaliana is correlated with cell enlargement. Plant Physiology. 1992; 100: 1633 1639.

24. Mahajan P, Dhoke SK, Khanna AS. Effect of Nano-ZnO Particle Suspension on Growth of Mung (Vigna radiata) andGram (Cicer arietinum) Seedlings Using Plant AgarMethod. Journal of Nanotechnology. 2011; 2-7.

25. Lin D, Xing B. Root uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticles. Environmental Science Technology. 2008; 42(15): 5580–5585.

26. Fournier JMA, Rolda´n NM, Sanchez C, Ghinas A, et al. K+ starvation increases water uptake in whole sunflower plants. Plant Sci. 2005 ;168 : 823–829.

27. Fiskesjo G. Allium test for screening chemicals: Evaluation of cytological parameters. Plants for Environmental Studies. 1997; 101: 307-333.

28. Zhi-xin Y, Shu-qing L, Da-wei Zh, Sheng-dong F. Effects of cadium, zinc and lead on soil enzyme activities. Journal of EnvironmentalSciences. 2006;  6: 1135- 1141.

29 .Siripornadulsil S, Traina S,Verma DS, Sayre RT. Molecular mechanisms of proline – mediated tolerance to toxic Heavy metals in transgenic microalgae . Plant Cell. 2002; 14: 2837-2847.

30. Alia P, Saradhi P, Mohanty P. Involvement of proline in protecting thylakoid membranes against free radical-induced photodamage. J. Photochem. Photobiol. B. 1997; 38: 253-257.

31. Taylor CB. Prolin and water deficit:Ups down ins and outs. Plant Cell. 1968; 8: 1221-1224.

32. Matysik J, Alia Bhalu B, mohanty P. Molecular mechanisms of quenching of reactive oxygen species by proline under stress in plants. current science. 2002; 82: 525-532.

33. Shah K, Dubey RS. Effect of cadmium on prolin accumulation and ribonuclease activity in rice seedling :Role of proline as a possible enzyme protectant. Biol. Plant. 1998; 40:121-130.

34. LlamasA, Ullrich CI, Sanz A. Cadmium effects on transmembrance electrical potential difference,respiration and membrane permeability of rice (Oryza sativa ) roots. Plant and Soil .2000; 219: 21-28.

35. Schat H, Sharma SS, Vooijs R. Heavy metalinduced accumulation of free proline in a metaltolerant and non-tolerant ecotype of Silene vulgaris. Physiol. Plantar. 1997; 101: 477–482.

36. Waller GR. Enviromental influences on alkaloid production. Alkaloid Biology and Metabolism in plant. New York. 1978; 1-6.

37. Srivastava NK,  Srivastava AK. Influence of Some Heavy Metals on Growth, Alkaloid Content and Composition in Catharanthus roseus L.ndian J Pharm Sci. 2010; 72(6): 775–778.

38. Abdul Jaleel C, Manivannan P,  Sankar B,  Kishorekumar A, et al. Pseudomonas fluorescens enhances biomass yield and ajmalicine production in Catharanthus roseus under water deficit stress. tress Physiology Lab, Department of Botany, Annamalai University, Annamalainagar. 2007; 002:1-6.

39. Peter M, Frischknecht  M, Thomas W. Effect of drought and wounding stress on indole alkaloid formation in Catharanthus roseus. Plant Biology. 1987; 26(3):707-710.

40. Jing-Yan W,  Zhao-Pu L. Alkaloid Accumulation in Catharanthus roseus Increases with Addition of Seawater Salts to the Nutrient Solution College of Resources and Environmental Sciences. 2010; 20(6):718-724.

41. Ksouri R, Megdiche W, Debez A, Falleh H, et al. Salinity effects on polyphenol content and antioxidant activities in leaves of the halophyte Cakile maritima. Plant Physiology and Biochemistry. 2007; 45: 244-249.

42. Kafi M, Nabati J, Masoumi A, Mehrgerdi MZ. Effect of salinity and silicon application on oxidative damage of sorghum [Sorcgum bicolor (L.) monech.]. Pakistan gournal of Botany. 2011; 43(5): 2457-2462.

43. Mon MM, Maw SS, Oo ZK. Quantitative Determination of Free Radical Scavenging Activity and Anti-tumor Activity of Some Myanmar Herbal Plants. World Academy of Science, Engineering and Technology. 2011; 51(2): 523-529.

44. Lo´pez-Milla´n AF, Ellis DR, Grusak A. Effect of zinc and manganese supply on the activities of superoxide dismutase and carbonic anhydrase in Medicago truncatula wild type and raz mutant plants. Plant Science. 2005; 168: 1015–1022.

45. Tewari RK, Kumar P, Sharma, PN. Morphology and physiology of zinc stressd mulberry plants . J. Plant Nutr. Soil Sci. 2008; 171: 286-294.

46. Hosseini Z, Poorakbar L. Zinc toxicity on antioxidative response in (Zea mays L.) at two different pH. Journal of Stress Physiology and Biochemistry. 2013; 9 (1): 66-73

47. Lee S, Kim S, Kim S, Lee I. Assement of phytoxicity if ZnO NPs on a medicinal plant, Fogopyrum esculentom.Environ Sci pollut Res. 2012; 10: 8-12.

48. Pandey N, Gupta B, Pathak C. Antioxidant responses of Pea Genotypes to zinc deficiency. Journal of plant physiology. 2012; 59(2): 195-205.