افزایش تولید تری گونلین تحت تاثیر سالیسیلیک اسید در کشت سلولی شنبلیله (Trigonella foenum-graecum)

نویسندگان

1 دانشگاه زابل، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، زابل، ایران

2 دانشگاه شاهد، دانشکده کشاورزی، گروه بیوتکنولوژی، تهران، ایران

چکیده

هدف: دست‏ورزی محیط‏های کشت سلولی با الیسیتورها یکی از راه کارهای مهم جهت القای متابولیسم ثانوی و تولید متابولیت‏های ارزشمند می‏باشد. سالیسیلیک اسید به‏عنوان یک الیسیتور غیر زیستی در افزایش تولید متابولیت‏های دارویی موثر است. هدف این مطالعه بررسی اثر سالیسیلیک اسید بر رشد، برخی از شاخص‏های فیزیولوژیک و تولید تری‏گونلین در کشت سلولی شنبلیله است. مواد و روش‏ها: کشت سلولی از قطعات جداکشت هیپوکوتیل شنبلیله روی محیط کشت جامد MS دارای نفتالن استیک اسید (4/0 میلی‏گرم در لیتر) و بنزیل آدنین (4/0 میلی‏گرم در لیتر) به‏دست آمد. سالیسیلیک اسید با غلظت‏های 5/12، 25 و 50 میلی‏گرم در لیتر استفاده شد. سپس واکنش سلول‏ها در ارتباط با تولید تری‏گونلین و دیگر شاخص‏های فیزیولوژیک پس از گذشت یک هفته از اعمال تیمار بررسی شد. نتایج: نتایج نشان داد که رشد سلولی و زنده مانی سلول‏ها تحت اثر تیمارها نسبت به شاهد کاهش یافته است. مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی در سلول‏ها نسبت به شاهد تحت اثر تیمارها افزایش یافت. کلیه تیمارها باعث افزایش تولید تری‏گونلین و فنل کل شدند. تیمار سلول‏ها با غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان تری‏گونلین به‏میزان دو برابر شاهد شد. نتیجه گیری: سالیسیلیک اسید می‏تواند به‏عنوان محرک در کشت سلولی شنبلیله به‏کار رود و باعث القای تولید بیشتر تری‏گونلین شود. واژگان کلیدی:

کلیدواژه‌ها


مقدمه

شنبلیله (Trigonella foenum-graecum) گیاهی از تیره بقولات (Fabaceae)  است که بومی ایران بوده، در بیشتر نواحی ایران از جمله آذربایجان، اصفهان، فارس، خراسان، سمنان و دامغان می‌روید و به‏عنوان سبزی خوراکی کشت و مصرف می‌شود. شنبلیله دارای خواص ضد دیابتی، ضد سرطان، ضد میکروبی و کاهنده قندخون می‏باشد (1). خواص دارویی شنبلیله به‏دلیل وجود ترکیبات استروئیدی، ترکیبات نیتروژن‏دار، پلی فنل، ترکیبات فرار، آمینو اسید و... موجود در آن می‏باشد (2). دانه‏های شنبلیله دارای  45 تا 60 درصد قند، 20 تا 30 پروتئین، 5 تا 10 درصد لیپید، آلکالوئید تری‏گونلین (2/0تا 3/0 درصد)، آمینو اسیدهای آزاد و روغن‏های فرار می‏باشد (3 و 4).  به‏طور کلی، شنبلیله دارای دو ترکیب شیمیایی مهم با خواص دارویی است: 1) دیوسجنین، یک ترکیب ساپونین استروئیدی و 2) تری‏گونلین، یک ترکیب آلکالوئیدی. دیوسجنین و تری گونلین در دانه‏ها و برگ‏های شنبلیله دارای خواص ضد دیابتی و هایپوگلایسمیک است. تری‏گونلین یا N- متیل نیکوتینیک اسید، متابولیت ثانوی مشتق شده از نوکلئوتیدهای پیریدین است. تری گونلین ترکیب فعال فیزیولوژیکی در گیاهان است که القا کننده حرکات برگ‏ها می‏باشد  و در زمان تنش در گیاه تجمع می یابد و به‏عنوان یک محافظ اسمزی عمل می‏کند (4). علاوه بر این به‏عنوان یک هورمون در کنترل چرخه سلولی عمل می‏کند. این ترکیب اولین بار از Trigonella foenum-graecum استخراج شد (5) و بعدها در بسیاری از گیاهان مانند قهوه، سویا، سیب زمینی، نخود فرنگی شناسایی شد (6). با توجه به اهمیت دارویی این ترکیب و افزایش تقاضا، تولید بیشتر آن حائز اهمیت می باشد. یکی از روش­هایی که امروزه بیش از هر موضوع دیگر در زمینه بررسی متابولیت‏های گیاهی مورد توجه قرار دارد، روش کشت اندام، بافت و سلول گیاهی است (1). پژوهش‏گران با استفاده از این روش سعی کرده‏اند تا تولید متابولیت‏های ثانوی با ارزش در گیاهان را افزایش دهند. در کشت بافت می‏توان متابولیت‏هایی مانند آلکالوئید‏ها را مستقل از عواملی مثل آب و هوا و شرایط جغرافیایی تولید نمود. به‏طور خاص کشت تعلیقی سلول­های گیاهی هم‏گام با  افزایش سرعت رشد آن‏ها سبب افزایش انباشتگی متابولیت‏های مورد نظر در یک دوره زمانی کوتاه می‏گردد (7). در کشت کالوس گیاه شنبلیله  Trigonella foenum-graecum میزان آلکالوئید تری‏گونلین به‏میزان 3 تا 4 برابر بیشتر از میزان موجود در دانه‏های این گیاه و همچنین 12 تا 13 برابر بیشتر از میزان تولید شده در ریشه و اندام هوایی آن گزارش شده است (8). علاوه بر این، میزان بالاتر این آلکالوئید در کشت سلول این گیاه گزارش شده است (8). روش‏های متعددی برای افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی در کشت سلول استفاده می‏شود (9). یکی از روش‏های افزایش تولید متابولیت‏های ثانوی در کشت درشیشه (in vitro) استفاده از الیسیتورها می‏باشد. الیسیتورها ترکیباتی با منشا زیستی و یا غیر زیستی هستند که از طریق القای سیستم دفاعی باعث بیوسنتز و انباشت متابولیت‏های ثانوی می‏شوند (10). الیسیتورهای غیر زیستی مانند اشعه ماوراء‏بنفش، نمک فلزات سنگین و بعضی از ترکیبات شیمیایی مانند جاسمونیک اسید و سالیسیلیک اسید نیز به‏منظور افزایش تولید این ترکیبات درکشت بافت مورد بررسی قرار گرفته‏اند. ترکیباتی مانند سالیسیلیک اسید و جاسمونیک اسید از مولکول­های تاثیرگذار در مسیر علامت­رسانی تنش­ها می­باشند و به‏طور گسترده­ای در این زمینه روی آن‏ها مطالعه شده است (11). نقش سالیسیلک اسید بر بردباری گیاه نسبت به بیماری­زاها و سایر عوامل تنش­زا به‏خوبی شناخته شده است. به تازگی نقش آن به­عنوان یک ترکیب پیام رسان در فعال کردن پاسخ­های دفاعی گیاهان پررنگ­تر شده است (11). به‏علت نقشی که سالیسیلیک اسید به‏عنوان یک محرک دارد و باعث افزایش بیان ژن­های مسیرهای بیوسنتزی متابولیت‏های ثانوی می‏شود، مورد توجه ویژه­ای قرار گرفته است (12). مطالعات متعددی نشان داده‏اند که سالیسیلیک اسید در تحریک تولید بسیاری از متابولیت‏های ثانوی همچون ترپنوئیدها، مشتقات کومارین، آلکالوئیدها و فلاونوئیدها موثر می‏باشد (13). جستجو در منابع نشان می‏دهد که تاکنون مطالعاتی درباره اثر سالیسیلیک اسید بر میزان متابولیت‏های ثانوی در کشت سلولی Trigonella foenum-graecum صورت نگرفته است. در این پژوهش اثر سالیسیلیک اسید بر رشد سلول و میزان تری‏گونلین و برخی شاخص‏های بیوشیمیایی در کشت سلولی شنبلیله بررسی شد. میزان ترکیبات فنلی دارای مسیر بیوسنتزی مشترک با تری‏گونلین که نقش دفاعی نیز دارند، مورد بررسی قرار گرفت تا ارتباط مسیر­های متابولیسمی گیاه مشخص شود.

  موادوروش‏ها

القایتولیدکالوسوراه اندازیکشتسلولی: برای القای کالوس مناسب، از هیپوکوتیل گیاهچه‏های شنبلیله به‏عنوان قطعات جدا کشت استفاده گردید. قطعات جدا کشت به محیط کشت MS پایه، حاوی NAA (4/0 میلی‏گرم در لیتر) و BA (4/0 میلی‏گرم در لیتر) منتقل شدند. پس از گذشت 2 هفته القای کالوس شروع شد. برای تهیه کشت تعلیقی 2 گرم کالوس نرم، سفید و هم سن، به 50 میلی‏لیتر محیط کشت MS با ترکیبات هورمونی یاد شده بدون آگار اضافه شد و روی شیکر با سرعت 120 دور در دقیقه در دمای 25 درجه سانتی‏گراد در تاریکی نگه‏داری شد و هر دو هفته یک‏بار واکشت گردید.

تیمار سلول ها با سالیسیلیک اسید: برای انجام این مرحله از تحقیق، ابتدا به‏منظور ایجاد یک کشت همگن و یکنواخت، کشت سلولی تهیه شده در مرحله قبل، چندین  بار واکشت شد. در هر مرحله سلول‏ها با استفاده از قیف بوخنر و در شرایط مکش جمع آوری شدند و به محیط تازه منتقل گردیدند .قبل از اعمال تیمار، دوره رشد برای سلول‏ها تعیین گردید. بدین منظور پس از انتقال یاخته‏ها به محیط جدید از روز اول تا 23 روز پس از انتقال، به فاصله زمانی دو روز، نمونه‏برداری انجام و بر اساس وزن تر سلول ها، منحنی رشد تعیین گردید. با توجه به منحنی رشد به‏دست آمده، در روز چهاردهم سلول‏‏ها به‏طور جداگانه با غلظت‏های 5/12، 25 و 50 میلی‏گرم در لیتر سالیسیلیک اسید تیمار شدند. واکنش سلول‏ها در ارتباط با تولید تری گونلین، ترکیبات فنلی، مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی پس از گذشت یک هفته از اعمال تیمار مورد ارزیابی قرار گرفت. لازم به ذکر است که سلول‏ها پس از برداشت توسط ازت مایع منجمد شده، در دمای 80- درجه سانتی‏گراد تا زمان اندازه‏گیری شاخص های فیزیولوژیک نگه‏داری شدند. 

اندازه‏گیری رشد سلولی وتعیین توان زیستی سلول‏ها: رشد سلولی با اندازه‏گیری افزایش  وزن خشک آن‏ها تعیین شد. بدین منظور سلول‏ها از محیط کشت جدا شدند و به‏مدت 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتی‏گراد خشک و سپس توزین گردیدند. برای تعیین توان زیستی، از اوانس بلو (Evans blue) استفاده شد (14). بدین‏صورت که در زمان برداشت سلول‏ها، یک قطره از کشت تعلیقی حاوی سلول بر روی لام قرار داده شد، سپس یک قطره از محلول آبی اوانز بلو (1/0 درصد) به آن اضافه شد و پس از گذشت سه الی چهار دقیقه با آب مقطر شسته شد و در زیر میکروسکوپ نوری مشاهده گردید. سلول‏هایی که کاملا به‏رنگ آبی در آمده بودند و سلول‏هایی که فقط دیواره آن‏ها رنگ آبی به‏خود گرفته بود به‏ترتیب سلول‏های مرده و زنده در نظر گرفته شد. با شمارش سلول‏های زنده و مرده و محاسبه کل آن‏ها درصد توان زیستی سلول‏ها تعیین گردید.

تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدها: مقدار مالون دی آلدیید (MDA) به‏عنوان فرآورده نهایی پراکسیداسیون لیپیدهای غشا به‏روش De Vos و همکاران (15) اندازه‏گیری شد. بدین منظور 200 میلی گرم از سلول‏های منجمد با سه میلی‏لیتر تری کلرو استیک اسید (TCA) 10 درصد سائیده شد. پس از همگن سازی نمونه‏ها ، سانتریفوژ (rpm12000‏، به‏مدت 15 دقیقه) شدند. به یک میلی‏لیتر از نمونه­های صاف شده، یک میلی‏لیتر تیو باربیتوریک اسید 25/0 درصد اضافه گردید و به‏مدت نیم ساعت در دمای  100 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند. پس از قرار دادن نمونه­ها در حمام یخ، در طول موج 532 و 600 نانومتر جذب آن‏ها اندازه‏گیری گردید. مقدارMDA به‏کمک ضریب خاموشی /mM/cm  155 محاسبه گردید.

اندازه گیری پراکسید هیدروژن: مقدار پراکسید هیدروژن بر اساس روش (16) سنجیده شد. بدین منظور 200 میلی‏گرم توده سلولی منجمد با 5 میلی‏لیتر تری‏کلرو استیک اسید ساییده شد. نمونه‏ها پس از همگن سازی، سانتریفوژ (rpm12000، به‏مدت 15 دقیقه) شدند. به 5/0 میلی‏لیتر از روشناور، 5/0 میلی‏لیتر بافر فسفات پتاسیم (10 میلی‏مولار، 7pH= ) و یک میلی‏لیتر یدید پتاسیم (KI) اضافه شد و جذب آن در طول موج 390 نانومتر یادداشت شد. با استفاده از منحنی استاندارد مقدار پراکسید هیدروژن محاسبه گردید.

اندازه گیری میزان فنل کل: میزان ترکیبات فنلی کل بر اساس روش رنگ سنجی فولین-سیوکالتیو (17) و بر حسب منحنی استاندارد گالیک اسید در طول موج 765 نانومتر اندازه‏گیری شد. ابتدا 05/0 گرم از سلول‏های منجمد در 3 میلی‏لیتر متانول 80 درصد همگن گردید و به‏مدت 3 ساعت در بن ماری با دمای 70 درجه سانتی‏گراد قرار  گرفت. سپس به‏مدت 15 دقیقه سانتریفوژ و عصاره متانولی از رسوب جدا شد. به 50 میکرولیتر عصاره متانولی، 500 میکرولیتر محلول فولین-سیوکالتیو اضافه شد. به مخلوط حاصل پس از 5 دقیقه 500 میکرولیتر محلول سدیم کربنات 7 درصد اضافه و جذب پس از 10 دقیقه در طول موج 765 نانومتر خوانده شد.

استخراج و اندازه گیری تری گونلین: کالوس‏های برداشت شده پس از خشک شدن در دمای آزمایشگاه برای سنجش میزان ماده موثره تری‏گونلین استفاده شدند. 2/0 گرم از سلول‏های خشک، پودر شده و  با 10 میلی‏لیتر متانول توسط حمام اولتراسونیک به‏مدت نیم ساعت سونیکت شدند. سپس مخلوط به‏دست آمده به‏مدت 10 دقیقه با سرعت 5000 دور در دقیقه سانتریفوژ گردید. سوپرناتانت جدا و تبخیر گردید و ماده خشک باقیمانده در 2 میلی‏لیتر متانول حل شد و در یخچال در دمای حدودا 4 درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شد. برای تعیین مقدار تری‏گونلین از روش Rongjie و همکاران (18) به‏کمک دستگاه HPLC (Knauer, Germany) با دکتورUV استفاده شد. ستون مورد استفاده (C18, 25 Cm x 4.6 mm I.D., 5 µm)، فاز متحرک استونیتریل: آب (10:90) با شارش 1 میلی‏لیتر در دقیقه و طول موج مورد استفاده 263 نانومتر بود. شناسایی و اندازه‏گیری تری‏گونلین به‏کمک مقایسه زمان بازداری نمونه‏ها با ماده استاندارد (سیگما) صورت گرفت.

تجزیهوتحلیلآماری 

همه آزمایش‏ها با 3 تکرار از حداقل 3 نمونه مستقل انجام گرفت. مقایسه میانگین‏ها با استفاده از نرم افزار SPSS           نسخه 18 و آزمون دانکن برای تعیین معنی‏دار بودن تفاوت‏ها در سطح احتمال 5 درصد انجام شد.

 

نتایج

تعیینمنحنیرشدسلول

پیش از اعمال تیمار مورد نظر، میزان رشد سلول‏ها در مدت 23 روز در کشت تعلیقی بررسی شد (شکل 1). نتایج نشان داد که پس از کشت، میزان سلول‏ها افزایش یافته، که این روند تا روز نهم ادامه دارد. پس از این زمان وزن کاهش می‏یابد. شیب رشد یاخته ای در روز چهاردهم افزایشی بود که در این زمان سلول‏ها در اواسط دوره نمایی  رشد بوده، به شدت در حال تقسیم هستند. در این زمان حجم توده سلولی به‏میزان مناسبی رسیده، بنابراین روز چهاردهم به‏عنوان زمان افزودن تیمار انتخاب گردید.

 

 

شکل1:  منحنیرشدسلولیدرکشتسلولیشنبلیلهدر محیط کشت MS.

 

 

اثر سالیسیلیک اسید بر رشد و توان زیستی سلول‏ها

اثر سالیسیلیک اسید روی رشد و زنده مانی سلول‏های شنبلیله در شکل‏های ۲، الف و ۲، ب نشان داده شده است. نتایج نشان داد که غلظت‏های مختلف سالیسیلیک اسید به‏طور معنی‏داری (در سطح 05/0 p ≤) رشد سلولی را کاهش داد. با افزایش غلظت، رشد کاهش بیشتری نشان داد، به‏طوری‏که غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر میزان رشد را به‏میزان 40 درصد کاهش داد. زنده مانی سلول‏ها در تمامی غلظت‏ها به‏طور معنی‏داری کمتر از نمونه‏های شاهد بود. تفاوت معنی‏داری بین غلظت‏های 25 و 50 میلی گرم بر لیتر مشاهده نشد. بیشترین میزان کاهش زنده مانی سلول‏ها در غلظت 50 میلی‏گرم بر‏ لیتر  به‏میزان 22 درصد نسبت به نمونه‏های شاهد مشاهده شد.

 

  

شکل 2: اثر سالیسیلیک اسید روی الف) وزن خشک و ب) زنده مانی در کشت سلولی شنبلیله.مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

اثر سالیسیلیک اسید بر مقدار پراکسید هیدروژن و پراکسیداسیون لیپیدها

مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی که به‏عنوان شاخصی از تنش می‏باشد، نیز تحت تاثیر کلیه تیمارها نسبت به شاهد افزایش معنی‏داری نشان داد (شکل 3، الف). بیشترین مقدار این پارامتر در غلظت 50 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده شد. همانطوری‏که شکل 3، ب نشان می‏دهد غلظت‏های 25 و 50 میلی گرم بر لیتر باعث افزایش معنی‏دار (در سطح 05/0p ≤) مقدار پراکسید هیدروژن سلول‏های شنبلیله در مقایسه با شاهد گردیده است. تفاوت معنی‏داری در نمونه‏های شاهد و غلظت 5/12 میلی‏گرم مشاهده نشد.

 

 

   

شکل 3: اثر سالیسیلیک اسید روی الف) مقدار مالون دی آلدیید، ب) مقدار پراکسید هیدروژن در کشت سلولی شنبلیله. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند. 

 

 

اثر سالیسیلیک اسید برمیزان فنل کل

میزان فنل کل در تیمارها به استثنای غلظت 5/12 میلی‏گرم به‏طور معنی داری نسبت به شاهد افزایش یافت. تفاوت معنی‏داری در میزان فنل کل در غلظت‏های 25 و 50 میلی‏گرم بر لیتر مشاهده نشد ( شکل 4).

 

اثر سالیسیلیک اسید بر میزان تری‏گونلین

نتایج بررسی تری گونلین نشان داد که غلظت‏های 25 و 50 میلی‏گرم بر لیتر سالیسیلیک اسید میزان تری‏گونلین را به‏طور معنی‏داری به‏میزان 2 برابر، نمونه‏های شاهد افزایش داد. میزان تری‏گونلین در غلظت 5/12 میلی‏گرم بر لیتر نیز به‏طور معنی‏داری افزایش یافت که البته قابل توجه نبود (شکل 5).

 

 

شکل 4: اثر سالیسیلیک اسید روی میزان فنل کل. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند. 

 

 

شکل 5: اثر سالیسیلیک اسید بر میزان تری‏گونلین. مقادیر نشان داده شده میانگین 3 تکرار وSE  ± (انحراف معیار) می‏باشد. میانگین‏های دارای حرف مشترک از نظر آماری در سطح 5 درصد تفاوت معنی‏دار ندارند.

 

 

بحث

مطالعات متعددی نشان داده‏اند که سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان برخی از متابولیت‏های ثانوی به‏ویژه آن‏هایی که در ساز و کار­های دفاعی گیاه نقش دارند، می‏شود (19). در پژوهش حاضر، اثر سالیسیلیک اسید بر رشد سلول و میزان تری‏گونلین و برخی شاخص‏های فیزیولوژیک بررسی شد.  تاثیر سالیسیلیک اسید به عواملی نظیر گونه، مرحله نموی گیاه، نحوه اعمال تیمار و غلظت آن وابسته می‏باشد. اسید سالیسیلیک در غلظت­های بالاتر وضعیت اکسایشی گیاه را بیش از حد توان گیاه تحت تاثیر قرار می دهد و در  نهایت منجر به مرگ گیاه می‏شود (20). مهار رشد و کاهش زنده مانی، در نتیجه زوال تمامیت سلولی و تخریب غشاهای سلولی است که توسط سالیسیلیک اسید القا می‏شود. در پژوهش حاضر، رشد و زنده مانی سلول‏ها تحت تاثیر غلظت‏های مورد استفاده در این پژوهش به‏طور معنی‏داری کاهش یافت. با توجه به رابطه معکوس بین رشد یا تولید زیتوده و تجمع متابولیت‏های ثانوی، مهار رشد سلولی توسط سالیسیلیک اسید ممکن است که سنتز متابولیت‏های ثانوی را القا نماید. با توجه به نتایج به‏دست آمده، مهار رشد سلول‏ها توسط سالیسیلیک اسید، منجر به تولید بیشتر تری‏گونلین گردید (شکل 5)، که به‏نظر می‏رسد به‏دلیل کاهش متابولیسم اولیه و آغاز متابولیسم ثانوی باشد. با توجه به این که پیش ماد‏ه‏های بیوسنتز متابولیت‏های ثانوی از متابولیسم اولیه منشا می‏گیرند، لذا تحت شرایط تنش شدید، متابولیسم اولیه به‏سمت متابولیسم ثانوی تغییر می‏یابد و منابع ضروری از رشد به سمت دفاع تغییر مسیر می‏دهند (21). گونه‏های فعال اکسیژن یا ROS  (Reactive Oxygen Species)از جمله پراکسید هیدروژن از عوامل مهم در تنش اکسایشی بوده، که به‏طور قابل توجهی رشد سلول و متابولیسم ثانوی را تحت تاثیر قرار می‏دهد. گزارش شده است که سالیسیلیک اسید باعث تولید پراکسید هیدروژن می‏شود (22). مطالعات نشان داده است که بین ROS به‏ویژه پراکسید هیدروژن و مرگ سلولی در گیاهان ارتباط نزدیکی وجود دارد و علاوه بر این ROS از اکسیدکننده‏های قوی بوده که می‏توانند اثرات مخربی روی ماکرومولکول‏های زیستی نظیر DNA و پروتئین‏ها داشته باشند (23). با توجه به اینکه کلیه تیمارها باعث القای تولید پراکسید هیدروژن گردیدند، تصور می‏شود که از این طریق زنده مانی و رشد را کاهش داده اند (شکل‏های 1، الف و 1، ب). یوسف زادی و همکاران (24) مشاهده کردند که با افزایش غلظت سالیسیلیک اسید در کشت سلول کتان سفید (Linum album) مقدار پراکسیداسیون لیپیدهای غشایی افزایش یافت. روند مشاهده شده در تولید MDA تحت اثر تیمارها با روند تغییرات رشد و زنده مانی (شکل‏های 1، الف و 1، ب) مشابه هم است و تصور می‏شود که ارتباط نزدیکی بین افزایش پراکسیداسیون لیپیدها و کاهش رشد و زنده مانی وجود دارد. گیاهان ترکیبات فنلی را در پاسخ به یک‏سری از ترکیبات پیام رسان آزاد می‏سازند، که نقش دفاعی مهمی دارند (25). در انگور، غلظت 150 میکرومول سالیسیلیک اسید باعث افزایش میزان ترکیبات فنلی بعد از هشت ساعت شده است و بعد از 24 ساعت به اوج میزان خود می‏رسد و در نهایت بعد از 48 ساعت کاهش می‏یابد (26). در پژوهش حاضر میزان فنل کل نیز همچون تری‏گونلین تحت تاثیر سالیسیلیک اسید افزایش یافت. گزارش شده است که الیسیتور‏هایی مانند سالیسیلیک اسید و جاسمونات از موثرترین محرک‏های شیمیایی برای تحریک تولید متابولیت‏های ثانوی در گیاهان مختلف بوده است که از طریق فعال کردن بیان ژن‏های مسیر بیوسنتزی متابولیت‏های ثانوی باعث افزایش تولید آن‏ها می‏شوند (10). تاثیر گذاری و القای بیوسنتز متابولیت‏های ثانوی توسط سالیسیلیک اسید خارجی ممکن است با نقش آن به‏عنوان یک علامت رسان مرتبط باشد.

نتیجه گیری

در این پژوهش  نشان داده شد که سالیسیلیک اسید می‏تواند به‏عنوان محرک در کشت سلولی شنبلیله عمل نموده و باعث القای تولید بیشتر تری‏گونلین شود. بنابر‏این به‏نظر می‏رسد تجمع تری‏گونلین در سلول‏های شنبلیله پاسخی زیستی به این محرک باشد.

 

تشکر و قدردانی

 بدین وسیله از معاونت محترم پژوهشی دانشگاه زابل که هزینه این طرح پژوهشی را فراهم نموده‏اند تشکر و قدر‏دانی می‏گردد.

  1. Mehrafarin A, Rezazadeh Sh, Naghdi Badi H, Noormohammadi Gh, et al. A Review on Biology. Cultivation and Biotechnology of Fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.) as a Valuable Medicinal Plant and Multipurpose. J Medicinal plants. 2011; 10(37): 1-19.
  2. Fazli F, Hardman R. The spice, fenugreek (Trigonella foenum-graecum L.): It conmmercial varieties of seed as a source of diosgenin. Tropical Sciences. 1968; 10: 66-78.
  3. Hardman R. Pharmaceutical products from plant steroids. Tropical Sciences. 1969; 11: 196 – 222.
  4. Mehrafarin A, Qaderi A, Rezazadeh Sh, Naghdi Badi H, et al. Bioengineering of Important Secondary Metabolites and Metabolic Pathways in Fenugreek (Trigonella foenumgraecu L.). J Medicinal plants. 2010; 9: 1 – 18.
  5.   Johns E. Ueber die alkaloide des bockshornsamens. Ber Deut Chem Ges. 1885; 18: 2518 - 23.
  6. Zheng XQ, Nagai C, Ashihara H. Pyridine nucleotide cycle and trigonelline (Nmethylnicotinic acid) synthesis in developing leaves and fruits of Coffea arabica. Physiol Plant. 2004; 122: 401 - 11.
  7. Petropoulos, G. Fenugreek. The genus Trigonella. London and New York: Taylor and Francis; 2002.
  8. Radwan SS, Kokate CK. Production of higher levels of trigonelline by cell cultures of Trigonella foenum-graecum than by the differentiated plant. Planta. 1980; 147: 340 –4.
  9. Verpoorte R, Alfermann A. Metabolic Engineering of Plant Secondary metabolism. Plant Cell Tiss Org. 2002; 68: 211–212.
 

10. Zhao J, Davis L, Verpoorte R. Elicitor signal transduction leading to production of plant secondary metabolites. Biotechnol Advance. 2005; 23(4): 283–333.

11. Hayat Q, Hayat S, Irfan M, Ahmad Q .Effect of exogenous salicylic acid underchanging environment: A review. Environ Exp Bot. 2009; 68: 14-25.

12. Pu GB, Dong-Ming M, Chen JL, Ma LQ, et al. Salicylic acid activates artemisinin biosynthesis in Artemisia annua L. Plant Cell Rept. 2009; 28:1127–1135.

13. Kang S, Jung H, Bahk J, Yang J. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science. 2004; 166: 745-751.

14. Schützendübel A, Schwanz P, Teichmann T, Gross K, et al. Cadmium-Induced changes in antioxidative systems, hydrogen peroxide content, and differentiation in scots pine roots. Plant Physiol. 2001; 127: 887-898.

15. De Vos CH, Schat H. Increased resistance to copper-induced damage of the root plasma membrane in copper tolerant Silene cucubalus. Physiol Plantarum. 1991; 82: 523–528.

16. Velikova V, Yordanov I, Edreva A. Oxidative stress and some antioxidant systems in acid rain-treated been plants protective role of exogenous polyamines. Plant Science. 2000; 151: 59–66.

17. Singleton VL, Rossi JR. Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdic-phosphotungestic acid reagent. Am J Enol Viticult. 1965; 16: 144-58.

18. Rongjie Z, Li W, Longxing W. Determination of trigonelline in Trigonella foenum-graecum L. by hydrophilic interaction chromatography. chin j chromatogr. 2010; 4: 379-382.

19. Kang  SM, Jung HY, KangYM, Yun DJ, et al. Effects of methyl jasmonate and salicylic acid on the production of tropane alkaloids and the expression of PMT and H6H in adventitious root cultures of Scopolia parviflora. Plant Science. 2004; 166: 745-751.

20. Kovacik J, Backor M, Strnad M, Repcak M. Salicylic acid-induced changes to growth and phenolic metabolism in Matricaria chamomilla plants. Plant Cell Rep. 2009; 28:135–143.

21. Iriti M, Faoro F. Chemical diversity and defence metabolism: How Plants Cope with pathogens and ozone pollution. Int Mol Sci. 2009; 10: 3371-3399.

22. Antoine L, Harfouche E, Rugini E, Mencarelli F, et al. Salicylic acid induces H2O2 production and endochitinase gene expression but not ethylene biosynthesis in Castanea sativa in vitro model system. J Plant Physiol. 2008; 165: 73465l .

23. Gao CJ, Xing D, Li LL, Zhang LR. Implication of reactive oxygen species and mitochondrial dysfunction in the early stages of plant programmed cell death induced by ultraviolet-C overexposure. Planta. 2008; 227: 755–767.

24. Yousefzadi M, Sharifi M, Behmanesh M, Moyano E, et al. Salicylic acid improves podophyllotoxin production in cell cultures of Linum album by increasing the expression of genes related with its biosynthesis. Biotechnol Lett. 2010; 32(11): 1739–1743.

25. Bais HP, Park SW, Weir TL, Callaway RM, et al. How plants communicate using the underground information superhighway. Trends in Plant Science. 2004; 9: 26–32.

26. Chen JY, Wen PF, Kong W, Pan QH, et al. Effect of salicylic acid on phenylpropanoids and phenylalanine ammonia-lyase in harvested grape berries. Postharvest Biol Tec. 2006; 40: 64–72.