فسفات کلروکین تنها در عدم حضور گلیسرول و یا ,DMSO محرکی پر قدرت برای ورود DNA به سلولهای HEK293T است

نویسندگان

پردیس علوم دانشگاه تهران، دانشکده زیست شناسی، گروه علوم سلولی و مولکولی، صندوق پستی 6455-14155 تهران، ایران

چکیده

هدف: روش‏های متعددی برای وارد کردن مواد ژنتیکی خصوصا DNA به‏داخل سلول‏های حیوان به‏کار گرفته شده‏اند. روش وابسته به فسفات کلسیم روشی آسان و ارزان قیمت است با این‏حال این روش برای ترانسفکشن عده‏ای از سلول‏های حیوانی کارایی مناسبی ندارد. در این مطالعه تلاش بر این بود که بتوان کارایی ترانسفکشن با واسطه فسفات کلسیم را افزایش داد.    مواد و روش‏ها: دویست هزار سلول HEK293T در هر یک از خانه‏های ظروف 6 خانه‏ای که حاوی یک لامل پوشیده از پلی‏ال‏لیزین بود کاشته شده و تا رسیدن به تراکم 60 درصد در محیط مناسب رشد داده شدند. سلول‏ها سپس توسط یک روش استاندارد فسفات کلسیم در حضور یا عدم حضور فسفات کلروکین با پلاسمید رمز کننده پروتئین GFP (Green Fluorescence Protein) ترانسفکت شدند. سلول‏ها با میکروسکوپ فلورسانس مورد مشاهده قرار گرفته و میزان بیان GFP توسط نرم افزار Image J مورد اندازه‏گیری قرار گرفت. نتایج: ما نشان می‏دهیم که فسفات کلروکین می‏تواند به‏میزان قابل ملاحظه‏ای ترانسفکشن سلول‏های HEK293T را با واسطه فسفات کلسیم افزایش دهد به‏طوری‏که در حضور این ماده تعداد سلول‏های ترانسفکت شده تا 8 برابر افزایش می‏یابد. فسفات کلروکین هیچ سمیتی برای سلول‏ها نداشت ولی افزایش کارایی ترانسفکشن این ماده در حضور گلیسرول و یا DMSO (Dimethyl sulphoxide) مشاهده نگردید. نتیجه گیری: ما فسفات کلروکین را به‏منظور افزایش کارایی ترانسفکشن توسط روش فسفات کلسیم توصیه می‏کنیم. به‏علاوه پیشنهاد می‏شود فسفات کلروکین به‏صورت تنها و در عدم حضور سایر محرک‏های ترانسفکشن مورد استفاده قرار گیرد.     

کلیدواژه‌ها


مقدمه

ترانسفکشن سلول‏ها به فرآیندی اطلاق می‏گردد که در طی آن یک ماده ژنتیکی به‏صورت DNA یا RNA به‏درون سلول‏ها فرستاده می‏شود (1). حاملین مولکولی مختلفی برای ترانسفکشن سلول‏های پستانداران مورد استفاده قرار گرفته اند. این حاملین معمولا دارای بار الکتریکی مثبت هستند و به‏دنبال اتصال با DNA توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول می‏شوند. لیپوزوم‏ها حاملین بسیار خوبی برای انتقال مواد ژنتیکی مانند DNA هستند زیرا انواع مختلف سلول‏ها را می‏توان توسط آن‏ها ترانسفکت کرد و این ترانسفکشن معمولا با کارایی مناسب صورت می‏گیرد و اثرات سمی نسبتا کمی بر سلول‏ها دارد (4-2). با این‏حال عواملی مانند سلامت سلول‏ها- کیفیت و کمیت ماده ژنتیکی- سرم موجود در محیط کشت- روش تهیه لیپوزوم و در نهایت مدت زمان ترانسفکشن از عواملی هستند که ممکن است کارایی ترانسفکشن توسط لیپوزوم‏ها را کاهش دهند (5 و 6). به‏علاوه لیپوزوم‏ها حاملین بسیار گران قیمتی هستند.

اولین روش ترانسفکشن وابسته به فسفات کلسیم توسط دانشمندانی به‏نام‏های Graham و van der Eb معرفی شد (7). این روش وابسته به مخلوط کردن DNA با محلولی از کلرید کلسیم است. سپس این مخلوط به یک محلول بافری سالین/ فسفات (saline/phosphate) اضافه می‏گردد و در دمای اتقاق نگه‏داری می‏شود تا رسوبات DNA با کلسیم تشکیل گردد. سپس محلول حاوی این رسوبات به کشت سلول‏ها اضافه می‏گردد که در نتیجه آن سلول‏ها توسط پدیده آندوسیتوز رسوبات ریز DNA/کلسیم را به خود جذب نموده و از طریق آندوزوم‏ها (endosomes) DNA به هسته سلول منتقل می‏گردد (2 و 8).

علی‏رغم کارایی پایین روش فسفات کلسیم در ترانسفکشن سلول‏ها و نیز حساسیت این روش به ,pH حرارت و تغییر غلظت سالین، این روش برای ترانسفکشن انواع مختلفی از سلول‏های حیوانی مورد استفاده قرار گرفته است (6 و 9). به‏علاوه این روش ساده و ارزان قیمت است و در میان سایر روش‏های ترانسفکشن تنها روشی است که از یون‏های کوچکی که به‏طور طبیعی در محیط کشت سلول وجود دارند استفاده می‏کند (9 و 10).

در این مقاله ما نتایج دیگر دانشمندان را مورد تایید قرار داده و نشان دادیم که کیفیت پائین ترانسفکشن توسط روش کلسیم فسفات می‏تواند به‏میزان قابل ملاحظه‏ای توسط ماده‏ای به‏نام فسفات کلروکین (chloroquine phosphate) که یک داروی ضد مالاریا است (11) بهبود یابد. افزودن فسفات کلروکین با غلظت 25 میکرو‏گرم در هر میلی‏لیتر (mg/ml) کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T را به میزان قابل ملاحظه‏ای (تا 8 برابر) افزایش داد و جالب آنکه در این شرایط سلول‏ها سلامت خود را حفظ کردند و کاهشی در حیات سلول‏ها مشاهده نگردید. به‏علاوه، نتایج ما نشان داد که گلیسرول و یا دی متیل سولفوکسید (DMSO, Dimethyl sulphoxide) که از محرک‏های ترانسفکشن سلول‏ها محسوب می‏شوند، اثرات افزایشی فسفات کلروکین در ترانسفکشن سلول‏ها را از بین می‏برند.

 

مواد و روش‏ها

کشت سلول و ترانسفکشن: رده سلولی HEK293T از بانک سلولی انستیتو پاستور ایران خریداری شد. دویست هزار سلول (2 X 105) HEK293T در هر یک از خانه‏های یک ظرف 6 خانه‏ای (مخصوص کشت سلول‏های جانوری) که حاوی یک لامل پوشیده از پلی‏ال‏لیزین بود کاشته شدند و سلول‏ها در انکوباتور کشت سلول با شرایط استاندارد، در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و 5 درصد دی اکسید کربن و رطوبت مناسب کشت داده شدند. برای کشت سلول‏ها از محیطDMEM   حاوی 10 درصد سرم گوساله (FBS, fetal bovine serum) و آنتی بیوتیک (100 میکروگرم در میلی‏لیتر پنی سیلین و 100 واحد در میلی‏لیتر استرپتومایسین) استفاده شد. هنگامی‏که سلول‏ها تقریبا به تراکم رشدی 60 درصد (confluency) رسیدند، محیط کشت سلول‏ها با محیط تازه حاوی 25 میکروگرم  در میلی لیتر فسفات کلروکین (Ipca laboratories, India) تعویض گردید. در آزمایش‏هایی که اثرات گلیسرول و یا DMSO مورد ارزیابی قرار گرفت، هر یک از آن‏ها به‏میزان درصد حجمی 10 درصد به محیط کشت سلول‏ها اضافه شدند. بعد از 2 ساعت سلول‏ها با 2 میکروگرم از یک حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP (Green Fluorescence Protein) ترانسفکت شدند. یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم برای ترانسفکشن سلول‏ها مورد استفاده قرار گرفت (12). 6 ساعت بعد از ترانسفکشن، محیط سلول‏ها با محیط فاقد فسفات کلروکین تعویض شد و 36 ساعت بعد سلول‏ها برداشت شدند و برای بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلوئورسنس (Zeiss, Germany) مورد بررسی قرار گرفتند.

آنالیز بیان پروتئین GFP با استفاده از میکروسکوپ فلورسانس (immunofluorescence microscopy): سلول‏های ترانسفکت شده با پلاسمید GFP بعد از برداشت، با محلول (PBS, phosphate-buffered saline) شستشو داده شدند و سپس در محلول 4 درصد پارافرمالدئید (در PBS) به‏مدت 15 دقیقه در درجه حرارت اتاق ثابت (fix) شدند. سلول‏ها مجددا شستشو داده شدند و توسط محلول 2/0 درصد تریتون X-100 در PBS به‏مدت 3 دقیقه نفوذ پذیر شدند. لامل‏های حاوی سلول سپس دو بار (هر بار 5 دقیقه) توسط محلول PBS شستشو داده شده و سپس هر کدام از آن‏ها بر روی یک اسلاید میکروسکوپی تمیز حاوی یک قطره کوچک از محیط چسبنده شامل 90 درصد گلیسرول و 10 درصد PBS      (mounting medium) قرار گرفتند. کناره‏های لامل‏ها توسط لاک ناخن مسدود شده و سپس توسط میکروسکوپ فلورسانس (Zeiss, Germany) مورد مشاهده قرار گرفتند. میزان تجلی پروتئین GFP توسط نرم افزاز image J مورد اندازه گیری کمی قرار گرفت و اندیکس تجلی پروتئین همانند روش توضیح داده شده در منبع شماره 13 محاسبه گردید (13).

نتایج

بسیاری از رده‏های سلولی می‏توانند توسط رسوبات DNA/فسفات کلسیم ترانسفکت شوند که این رسوبات به سطح سلول می‏چسبند و توسط پدیده آندوسیتوز وارد سلول می‏شوند (14). برای مطالعه نقش فسفات کلروکین در کارایی ترانسفکشن، سلول‏های HEK293T با پلاسمید تجلی دهنده پروتئین GFP (حامل cDNA ژن GFP) و با یک روش استاندارد وابسته به فسفات کلسیم ترانسفکت شدند (12). ژن GFP که پروتئین Green Flouroscent Protein را تجلی می‏دهد به‏طور گسترده به‏عنوان یک ژن گزارشگر (reporter gene) در مطالعات بیان ژنتیکی مورد استفاده قرار گرفته است (15). تیمار با فسفات کلروکین تا 8 برابر میزان ترانسفکشن سلول‏ها را افزایش داد در حالی‏که تیمار سلول‏ها با گلیسرول و یا DMSO تاثیری بر ترانسفکشن سلول‏ها نداشت (شکل 1).

 

 

 

شکل 1: الف) نتیجه یکی از آزمایشات ایمونوفلورسانس که در آن، سلول‏های HEK293T با پلاسمید کد کننده پروتئین GFP (Green Flouroscent Protein) همانند روش توضیح داده شده در قسمت "مواد و روش‏ها" ترانسفکت و با موادی که در شکل معرفی شده اند تیمار شده‏اند. ب) نمودار معرف نوع تیمار سلول‏های ترانسفکت شده و همین‏طور معرف میزان بیان ژن GFP در سلول‏ها می باشد که توسط نرم افزار Image J اندازه‏گیری شده است. متوسط اندازه‏گیری نتایج سه آزمایش مختلف (همانند آزمایش نشان داده شده درالف، در این شکل نشان داده شده است.

 

جالب آنکه تیمار سلول‏ها با گلیسرول و یا DMSO به‏طور کامل باعث از بین رفتن اثر افزایشی فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلول‏ها شد که بیانگر آنست که هر یک از این دو ماده به نوعی باعث از بین رفتن اثر فسفات کلروکین بر ترانسفکشن سلول‏ها می‏گردد (شکل 1).

اندازه‏گیری میزان ترانسفکشن بر اساس تعداد سلول‏های ترانسفکت شده و شدت بیان ژن GFP مورد ارزیابی قرار گرفت که هر دو این عوامل در حضور فسفات کلروکین افزایش پیدا کردند. شدت بیان ژن GFPتوسط نرم افزار Image J مورد اندازه‏گیری قرار گرفت.

ما همچنین در این مطالعه دریافتیم که تیمار سلول‏های HEK293T با غلظت 25 میکروگرم  در میلی‏لیتر (mg/ml)  فسفات کلروکین به‏مدت 6 ساعت (بعد از ترانسفکشن) باعث هیچ‏گونه کاهشی در بقای سلول‏ها نمی‏شود (شکل 2).

 

 

شکل 2: الف) نمونهای از رنگ آمیزی هسته سلول‏ها با رنگ DAPI (diamidino-2-phenylindole). این شکل جمعیت سلول‏ها را در حالت تیمار شده و تیمار نشده با فسفات کلروکین مورد مقایسه قرار می‏دهد. ب) نمودار بیانگر اندازه‏گیری کمی نتایج است.

 

 

بحث

ترانسفکشن سلول‏ها با روش وابسته به فسفات کلسیم روشی آسان و از نظر اقتصادی به صرفه است. با این‏حال کارایی این روش برای بعضی از سنجش‏های آزمایشگاهی کافی نیست (16). در این مطالعه ما نشان می‏دهیم که فسفات کلروکین به‏میزان قابل ملاحظه‏ای کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T را با روش فسفات کلسیم افزایش می‏دهد.

فسفات کلروکین ماده‏ای است که مدت‏هاست در درمان مالاریا مورد استفاده قرار گرفته است (17). گزارشاتی است مبنی بر اینکه غلظت‏های بالای این ماده و یا در معرض قرار گرفتن طولانی مدت سلول‏ها با این ماده برای سلول‏ها سمی است و باعث مرگ آن‏ها می‏گردد (18). با این‏حال در غلظت مورد استفاده در این مطالعه (25 میکروگرم در میلی‏لیتر) و زمان ترانسفکشن (6 ساعت)، فسفات کلروکین هیچگونه اثر سمی بر سلول‏های HEK293T نداشت.

بازدارندگی تجزیه DNA توسط فسفات کلروکین یکی از مکانیسم‏های محتمل در افزایش میزان ترانسفکشن توسط این ماده می‏باشد. در طی ترانسفکشن، اکثر مولکول‏های پلاسمید از طریق پدیده آندوسیتوز وارد سلول می شوند و در این مرحله DNA ممکن است قبل از آنکه به هسته سلول برسد به‏علت ادغام اندوزوم (endosome) و لیزوزوم (lysosome) توسط آنزیم‏های نوکلئاز لیزوزومال مورد تجزیه واقع گردد (19). ادغام اندوزوم و لیزوزوم می‏تواند توسط عوامل لیزوزوموتروپیک مانند فسفات کلروکین، که از ادغام اندوزوم و لیزوزوم ممانعت می‏کنند، جلوگیری شود (لازم به ذکر است که مواد لیزوزوموتروپیک موادی هستند که به‏طور ترجیحی در لیزوزوم‏ها تجمع پیدا می‏کنند) (8). در حقیقت فسفات کلروکین می‏تواند pH اندوزوم را تنظیم کند و فرآیند اسیدی شدن را بر هم بزند و بنابراین باعث افزایش اسمولاریته و در نهایت پارگی وزیکول‏ها گردد که در نتیجه آن DNA پلاسمیدی به‏داخل سیتوپلاسم آزاد می‏گردد (9 و 10).

این نکته قابل ذکر است که فسفات کلروکین کارایی ترانسفکشن سلول‏های سرطانی کولون (SW480) و سلول‏های سرطانی پروستات (PC-3) را افزایش نداد. دلیل این امر می‏تواند تفاوت در خصوصیات بیولوژیک (مانند تراوایی غشایی) میان سلول‏های HEK293T و سلول‏های ذکر شده باشد. بنابراین به‏نظر می‏رسد که ماده فسفات کلروکین به‏طور ترجیهی تنها باعث افزایش ترانسفکشن عده‏ای از سلول‏ها می‏شود.

فسفات کلروکین اول بار برای ترانسفکشن سلول‏ها با DNA ویروس پولیوما مورد استفاده قرار گرفت (20) و از آن زمان تاکنون به‏عنوان یک ماده موثر در ترانسفکشن برای عده ای از سلول‏های پستانداران مورد استفاده قرار گرفته است (21و 22). میزان افزایش کارایی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین به نوع سلول- محیط کشت و روش ترانسفکشن بستگی دارد و بنابراین محققین دیگری که از فسفات کلروکین برای تحریک ترانسفکشن سلولی استفاده کرده‏اند میزان افزایش متفاوتی را تجربه کرده‏اند. برای مثال در مورد رده سلولی استئوسارکوما افزایش 3 برابری ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین گزارش شده است (22) و یا گروه دیگری توانسته‏اند ترانسفکشن سلول‏های رت را با DNA ویروس پولیوما تا 6 برابر توسط فسفات کلروکین افزایش دهند (20). گروه دیگری ترانسفکشن سلول‏های CHO (Chinese hamster ovary) را با پلاسمید pSV2neo توسط فسفات کلروکین تا 20 برابر افزایش داده‏اند (21). با روش توضیح داده شده در این مقاله ما نشان می‏دهیم که کارایی ترانسفکشن سلول‏های HEK293T به‏طور قابل ملاحظه‏ای تا 8 برابر می‏تواند توسط فسفات کلروکین افزایش یابد. به‏علاوه ما نشان می‏دهیم که دو ماده گلیسرول و یا DMSO (که هر دو به‏عنوان محرک‏های ترانسفکشن سلول‏ها شناخته شده‏اند) اثر افزایشی ترانسفکشن توسط فسفات کلروکین را از بین می‏برند. بنابراین با توجه به نتایج فوق توصیه نمی‏کنیم که این محرک‏ها توام با فسفات کلروکین مورد استفاده

قرار گیرند.

نتیجه گیری

به‏طور خلاصه با توجه به استفاده گسترده از سلول‏های HEK293T در مطالعات بیان ژنتیکی, ما فسفات کلروکین را به‏عنوان یک ماده با ارزش برای افزایش کارایی ترانسفکشن توسط روش ارزان قیمت فسفات کلسیم توصیه می‏کنیم. با این‏حال با توجه به نتایج این مقاله پیشنهاد می‏گردد که فسفات کلروکین به‏عنوان تنها محرک در واکنش ترانسفکشن مورد استفاده قرار گیرد و از استفاده توام آن با سایر محرک‏ها مانند گلیسرول و DMSO خودداری گردد. 

 

تشکر و قدردانی

حامل پلاسمیدی رمز کننده پروتئین GFP به‏صورت اهدایی از دکتر Peter Klein (از دانشگاه پنسیلوانیا در کشور آمریکا) دریافت گردید. این‏کار توسط طرح پژوهشی شماره 31/86103 صندوق حمایت از پژوهشگران ریاست جمهوری و معاونت پژوهشی دانشگاه تهران مورد حمایت مالی قرار گرفته است. 

  1. Bassani-Molinas MM. Transient transfection of HEK293 cells in suspension: process characterization and optimization by applying invasive nucleotide and non-invasive electronic nose technology. Doctoral thesis. Universität Carolo-Wilhelmina zu Braunschweig, Germany. 2003.
  2. Jordan M, Schallhorn A, Wurm FM. Transfecting mammalian cells: optimization of critical parameters affecting calcium-phosphate precipitate formation. Nucl Acid Res. 1996; 24(4): 596-601.
  3. Wordragen MV, Shakya R, Verkerk R, Peytavis R, et al. Liposome-mediated transfer of YAC DNA to tobacco cells. Plant Mol Biol Rep. 1997; 15: 170-178.
  4. Lonez C,VandenbrandenM, RuysschaertMJ. Cationic liposomal lipids: From gene carriers to cell signalingProgress. Lipid Res. 2008; 47(5): 340-347.
  5. Felgner JH, Kumar R, Sridhar CN, Wheeler CJ, et al. Enhanced gene delivery and mechanism studies with a novel series of cationic lipid formulations. J Biol Chem. 1994; 269: 2550-2561.
  6. Gavrilescu LC, Van Etten RA. Production of replication-defective retrovirus by transient transfection of 293T cells. J Vis Exp. 2007; 10: 550.
  7. Graham FL, van der Eb AJ. A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 1973; 52: 456-467.
  8. Moore NM, Sheppard CL, Sakiyama-Elbert SE. Characterization of a multifunctional PEG-based gene delivery system containing nuclear localization signals and endosomal escape peptides. Acta Biomaterialia. 2009; 5: 854-564.
  9. Erbacher P, Roche AC, Monsigny M, Midoux P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Exp Cell Res. 1996; 225: 186-194.
 

10. Wolfert MA, Seymour LW. Chloroquine and amphipathic peptide helices show synergistic transfection in vitro. Gene Ther. 1998;5(3): 409-414.

11. Bruce Chwatt, L.J. Essential malariology; 2th Ed. John Wiley &.
Sons Inc. New York, NY. 1985.

12. Pear WS, Nolan GP, Scott ML, Baltimore D. Production of high-titer helper free retroviruses by transient transfection. Proc Natl Acad Sci USA 1993; 90(18): 8392-8396.

13. Kang Y, Saile E, Schell MA, Deny TP. Quantitative immunofluorescence of regulated eps gene expression in single cells of Ralstonia solanacearum. Appl Environ Microbiol 1999; 65: 2356-2362.

14. Welzel T, Radtke T, Meyer-Zaika W, Heumannb R, et al. Transfection of cells with custom-made calcium phosphate nanoparticles coated with DNA. J Mat Chem. 2004; 14: 2213-2217.

15. TsienRY. The green fluorescent protein, Ann Rev Biochem. 1998;67: 509-544.

16. Kingston RE, Chen CA, Rose JK. Calcium phosphate transfection. Curr Prot Mol Biol. 2003; Chapter 9: Unit 9.1.

17. Cooper RG, Magwere T. Chloroquine: Novel uses and manifestations. Indian J Med Res. 2007;127: 305-316.

18. Boya P, Gonzalez-Polo RA, Poncet D, Andreau K, et al. Mitochondrial membrane permeabilization is a critical step of lysosome-initiated apoptosis induced by hydroxychloroquine. Oncogene 2003; 22: 3927-3936.

19. Ciftci K, Levy RJ. Enhanced plasmid DNA transfection with lysosomotropic agents in cultured fibroblasts. Int. J. Pharmaceutics. 2001; 218(1-2): 81-92.

20. Luthman H, Magnusson G. High efficiency polyoma DNA transfection of chloroquine treated cells. Nucl Acid Res. 1983; 11(5): 1295-1308.

21. Mazahir T, Hasan RS, Chang TY. High-efficiency stable gene transfection using chloroquine-treated Chinese hamster ovary cells. Soma Cell Mol Genet. 1991; 17: 513-517.

22. Karikó K, Kuo A, Barnathan ES, Langer DJ. Phosphate-enhanced transfection of cationic lipid-complexed mRNA and plasmid DNA. Biochim Biophys Acta. 1998; 1369(2): 320-334.