بررسی اثر محیط کشت حاصل از سلول های بنیادی مزانشیمی انسانی بر آسیب حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین در موش صحرایی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 کارشناس ارشد تکوینی جانوری، دانشگاه خوارزمی (تربیت معلم)، تهران، ایران

2 گروه زیست شناسی، دانشکده علوم زیستی، دانشگاه خوارزمی (تربیت معلم)، تهران، ایران

3 گروه پاتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه تهران

4 گروه پاتولوژی، دانشکده علوم پزشکی، دانشگاه آزاد اسلامی واحد کرج

-

چکیده

هدف: هدف از انجام این تحقیق بررسی اثر فاکتورهای ترشحی سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی بر آسیب حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین در موش صحرایی می‏باشد.  
مواد و روش‏ها‏: در این تحقیق ابتدا آزمایشی جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد طراحی شد. سپس حیوانات به‏طور تصادفی به چهار گروه تقسیم شدند. یک گروه به‏عنوان کنترل در نظر گرفته شد که هیچ تزریقی در حیوانات این گروه صورت نگرفت، سه گروه دیگر جنتامایسین را به‏صورت داخل صفاقی با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم درشش روز متوالی دریافت کردند. سپس به یکی از این سه گروه محیط کشت رویی سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی و به گروه دیگر محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی به‏صورت داخل صفاقی و به‏مدت سه روز متوالی تزریق شد. در نهایت در روز‏های سوم، پنجم و هشتم بعد از تزریق جنتامایسین، نمونه‏های کلیه و خون حیوانات جمع آوری و مورد بررسی‏های بافت‏شناسی و بیوشیمیایی قرار گرفت.
نتایج: نتایج گرچه به جز در موردی خاص، هیچ کاهش معنی‏داری در میزان بیومارکرهای خونی حیوانات در گروه دریافت کننده محیط کشت رویی سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی نسبت به دو گروه دیگر نشان نداد. اما بهبودی آسیب بافتی در تعدادی از روزهای مورد بررسی مشاهده شده است.
نتیجه گیری‏: نتایج تحقیق حاضر پیشنهاد می‏کند که فاکتورهای ترشحی سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی می‏توانند در برابر آسیب بافتی ناشی ازجنتامایسین اثر محافظتی داشته باشند.

کلیدواژه‌ها


مقدمه

کلیه یک اندام با پیچیدگی بالا می‏باشد که بیش از 30 نوع سلول مختلف را در بخش‏های متفاوت می‏سازد و دارای دو وظیفه مهم می‏باشد: یکی پاک کردن بدن از مواد زاید که یا خورده می‏شوند یا توسط متابولیسم تولید می‏شوند، عمل دوم که به‏ویژه جنبه حیاتی دارد کنترل حجم و ترکیب مایعات بدن است زیرا تعادل آب و عملا تمام الکترولیت‏ها در بدن بین مقدار ورودی و خروجی تا حدود زیادی توسط کلیه‏ها حفظ می‏شود (1و 2). بیماری‏های کلیوی در میان مهم‏ترین علل مرگ و معلولیت در بسیاری از کشورها در سراسر جهان می‏باشند. آسیب کلیوی حاد (AKI) یک بیماری سخت و معمولا با یک نسبت مرگ و میر بالا می‏باشد که توسط مسمومیت یا ایسکمی ناشی از شیمی درمانی، آنتی بیوتیک‏ها و شوک ایجاد شده توسط عفونت و جراحی‏های مهم اتفاق می‏افتد (3، 4 و 5). AKI می‏تواند منجر به ناکار آمدی و آپوپتوزیس و همچنین نکروز در سلول‏های اپی‏تلیال توبولار کلیوی، همچنین کاهش در سلول‏های اندو‏تلیال کلیوی شود (5) .در کلAKI  با یک کاهش سریع در نسبت فیلتراسیون گلومرولی شناخته می شود که توسط کاهش هم در فاکتورهای رگی و هم توبولار تعیین می‏شود و شامل افزایش انبساط رگی کلیوی، کاهش خود تنظیمی و انسداد توبولار می‏باشد (6 و 7) .آسیب کلیوی حاد بطور بالقوه یک بیماری قابل برگشت است. در اکثریت بیماران، AKI به‏طور موثری بهبود می‏یابد و هیچ‏گونه پیامد بالینی ندارد، اما در تعداد معدودی از بیماران، AKI به‏طور ناقص بهبودیافته و این بیماران یا دیالیز می‏کنند و یا به‏سوی بیماری کلیوی مزمن (CKD) پیشرفت می‏کنند که هم AKI و هم CKD دارای هزینه بالا و بار بهداشتی برای جامعه هستند. هفت درصد کل بیماران بستری شده در بخش مراقبت‏های ویژه به‏دلیل AKI بوده است (8)، به همین جهت جستجو برای ایجاد روش‏های نوین درمان AKI صورت گرفته است. مطالعات اخیر، تکنولوژی بر پایه سلول‏های بنیادی را مورد آزمایش قرار داده‏اند که جنبه‏های جالبی از درمان قدر تمند اندام‏های آسیب‏دیده شدید به‏وسیله خاصیت منحصر به فرد سلول‏های بنیادی را ایجاد کرده است (9، 10 و 11). که در این بین سلول‏های بنیادی مزانشیمی (MSCs) سلول‏های با قابلیت کاربردهای درمانی و ترمیمی بالا برای بافت‏های آسیب‏دیده می‏باشند که شامل درمان AKI نیز می‏شود (12 و 13). همچنین محققان دریافتند که MSCs یک تعداد از فاکتورهایی که به‏عنوان فاکتورهای محافظت کننده کلیه شناخته می‏شوند را ترشح می‏کنند و بدین وسیله مکانیسم‏های پاراکرین و اندوکرین را ایجاد می‏کند که احتمالا از همین طریق سلول‏های بنیادی مزانشیمی اثرات تحریک کننده ترمیمی را اعمال می‏کنند (14، 15 و 16). تعدادی از این فاکتورها شامل فاکتور رشد اپیدرمال ((EGF، فاکتور رشد هپاتوسیت ((HGF، فاکتور رشد شبه انسولین-1 ((IGF-1، فاکتور رشد اندوتلیال رگی ((VEGF و غیره می‏با‏شند (17 و 18). این فاکتورهای بیواکتیو موجب سرکوب سیستم ایمنی موضعی، مهار فیبروز و آپاپتوز، افزایش (Angogenesis) و تحریک تکثیر و تمایز می‏شوند (19). چندین مطالعه توسط فاکتورهای رشد پلی پپتید در حمایت از ترمیم کلیوی انجام شده است. در یک مطالعه محیط کشت مفید (Conditioned medium) را از سلول‏های بنیادی مشتق شده از مغز استخوان موش جداسازی و به موش‏های دارای AKI القا شده با  (Cisplatin)تزریق شد، مشاهده کردند که  (Conditioned medium)بهبود دهنده عمل‏کرد کلیوی، افزایش دهنده تکثیر سلولی توبولار و محدود کننده آپوپتوزیس سلول‏های کلیوی می‏باشند (15). Togel و همکارانش (20) نیز معتقدند سلول بنیادی مزانشیمی ممکن است در حفاظت از توبول کلیوی شر‏کت کند بدون این‏که به‏طورمستقیمی در ترمیم تو‏بول دخالت کند. آن‏ها نتیجه گرفتند تزریق سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏تواند فا‏کتور رشد هپاتوسیت (HGF)، فا‏کتور رشد اندوتلیال رگی (VEGF) و فاکتور رشد شبه انسولین1 (IGF-1) را تر‏شح کند که می‏تواند داخل مویر‏گ های ریز آسیب دیده جایگزین شود و آپوپتوزیس را مهار کند. این یک جنبه مهم از محا‏فظت القا شده توسط MSC در برابرischemia/reperfusion)) ARF وAKI ‏ از طریق عمل پاراکرین می‏باشد. شناسایی فاکتورهایprotective  خاص ترشح شده به‏وسیله MSCs با استفاده از روش‏های ژنومیک یا پروتئومیک ممکن است فرصت‏هایی را برای کشف راه‏های درمانی جدید و توسعه درمان‏های مولکولی و دارویی جدید فراهم آورد (21).

توانایی کلیه‏ها برای تغلیظ و متابولیزه مواد شیمیایی باعث می‏شود کلیه‏ها به‏طور ویژه‏ای مستعد آسیب توکسیک باشند. آنتی بیوتیک جنتامایسین از خانواده آنتی‏بیوتیک‏های آمینو‏گلیکوزید می‏باشد که به‏طور وسیعی در درمان انواعی از عفونت‏ها که توسط باکتری‏های گرم منفی و (Endocarditis) ایجاد می‏شوند به‏کار می‏رود. با این‏حال، ارزش درمانی آن به‏وسیله نفروتوکسیستی محدود می‏شود و این اتفاق در 20 تا 30 درصد بیمارانی که جنتامایسین را دریافت کرده‏اند رخ می‏دهد (22 و 23). از این جهت، برای ساخت مدل‏های نفروتوکسیستی در مطالعات کشت سلول و حیوانات آزمایشگاهی استفاده می‏شود (24، 25 و 26). نفروتوکسیستی جنتامایسین توسط آسیب توبولار پروکسیمال و زوال عمل‏کردی کلیه شناخته می‏شود و منجر به آپوپتوزیس، نکروز و اتساع توبولار می‏شود (23). در این مطالعه سعی شده است با استفاده از نفروتوکسیک شناخته شده به‏نام جنتامایسین ابتدا مدل تایید شده‏ای از بیماری حاد کلیوی ساخته شود و سپس با تیمار حیوانات بیمار با محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی (conditioned medium - (MSCs  چگونگی تاثیرات این ماده بر روند بیماری حاد در کلیه مورد بررسی قرار گیرد.

 

مواد و روش‏ها

حیوانات: در این مطالعه تجربی، از رت بالغ نر نژاد ویستار (wistar rat) که در اتاق حیوانات دانشگاه خوارزمی نگه‏داری شده بودند استفاده شد. رت‏ها در اتاق حیوانات با دمای کنترل شده 2±25 سانتی‏گراد و دوره نوری12 ساعت روشنایی و12 ساعت تاریکی نگه‏داری شدند. آب و غذای کافی همواره در دسترس آن‏ها قرار داشت. آزمایشات روی تمام گروه‏های مورد بررسی در شرایط کاملا یکسان و مطابق اصول اخلاقی کار  با حیوانات آزمایشگاهی صورت گرفت.

تهیه محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی :(hMSC - Conditioned Medium) بعد از این‏که سلول‏های بنیادی مزانشیمی کاملا سطح فلاسک را پرکردند،20 میلی‏لیتر محیط کشت تازه α-MEM (Cat No.22571-020,alpha MEM,Gibco) حاوی10 درصد سرم‏گاوی‏ جنینی‏ (Fetal bovine serum:FBS)(Cat No.SH30070.03,Thermo Scientific,USA) و1 درصد پنی سیلین و استرپتومایسین (Cat No.15070-063,Gibco) به‏مدت 48 ساعت در دمای 37 درجه سانتی گراد و Co2 5 درصد برروی سلول‏ها انکوبه شد. با اتمام زمان انکوباسیون محیط رویی سلول‏ها جهت تیمار حیوانات مورد استفاده قرار گرفت. برای هر کیلوگرم وزن بدن، محیط کشت حاصل از106 × 5‏ سلول، در نظر گرفته شد و به حیوانات تزریق گردید.

ساخت مدل حیوانی: جهت دستیابی به مدل حیوانی استاندارد از تعدادی موش صحرایی نر نژاد ویستار با وزن تقریبی 180 تا 250 گرم استفاده گردید. یک گروه شش‏تایی از موش‏ها به‏عنوان گروه کنترل در نظر گرفته شد که در این گروه هیچ تزریقی صورت نگرفت. در گروه دوم ده عدد موش قرار گرفت که برای شش روز متوالی به آن‏ها داروی جنتامایسین با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏صورت داخل صفاقی تزریق شد. بعد از این دوره هر روز یک موش جهت خون‏گیری از قلب با تزریق محلول کتامین و زایلازین بی‏هوش شد و با تهیه سرم خون جانور میزان کراتینین (Cr) و نیتروژن اوره خون (BUN) حیوان به‏مدت ده روز مورد بررسی قرار گرفت. همچنین کلیه حیوانات برای مطالعات هیستولوژیکی خارج و در فرمالین 10 درصد نگه‏داری شدند. (به‏دلیل برداشت کلیه در گروه‏ها و مرگ و میر حیوانات نمونه‏گیری از این حیوانات لحظاتی قبل از مرگ صورت گرفت). درگروه مدل آزمایشات با شش بار تکرار صورت پذیرفت. درنهایت با بررسی میزان نیتروژن اوره خون (BUN)، کراتینین (Cr) و نسبت بین این دو، بالاترین میزان آن‏ها را طی دوره ده روزه به‏دست آورده و به‏عنوان روز اوج اثر داروی جنتامایسین در نظر گرفته شد که نشان دهنده بیشترین میزان آسیب جاندار در این روز می‏باشد و به‏عنوان دوره حاد بیماری تعریف می‏شود (با بررسی نتایج در این مطالعه روز سوم به‏عنوان روز اوج اثر جنتامایسین در نظر گرفته شد).

تیمار حیوانات دارای ‏آسیب حاد کلیوی با استفاده از محیط کشت مفید حاصل سلول‏های بنیادی مزانشیمی ((MSCs-conditioned medium: پس از ایجاد مدل حیوانی استاندارد، حیوانات به چهار گروه 6 تایی تقسیم شدند. گروه اول به‏عنوان کنترل در نظر گرفته شد که هیچ تزریقی در آن‏ها صورت نگرفت و به گروه دوم برای ایجاد مدل نارسایی حاد کلیوی تنها جنتامایسین تزریق شد که این دو گروه در بخش مدل سازی توضیح داده شدند. گروه سوم به‏عنوان گروه تجربی در نظر گرفته شد. درگروه تجربی علاوه بر تزریق جنتامایسین، MSCs-conditioned medium 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی به‏صورت داخل صفاقی به حیوانات تزریق شد. درگروه چهارم که شم نامیده شد، حیوانات جنتامایسین و کنترل مدیا (محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی) را نیز مانند گروه قبل به‏صورت داخل صفاقی 24 ساعت قبل از تزریق جنتامایسین و در سه روز متوالی دریافت کردند. شایان ذکر است در این مطالعه در تمام گروه‏هایی که جنتامایسین دریافت کرده‏اند علاوه بر بررسی در روز سوم پس از تزریق که روز اوج تاثیر جنتامایسین به‏حساب می‏آید روز پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز مورد مطالعه قرار گرفت (در همه گروه‏ها آزمایشی شش بار تکرار صورت پذیرفت).

مطالعات بافت‏شناسی: نمونه‏های بافتی مطابق روش‏های معمول پردازش شده و پس از قالب‏گیری با پارافین، برش‏های با ضخامت  4 تا 6 میکرون از آن‏ها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین _ ائوزین رنگ‏آمیزی و سپس میزان آسیب بافتی با استفاده از استانداردهای تهیه شده در مطالعات قبلی مطابق با جدول شماره1، 2 و3 کمی شد و مورد بررسی قرار گرفت.

 

 

جدول 1: نحوه امتیازدهی برای تعیین درجه تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری

درجه آسیب توبولی

 

0

سلول‏های جدار لوله‏های ادرای سالم بوده و هیچ‏گونه تورم حادسلولی و نکروز دیده نمی‏شود

1

در کمتر از یک سوم لوله‏های شمارش شده تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دیده می‏شود.

2

بین یک سوم تا دو سوم لوله‏های شمارش شده تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دیده می‏شود.

3

در بیشتر از دو سوم لوله‏های شمارش شده تورم حادسلولی ونکروز لوله ‏های ادراری دیده می‏شود

*** در هر مقطع از کلیه‏ها 150 لوله به‏طور تصادفی شمارش شدند.

 

 

جدول 2: نحوه ارزیابی کست هیالین

کست هیالین

 

0

هیچ کستی داخل لوله‏ها دیده نمی‏شود.

1

در کمتر از یک سوم لوله‏ها کست وجود دارد.

2

در یک سوم تا دو سوم لوله‏ها کست وجود دارد.

3

در بیشتر از دو سوم لوله‏ها کست وجود دارد.

*** برای ارزیابی کست هیالن، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید.

 

جدول3: نحوه ارزیابی تجمع سلول‏های آماسی

تجمع سلول‏های آماسی

 

0

هیچ تجمعی از سلول‏های آماسی در فضای بین توبولی دیده نمی‏شود.

1

در کمتر از یک سوم فضای بین توبولی تجمع سلول‏های آماسی تک هسته دیده می‏شود

2

بین یک سوم تا دو سوم فضای بین توبولی تجمع سلول‏های تک هسته دیده می‏شود

3

در بیشتر از دو سوم فضای بین توبولی تجمع سلول های تک هسته‏ای وجود دارد.

*** برای ارزیابی تجمع سلول‏های آماسی، 10 شان میکروسکوپی شمارش گردید

 


آزمون‏های بیوشیمیایی سرم: پس از خون‏گیری و تهیه سرم حیوانات مورد نظر، میزان Cr (کراتینین) وBUN  (نیتروژون اوره خون) که از مهم‏ترین مارکرهای سرمی آسیب کلیوی می‏باشند با استفاده از کیت‏های تولیدی شرکت زیست‏شیمی و دستگاه آنالیزر اندازه‏گیری شدند.

آنالیزهای آماری: نتایج به‏دست اماده توسط نرم افزار               16. SPSSو آزمون واریانس یک‏طرفه با تست Post  Hoc Tukey  و با سطح معنی‏داری (05/0 P≤) آنالیز و به‏صورت SE)  (Mean ± بیان شدند.

نتایج

صحت القای مدل

مطالعات داروشناختی روی بیماری‏های کلیه نیازمند دستیابی به مدل‏های حیوانی مناسب می‏باشد که مقلد شرایط پاتوفیزیولوژیک بیماری باشند. از این‏رو در این مطالعه جهت اطمینان از صحت القای مدل، آزمایشی مطابق آنچه در روش کار ارایه نمودیم طراحی شد. نتایج پس از القای مدل نشان داد که تزریق جنتامایسین با دوز 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم در یک دوره شش روزه باعث افزایش معنی‏دار (001/0P≤) کراتینین‏ (نمودار1) و نیتروژن اوره خون (نمودار2) در روزهای سوم و پنجم پس از تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل شده است. همچنین کراتینین درروز هشتم پس از تزریق جنتامایسین دارای سطح معنی دار (0.05 P≤) نسبت به گروه کنترل می‏باشد (نمودار1). لازم به ذکر است با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN (نیتروژن اوره خون)‏، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس ازتزریق جنتامایسین، روز سوم، روز اوج اثر جنتامایسین برحیوان می‏باشد که به‏عنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.

نتایج حاصل از مارکرهای بیوشیمیایی خون نشان دهنده القای آسیب بودند. مطالعات بافت‏شناسی نیز حاکی از تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین در گروه مدل (گروه دریافت کننده جنتامایسین) نسبت به گروه کنترل می‏باشد (شکل1: C، D). درحالی ‏که بافت کلیه در گروه کنترل کاملا طبیعی به‏نظر می‏رسید و هیچ آسیبی دیده نمی‏شد (شکل1:B، A). با توجه به مطالعات گذشته در القای مدل حاد کلیوی‏، نتایج ما نشان دادند این میزان از              داروی جنتامایسین می‏تواند مدل مناسبی از بیماری حاد    کلیوی را القا کند. به‏عبارتی یافته‏های ما موید صحت روند مدل‏سازی انجام شده بودند از این‏رو با القای بیماری         به‏روش آزموده شده در مدل‏سازی و تیمار حیوانات با       hMSC – conditioned medium تاثیرآن بر بیماری حاد کلیوی بررسی شد.

 

 

نمودار1: میزان تغییرات کراتینین (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سرم خون، طی دوره ده روز پس از  تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)

 

 

نمودار2: میزان تغییرات نیتروژن اوره (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سرم خون،طی دوره ده روز پس از  تزریق جنتامایسین نسبت به گروه کنترل: (05/0*p<) (01/0**p<) (001/0***p<)

(٭لازم به ذکراست با درنظر گرفتن بالاترین مقادیر BUN‏، کراتینین و نسبت بین این دو طی دوره ده روزه بررسی پس از تزریق جنتا‏مایسین‏، روزسوم روز اوج اثرجنتامایسین برحیوان می‏باشد که به‏عنوان دوره حاد بیماری در نظر گرفته شد.)

 

شکل1: بررسی صحت القای آسیب حاد کلیوی به‏وسیله آنالیز بافت شناسی کلیه حیوانات مورد آزمایش. A و :Bمیکروگراف نوری ازکلیه حیوانات گروه کنترل، بافت کلیه در قمست قشر (A) و مدولا (B) کاملا طبیعی به‏نظر می‏رسد و هیچگونه آسیبی مشاهده نمی‏شود. C وD: میکروگراف نوری از بافت کلیه حیوانات گروه دریافت کننده جنتامایسین (مدل)، نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی) و تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) در بخش قشری کلیه (شکل C) و همچنین کست هیالین (پیکان زرد) در بخش مدولا کلیه (شکل D) به‏وضوح قابل مشاهده می‏باشد. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

 


بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی(conditioned medium- (hMSC برمیزان نیتروژون اوره خون (BUN) وکراتینین (Cr) سرمی بعد از تیمار با جنتا‏مایسین

بررسی در گروه‏های آزمایشی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین نشان داد گرچه در گروه تجربی (جنتامایسین + محیط کشت مفید‏) کاهش اندکی در میزان Cr سرم خون نسبت به گروه مدل (جنتامایسین) و شم صورت پذیرفته است. اما فاقد سطح معنی‏دار می‏باشد (نمودار3). تغییرات BUN نیز در روز سوم مطالعه گویای این مطلب می‏باشد (نمودار4). درروز پنجم بعد ازتزریق جنتامایسین نیز هیچ کاهش معنی‏داری در میزان BUN و Crسرم خون نسبت به گروه مدل وشم دیده نشد (نمودار 3 و 4). همچنین مطالعه در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین در چهار گروه آزمایشی نشان داد میزان BUN  در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم بدون هیچ‏گونه تغییر معنی‏دار می باشد (نمودار4). اما میزان کراتینین سرم خون درگروه تجربی دارای کاهش با سطح معنی‏داری (001/0p<) نسبت به گروه جنتا‏مایسین و شم می‏باشد (نمودار3).

بررسی اثر محیط کشت مفید حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیم انسانی بر تغییرات بافتی کلیه بعد از تیمار با جنتامایسین

نمونه‏های بافتی مطابق روش‏های معمول پردازش شده و پس از قالب‏گیری با پارافین، برش‏هایی با ضخامت 4 تا 6 میکرون از آن‏ها تهیه شد. اسلایدهای تهیه شده با روش هماتوکسیلین و ائوزین رنگ‏آمیزی شده و مورد بررسی قرار گرفتند. میزان تورم حاد سلولی، نکروز لوله های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین مطابق جداول 1، 2 و 3 کمی شد.

برطبق مطالعات، کلیه سالم درگروه کنترل بدون هیچ‏گونه آسیب بافتی در تمام قسمت های نفرون شامل گلومرول، لوله‏های پروکسیمال و دیستال در ناحیه قشری _ مرکزی می‏باشد (شکل1:B ، A). بررسی‏های بافت‏شناسی در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین درگروه‏های آزمایشی نشان می‏دهد که در گروه تجربی برخلاف انتظار، تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دارای افزایش معنی‏دار (001/0p<) نسبت به گروه مدل و شم می‏باشد. در حالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏ها‏ی آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمی‏دهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنی دار (001/0p<) نسبت به گروه جنتامایسین و شم می‏باشد (نمودار5 و شکل2).

 

 

 

نمودار3‏: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات کراتینین (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) در روزهای سوم ، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM فقط در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین سبب کاهش کراتینین باسطح معنی‏داری (001/0▪▪▪p<) درگروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم شده است. درروزهای سوم وپنجم هیچ کاهش معنی‏داری درگروه تجربی نسبت به گروه شم وکنترل مشاهده نمی‏شود.                  { (001/0***p<)و(01/0**p<) سطح معنی‏داری گروه‏های آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد.{

 

 

 

 

نمودار4‏: بررسی اثر hMSC-CM برمیزان تغییرات نیتروژن اوره (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) ‏در روزهای سوم‏، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین: hMSC – CM درهیچ‏کدام از روزهای سوم، پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین منجر به کاهش معنی‏داری درسطح BUN (میلی‏گرم بر دسی‏لیتر) سرم خون در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم نشده است.{ (05/0*p<)، (001/0***p<) سطح معنی‏داری گروه‏های آزمایشی را نسبت به گروه کنترل نشان می‏دهد.{

 

نمودار5: بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز سوم پس از تزریق جنتا‏مایسین‏: در گروه تجربی برخلاف انتظار تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏های ادراری دارای افزایش معنی‏دار (001/0p<***) نسبت به گروه مدل وشم می‏باشد. درحالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏ها‏ی آزمایشی در این روز تغییر چندانی را نشان نمی‏دهد. اما کست هیالین در گروه تجربی دارای کاهش معنی‏دار (001/0p<***) نسبت به گروه جنتامایسین و شم می‏باشد.

 

 

 

شکل 2: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز سوم مطالعه.A  وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B)  در این روز مشهود می‏باشد.C  وD : فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه در گروه تجربی که تنها نشاندهنده کاهش معنیداری در میزان کست هیالین در بخش مدولا در روز سوم مطالعه می باشد. {نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

 

بررسی‏های بافت‏شناسی در روز پنجم پس از تزریق جنتامایسین در گروه‏های آزمایشی نشان می‏دهد که تورم حاد سلولی‏، نکروز لوله‏های ادراری وکست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروه‏های مدل و شم با سطح معنی‏داری (0001/0p<) کاهش یافته است. درحالی‏که تجمع سلول‏های آماسی در گروه‏های آزمایشی در این روز هیچ گونه تغییر معنی‏دار را نشان نمی‏دهد (نمودار6 و شکل 3).

 

 

نمودار6: بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز پنجم پس از تزریق جنتا‏مایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری و کست هیالین در گروه تجربی نسبت به گروه‏های مدل و شم با سطح معنی‏داری (001/0p<***) کاهش یافته است. اما درتجمع سلول‏های آماسی در گروه‏های آزمایشی در این روز هیچ‏گونه تغییر معنی‏داری مشاهده نشده است.

 

 

شکل3: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القاء شده با جنتامایسین در روز پنجم مطالعه.A  وB: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B) مشهود می‏باشد.C  و:D فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان می‏‏دهد که می‏توان کاهش قابل ملا‏حظه‏ای در میزان تورم حاد سلولی و نکروز لوله‏‏های ادراری در بخش قشر کلیه وکست هیالین در لوله‏‏های جمع کننده ادراری نسبت به گروه مدل در روز پنجم مطالعه مشاهده کرد. { نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.

 

 

در روز هشتم پس از تزریق جنتامایسین نیز تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی و کست هیالین با سطح معنی‏داری (001/0p<) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است (نمودار7 و شکل 4). با توجه به این‏ نتایج در روز سوم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی بهبودی قابل توجه در بافت کلیه مشاهده نشده است. اما بافت کلیه در روزهای پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین در گروه تجربی نسبت به گروه جنتامایسین و شم ترمیم یافته است.

 

 

 

نمودار7: بررسی اثر hMSC-CM بر تغییرات بافتی کلیه در روز هشتم پس از تزریق جنتا مایسین: تورم حاد سلولی، نکروز لوله‏های ادراری، تجمع سلول‏های آماسی‏، کست هیالین با سطح معنی‏داری (001/0p<***) در گروه تجربی نسبت به گروه مدل و شم کاهش یافته است.

 

 

شکل4: تاثیرhMSC- CM برتغییرات بافتی کلیه در حیوانات مدل آسیب حاد کلیوی القا شده با جنتامایسین در روز هشتم مطالعه.A  و B: فتومیکروگراف از بافت کلیه درگروه جنتامایسین تیمار نشده باhMSC- CM ، نکروز لوله‏‏های ادراری، تورم حاد سلولی و تجمع سلول‏‏های آماسی در بخش قشر کلیه (A) و همچنین کست هیالین در قسمت مدولا (B) در روز هشتم مطالعه مشهود می‏باشد.C  و D: فتومیکروگراف از بخش قشر و مدولا بافت کلیه گروه تجربی را نشان می‏دهد که می‏توان کاهش معنی‏دار در تمام معیارهای آسیب بافتی را در این گروه نسبت به گروه مدل در روز مورد بررسی مشاهده کرد. { نکروز لوله‏‏های ادراری (پیکان سیاه)، تورم حاد سلولی (پیکان آبی)، تجمع سلول‏‏های آماسی (پیکان نارنجی) و کست هیالین (پیکان زرد) }. رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین-ائوزین، بزگنمایی ×400.


بحث

سمیت حاد کلیوی ناشی از مصرف جنتامایسین دربیماران مبتلا به انواعی از عفونت‏‏‏ها به‏عنوان مثال عفونت های چشمی، ریوی و روده‏ای ازجمله عوارض جانبی مهم این دارو می‏باشد که باعث محدودیت مصرف آن می شود (23). علی‏رغم اثرات سمی ناخوشایند جنتامایسین، به‏دلیل ثبات شیمیایی آنتی بیوتیک‏های آمینوگلیکوزید، اثرات ضد باکتریایی شدید، کاربرد توام با آنتی‏بیوتیک‏های دیگر، مقاومت کم و هزینه درمانی اندک برای بیماران هنوز هم به‏طور وسیعی به‏کار می‏روند (27).

در این مطالعه برطبق تعدادی تحقیقات و مطالعات گذشته انتظار می‏رفت که محیط کشت حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی اثرات محافظتی در برابر سمیت حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین درمدل حیوانی موش صحرایی داشته باشد. با اینکه محیط کشت حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی موجب ترمیم بافتی در روزهای پنجم و هشتم پس از تزریق جنتامایسین درگروه تجربی شدند. اما تقریبا هیچ تاثیر معنی‏داری در کاهش بیومارکرهای شیمیای سرم خون در روزهای مورد بررسی نداشتند. اما ترمیم بافت کلیوی در روزهای مورد نظر در گروه تجربی را می‏توان نشانه اثرات مثبت و ترمیم‏کنندگی محیط کشت حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی بر بافت کلیه دارای نارسایی حاد کلیوی ناشی از جنتامایسین دانست. به‏علاوه نشان داده شد که محیط کشت فاقد فاکتورهای ترشحی این سلول‏ها از سلول‏های کلیه در برابر جنتامایسین محافظت نمی‏کنند.

آمینوگلیکوزید‏ها متابولیزه نمی‏شوند و اساسا توسط فیلتراسیون گلومرولی دفع می‏شوند. به‏طور نسبی مقادیر بالا از دوز تزریق داخل رگی (حدود 10 درصد) درکورتکس کلیه تجمع می‏یابد. در‏حالی‏که توزیع کمی ‏از آمینو گلیکوزید‏ها داخل بافت‏‏های دیگر گزارش  شده است (28). در کل مسمومیت توبولار جنتامایسین به‏دوصورت ظاهر می‏شود یا جنتامایسین موجب مرگ در سلول‏های اپی‏تلیال توبولار می شود که همراه با تولید ترکیبات التهابی می باشد یا باعث اختلال در عمل‏کرد ترکیبات کلیدی سلولی که درگیر در نقل وانتقال آب و مواد محلول هستند می‏شود (29 و 30). در واقع جنتامایسین  با القا نکروز و آپوپتوزیس در سلول‏‏های اپی‏تلیال توبولار منجر به کاهش عملکرد توبولار و نقص در بازجذب مایع و الکترولیت‏‏ها می‏گردد. این رخداد گرچه منجر به هیچ کاهش مستقیمی‏ در  GFR(نسبت فیلتراسیون گلومرولی) نمی‏شود. اما به‏طور مستقیم از طریق فعال‏سازی مکانیسم  TGF(ضریب تصفیه گلومرولی) موجب کاهش در سطوح GFR می‏شود. از آن‏جا که فرآورد‏های زاید متابولیک برای دفع به فیلتراسیون گلومرولی وابسته هستند. هر گاه GFR به میزان 50 درصد کاهش یابد. کلیه‏‏ها به صورت گذرا فقط نیمی ‏از کراتینین را تصفیه و دفع می‏کنند. بنابراین کراتینین در مایعات بدن تجمع یافته و غلظت پلاسمایی آن بالا می‏رود. در بیماران مبتلا به بیماری‏های کلیوی که دچار کاهش زیادی در GFR هستند غلظت اوره پلاسما به‏طور بارزی افزایش می‏یابد. به این ترتیب جنتامایسین با کاهش GFR موجب افزایش کراتینین و BUN درخون می‏شود (31).

تعدادی از مطالعات پیشین مشخص نموده است که تجویز فاکتورهای رشد قبل و بعد از آسیب کلیوی در مدل‏های جانوری، موجب بهبود آسیب و افزایش ترمیم کلیوی می‏شود. علت آن می‏تواند اثرات آنتی آپوپتوتیک،Prolifrative  و پروآنژیوژنیک آن‏ها باشد (32 و33). اثبات شده است که محیط کشت     حاصل از سلول های بنیادی مزانشیم انسانی فعال کننده      مسیر سیگنالین PI3K-AKT می‏باشد که کاهش دهنده آپوپتوزیس و افزایش دهنده بقا سلول‏‏های اپیتلیال           توبولار پرکسیمال می‏باشد (34). به‏عنوان مثال فاکتور         رشد هپاتوسیت، فاکتور رشد اندوتلیال رگی،  IGF-1،EGF  پروتئین phoshatidylinositol-3-kinase را فسفریله و فعال می‏کنند که آن نیزAKT را فسفریله و فعال می‏کند  AKTسیگنال‏‏های بقا را توسط چند مکانیسم مستقل فراهم می‏کند (35، 36 و 37). دراین مطالعه ما فرض کردیم اگر فاکتور‏های لازم برای ترمیم در هنگام بروز آسیب در محل حضور داشته باشند بیشتر می‏توانند مفید واقع شوند. از طرف دیگر تزریق محیط کشت مفید پیش از تزریق جنتامایسین احتمالا می‏تواند موجب افزایش پروتئین‏های آنتی‏آپوپتوتیک و پروآنژیوژنیک نسبت به پروآپوپتوتیک و آنتی‏آنژیوژنیک شود که ممکن است این افزایش که از قبل ایجاد شده در هنگام تزریق جنتامایسین مفید واقع شود و از اثرات سمی آن بکاهد.

در زمان حاضر مشخص نمی‏باشد که چطور فا‏کتورهای ترشح شده به‏وسیله سلول‏های بنیادی مزانشیمی می‏توانند محا‏فظت کلیوی را ارائه دهند. شناسایی و پالایش این فا کتورها مسیر جدیدی را برای درمان دارویی AKI فراهم می آورد و بدین‏وسیله از تزریق یک حجم زیادی از MSC-conditioned medium جلو‏گیری می‏کند (38). با اینحال با وجود همه اطلاعاتی که در جریان مطالعات به‏دست آمده هنوز نمی‏توانیم یک نتیجه نهایی به‏دست آوریم. که آیا اثرات سلول‏های بنیادی مزانشیمی درگیر در تر میم کلیه به‏طور مستقیم به‏وسیله تمایز سلولی می باشند یا ناشی از امتزاج بین این سلول‏ها و سلول‏های آسیب دیده است. یا این‏که به‏طور غیر مستقیم توسط اثرات پاراکرینی- اندوکرینی متنوع ایجاد شده به‏وسیله سلول‏های بنیادی مزانشیمی روی سلو‏ل‏های تو‏بو‏لار می‏باشد (39، 40 و 41). اگر اثرات محافظتی به‏واسطه عمل‏کرد اندوکرینی سلول‏ها باشد، تزریق خود سلول‏ها ضروری به‏نظر نمی‏رسد، بلکه فاکتورهای ترشحی آن‏ها هستند که باید هنگام آسیب در محل حاضر باشند. نتایج حاصل از این مطالعه منعکس کننده اثرات محافظتی سلول‏های بنیادی مزانشیمی به واسطه عمل‏کرد اندوکرینی آن‏ها می‏باشد (15) که با تعدادی از مطالعات پیشین مطابقت دارد. به گونه ای که Hui Zhang و همکارانش (42) تحت یک مطالعه بیان کردند فاکتور‏های سلول‏‏های بنیادی و فاکتور‏های تحریک کننده کلنی ماکروفاژ- گرانولوسیت به‏طور جزئی موجب تحریک سلول‏‏های مغز استخوان و ایجاد اثرات درمانی در نکروز توبولار حاد ناشی از جنتامایسین می‏شوند. در پژوهشی دیگر Parekkadan  و همکارانش (43) حضور فاکتور‏های رشد VEGF،HGF  ،IGF-1 و مولکول‏‏های آنتی‏آپوپتوتیک دیگر را در MSC-Conditioned medium  آشکار کردند و نشان دادند این مولکول‏‏های بیواکتیو منجر به افزایش درصد بقا حیوانات دریافت کننده می‏گردد.                   گرچه Gheisari و همکارانش (44) اثرات درمانی Conditioned media حاصل از سلول‏‏های بنیادی مزانشیمی مغز استخوان موش  (MSC)و سلول‏‏های بنیادی سوماتیک طناب خونی نافی انسانی (USSC) را بر نارسایی حاد کلیوی مورد بررسی قرار دادند. در این مطالعه هیچ اثر سودمندی برای Conditioned media مشتق شده از این دو نوع سلول بر بهبودی نفروپاتی القا شده با سیس پلاتین مشاهده نشد (44).

 

نتیجه گیری

نتایج تحقیق حاضر نشان داد که تیمار با محیط کشت حاصل از سلول‏های بنیادی مزانشیمی انسانی گرچه موجب کاهش در بیومارکرهای شیمیایی سرم خون در کلیه دارای نارسایی حاد کلیوی با جنتامایسین (به جز در کراتینین سرم خون روزهشتم) نمی‏شود، اما تقریبا باعث بهبودی بافت کلیه در تعدادی از روزهای مورد بررسی در کلیه واجد آسیب بافتی ناشی از القا  جنتا‏مایسین می‏شود.

 

تشکر و قدردانی

مولفین مراتب سپاس خود را از زحمات فراوان خانم سارا طالب گلستانی و خانم مرضیه قاسمی در انجام این پروژه ابراز می‏دارند.

1. Pavenstadt H, Kriz W, Kretzler M. Cell biology of the glomerularpodocyte. Physiol Rev 2003; 83(1): 253-307.

2. Guyton A, Hall J. Test book of Medical physiology, 11th Ed, Volume1, Translated by: Farrokh shadan, M.D. Tehran, Chehr co, 2006.

3. Bagshaw SM. Short- and long-term survival after acute kidney injury.Nephrol Dial Transplant. 2008; 23: 2126–2128.

4. Humes HD, Szczypka MS. Advances in cell therapy for renal failure.TransplImmunol 2004; 12(3-4): 219–227.

5. Patschan D, Plotkin M, Goligorsky MS. Therapeutic use of stem andendothelial progenitor cells in acute renal injury: caira. CurrOpinPharmacol 2006; 6: 176–183.

6. Kribben A, Edelstein CL, Schrier RW: Pathophysiology of acute renal failure. J Nephrol. 1999; 12(suppl 2): S142–S151.

7. Schrier RW, Wang W, Poole B, Mitra A. Acute renal failure: definitions, diagnosis, pathogenesis, and therapy. J Clin Invest. 2004; 114(1): 5–14.

8. Brivet FG, Kleinknecht DJ, Loirat P, Landais PJ. Acute renal failure in intensive care units–causes, outcome, and prognostic factors of hospitalmortality; a prospective, multicenter study. French Study Group on Acute Renal Failure.Crit Care Med. 1996; 24: 192–198.

9. Laflamme MA, Murry CE. Regenerating the heart. Nat Biotechnol. 2005; 23(7): 845– 856.

10. Lindvall O, Kokaia Z. Stem cells for the treatment of neurologicaldisorders. Nature. 2006; 441(7097): 1094 –1096.

11. Aejaz HM, Aleem AK, Parveen N, et al. Stem cell therapy—Presentstatus. Transplant Proc. 2007; 39: 694–699.

12. Brooke G, Cooka M, Blair C, Han R, et al. Therapeutic applications of mesenchymal stromal cells.Semin Cell DevBiol. 2007; 18(6): 846–858.

 

13. Bussolati B, Hauser PV, Carvalhosa R, Camussi G. Contribution ofstem cells to kidney repair. Curr Stem Cell Res Ther. 2009; 4(1): 2–8.

14. Togel F, Weiss K, Yang Y, Hu Z, et al. Vasculotropic, paracrine actions of infused mesenchymal stem cells are important to the recovery from acute kidney injury. Am J Physiol Renal Physiol. 2007; 292: F1626-F1635.

15. B Bi, Schmitt R, Israilova M, Nishio H, et al. Stromal Cells Protect against Acute Tubular Injury via anEndocrine Effect. J Am SocNephrol. 2007; 18(9): 2486–2496.

16. Humphreys BD, Duffield JD, Bonventre JV. Renalstem cells in recovery from acute kidney injury. MinervaUrologica e Nefrologica. 2006; 58:13–21.

17. Fervenza FC, Tsao T, Rabkin R. Response of theintrarenal insulin-like growth factor-I axis to acute ischemicinjury and treatment with growth hormone and epidermalgrowth factor. Kidney Int. 1996; 49(2): 344–354.

18. Hise MK, L Li, Mantzouris N, et al. Differentialexpression of insulin-like growth factor system during renalinjury and hypertrophy. Am. J. Physiol. 269 (Renal Fluid Electrolyte Physiol. 38. 1995; F817–F824.

19. Caplan AI, Dennis JE. Mesenchymal stem cells as trophic mediators. J Cell Biochem 2006; 98(5): 1076–1084.

20. Togel F, Hu Z, Weiss K, et al. Administered mesenchymal stem cells protect against ischemic acute renal failure through differentiation-independent mechanisms. Am J Physiol Renal Physiol 2005; 289:F31–F42.

21. Julie A, William L. Stanford (eds), Stem Cells in Regenerative Medicine: Methods and protocols, vol. 482; 2009 Humana Press,a part of Springer  Science+ Business Media. DIO: 10.1007/978-1-59745-060-18 Springerprotocols.com.              

22. Chen LF, Kaye D. Current use for old antibacterial agents: polymyxins, rifamycins, and aminoglycosides. Infect Dis Clin North Am 2009; 23(4): 1053–1075.

23. Nakakuki M, Amasaki FY, Shinkawa T, Kudo M, et al. Protective effect of human ulinastatin against gentamicin-induced acute renal failure in rats. Fuji Central Research Laboratory, Mochida Pharmaceutical Co. Ltd., 722 Jimba-aza-Uenohara, Gotemba, Shizuoka 412, Japan. Can. J. Physiol. Pharmacol. 1996; 74: 104–111.

24. Laurent G, Carlier MB, Rollman B, et al. Mechanism aminoglycoside induced lysosomal phospholipidosis: in vitro and in vivo studieswith gentamicin and amikacin. BiochemPharmacol. 1982; 31(23): 3861–3870.

25. Laurent G, Kishore BK, Tulkens PM. Aminoglycoside-induced renalphospholipidosis and nephrotoxicity. BiochemPharmacol. 1990; 40: 2383–2392.

26. Kacew S, Bergeron MG. Pathogenic factors in aminoglycoside induced nephrotoxicity.nephrotoxicity.ToxicolLett. 1990; 51(3): 241–25.

27. Edson RS, Terrell CL. The aminoglycosides. Mayo ClinProc. 1999; 74(5): 519–528.

28. Nagai J, Takano M.  Molecular aspects of renal handling of Aminoglycosides and strategies for preventing the nephrotoxicity. Drug Metab. Pharmacokineti. 2004: 19, 159- 170.

29. Li J, Li QX, Xie XF, et al. Differential roles of dihydropyridine calcium antagonist nifedipine, nitrendipine and amlodipine on gentamicininduced renal tubular toxicity in rats. Eur J Pharmacol. 2009; 620: 97–104.

30. El Mouedden M, Laurent G, Mingeot-Leclercq MP, et al. Apoptosis in renal proximal tubules of rats treated with low doses of aminoglycosides. Antimicrob Agents Chemother2000; 44: 665–675.

31. Jose M, Lopez-N, Yaremi Q, Laura V, et al. New insights into the mechanism of aminoglycoside   nephrotoxicity: an integrative point of view Kidney International. 2010; 79(1): 33–45; doi:10.1038/ki.2010.337.

32. Hammerman MR. Growth factors and apoptosis in acute renal injury. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1998; 7(4): 419–424.

33. Hammerman MR. New treatments for acute renal failure: growth factors and beyond. Curr Opin Nephrol Hypertens. 1997; 6:7–9.

34. Kuwana H, Terada Y, Kobayashi T, Okado T, et al. The phosphoinositide-3 kinase gamma-Akt pathway mediates renal tubular injury in cisplatin nephrotoxicity. Kidney Int. 2008; 73(4): 430–445.

35. Dai C, Yang J, Liu Y. Single injection of naked plasmid encoding hepatocyte growth factor prevents cell death and ameliorates acute renal failure in mice. J Am Soc Nephrol. 2002; 13: 411–422.

36. Logar CM, Brinkkoetter PT, Krofft RD, Pippin JW, et al. Darbepoetin alfa protects podocytes from apoptosis in vitro and in vivo. Kidney Int. 2007; 72: 489–498.

37. Amaravadi R, Thompson CB. The survival kinases Akt and Pim as potential pharmacological targets. J Clin Inves.t 2005; 115(10): 2618–2624.

38. Fangming Lin. Renal repair: role of bone marrow stem cells-PediatrNephrol. 2008; 23: 851–861 DOI 10.1007/s00467-007-0634-8.

39. Patrick C. Baer and Helmut Geiger-Renal repair: role of bone marrow stem cells-PediatrNephrol. 2008; 23: 851–861 DOI 10.1007/s00467-007-0634-8.

40. Camargo FD, Finegold M, Goodell MA. Hematopoietic myelomonocytic cells are the major source of hepatocyte fusion partners. J Clin Invest. 2004; 113: 1266-1270.

41. Willenbring H, Bailey AS, Foster M, Akkari Y, et al. Myelomonocytic cells are sufficient for therapeutic cell fusion in liver. Nat Med. 2004; 10: 744-748.

42. Zhang Hui, Haitao Bai, Zhuwen Yi, Xiaojie He, et al. Effect of Stem Cell  Factor and Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor-Induced Bone Marrow Stem Cell Mobilization on Recovery from Acute Tubular Necrosis in Rats Renal Failure. 2012; 34(3); 350–357, Copyright © Informa Healthcare USA,Inc.ISSN0886-022Xprint/1525-6049online.DOI:10.3109/08 86022X.2011.647340.

43. Parekkadan B, Van PD, Suganuma K, Carter EA, et al. Mesenchymal stem cell-derived molecules reverse fulminant hepatic failure. PLoS ONE 2007; 2:e941.

44. Gheisari Y, Ahmadbeigi1 N, Naderi M, Nassiri S, et al. Stem Cell Conditioned Medium Can Not Protect Against Kidney Failure. Cell Biology International Immediate Publication. Publishe on 18 Oct 2010 as manuscript CBI20100183. DOI: 10. 1042/ CBI20100183.