مقایسه‌ی اثرات ضدتکثیری و مرگ برنامه ریزی شده سلولی عصاره‌های گیاهان متفاوت در غلظت‮های مختلف بر رده‌ی سلول‮های سرطان سینه‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه رازی، دانشکده علوم و مهندسی کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، کرمانشاه، ایران

2 دانشگاه رازی، دانشکده کشاورزی، پردیس کشاورزی و منابع طبیعی، گروه گیاه پزشکی، کرمانشاه، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه مقایسه­ی خواص ضدتکثیری و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی عصاره­های هیدروالکلی گیاهان مختلف (بومادران، سرخارگل، دانه­ی خارمریم، پرسیاوش و هسته­ی زردآلو) بر علیه سلول­های سرطان سینه (Mcf-7) بود.
مواد و روش‏ها: برای این منظور گیاهان مربوطه خشک و آسیاب شدند. پس از خیساندن آن‏ها در اتانول 70 درصد برای مدت 72 ساعت، عصاره­های آن‏ها با کمک دستگاه روتاری استحصال شد. مقادیر متفاوت از آن‏ها (5/12، 25، 50 و 100 میلی­گرم/میلی­لیتر) به ‏محیط کشت سلول­های سرطانی اضافه شد و خواص سمیت سلولی آن‏ها و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی به‏ترتیب بعد از گذشت 24 ساعت با کمک آزمون MTT و رنگ­آمیزی با آکریدین­نارنجی-اتیدیوم­بروماید مورد بررسی قرار گرفت. داده­ها با استفاده از نرم­افزار SPSS، مقایسه میانگین دانکن در سطح معنی­داری 5 درصد مورد آنالیز قرار گرفتند.
نتایج: افزودن حداکثر غلظت­ در تمامی عصاره­ها به محیط کشت نسبت به سایر غلظت­های همان عصاره بیشترین تاثیر معنی­داری ضدتکثیری و مرگ برنامه­ریزی شده را نشان داد (05/0>p). همچنین در بین حداکثر غلظت­ها (100 میکروگرم/میلی­لیتر) بیش‏ترین اثر سمیت سلولی مربوط به عصاره­های پرسیاوش و سرخارگل بود (05/0>p).
نتیجه‏گیری: نتایج این مطالعه نشان می­دهد که افزودن غلظت­های بالای عصاره­های پرسیاوش و سرخارگل به محیط کشت بیش‏ترین تاثیر معنی­دار ضدتکثیری و مرگ برنامه ریزی شده سلولی بر سلول­های سرطان سینه در مقایسه با سایر عصاره­های گیاهی و غلظت­های مختلف بر جای گذاشته است.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان سینه یکی از عوامل تهدیدکننده­ی زندگی زنان است. در سال 2012، بیش از 6/1 میلیون نفر مبتلای جدید به این بیماری شناسایی شد که از میان آنان، 521907 نفر به خاطر ابتلا به این بیماری جان خود را از دست دادند (1). عمل جراحی یکی از موثرترین درمان‏ها برای سرطان سینه است. شیمی­درمانی، پرتودرمانی و هورمون­درمانی به‏طور معمول جهت حذف باقی­مانده­های تومور و مهار رشد آن و کاهش وقوع مجدد سرطان سینه موثر است. این درمان‏ها سبب بهبود کیفیت و افزایش طول عمر بیماران مبتلا به سرطان سینه می­شوند (2). اما متاسفانه، برخی بیماران با اثرات جانبی مرتبط با درمان یا مقاومت به این گونه درمان‏ها مواجه می­شوند. بنابراین، یافتن مواد زیستی فعال طبیعی، ممکن است جایگزین مناسبی برای درمان سرطان سینه یا کاهش عوارض جانبی درمان‏های متداول باشد. مطالعات زیادی در رابطه با اثر عصاره­های گیاهی بر سرطان انجام شده است (3) و تحقیقات متعددی اثربخشی مثبت مواد موثره­ی گیاهی برسلول­های سرطانی را نشان داده­­­اند (4-6).

گیاه بومادران با نام علمی Achille wihelmsii Koch، از تیره­ی کاسنی بوده و با داشتن 100 جنس و 20000 گونه در تمامی سطح کره زمین پراکنده است و در مناطق مختلف اروپا، شمال آمریکا و نواحی معتدل آسیا از جمله ایران رشد می­کند (7، 8). این گیاه که دارای ساقه­ی ضخیم و استوانه­ای کم و بیش ایستاده و تا حدودی پوشیده از کرک است، در فصل اردیبهشت و خرداد گل می­دهد (9). اسانس بومادران می­تواند جهت پیش‏گیری از آسیب­های کبدی ناشی از شیمی­درمانی همراه با سیس پلاتین، به‏عنوان یک داروی گیاهی با خواص آنتی­اکسیدانتی توصیه شود (10). عصاره­ی الکلی این گیاه کاهنده­ی فشار سیستولی و دیاستولی خون است، اثر مهاری بر ترشح اسید با مهار تولید استیل کولین از عصب واگ اعمال می­کند و علاوه­برآن محرک سیستم ایمنی نیز است (8 ، 11-12). دلالی و همکاران (13)، اثرات سیستوتوکسیک عصاره­ی متانولی و اسانس گیاه بومادران در غلظت­های متفاوت را بر رده­ی سلولی HT-29 سرطان کلون مورد ارزیابی قرار دادند. نتایج حاکی از این بود که اسانس برگ در مقایسه با عصاره­ی متانولی، اثرات سمیت سلولی قوی­تری دارد و این اثر می­تواند به‏دلیل وجود ترکیبات مونوترپنی بالاتر همچنون 1و8 سینئول و آلفاپنتین باشد.

گیاه سرخارگل،Echinacea purpurea (L.) ، از خانواده گیاهان ستاره­آسا (Asteraceae) است (14) که در طب سنتی برای پیش‏گیری و درمان بیماری­هایی از قبیل سرماخوردگی معمولی، عفونت­های ریوی، اختلالات جلدی و بیماری­های مزمن ناشی از نقص سیستم ایمنی استفاده داشته است (17-15). برای اولین بار این گیاه در سال 1372 وارد ایران شد و سرخارگل نامیده شد (18). کافئیک اسید موجود در سرخارگل که جزو مواد فنولی این گیاه است، اثرات آنتی­اکسیدانتی اعمال می­کند و منجر به مهار تکثیر سلول­های سرطانی سینه و کبد نیز می‏شود (20، 19). علاوه­براین، غلظت­ 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر عصاره­ی آبی این گیاه سبب کاهش بقای سلول­های سرطانی آستروسایتوما در طی بررسی با آزمون MTT شده ­بود (21).

گیاه خار مریم، Silybum marianum (L.)،گیاهی گل­دار از خانواده گل آفتاب­گردان یا آستراسه می­باشد. این گیاه بومی نواحی مدیترانه، شمال آفریقا و خاورمیانه است. نام خار مریم از دو ویژگی برگ­های آن مشتق شده استکه خالدار سفید بوده و دارای عصاره شیری رنگ می­باشد. از 2000 سال قبل گیاه­شناسان از دانه­های این گیاه جهت مراقبت از بافت کبد برضد سموم و درمان بیماری­های مزمن استفاده می­کردند (23 و22). مواد موثره­ی گیاه خار مریم که طی فرایند عصاره گیری استخراج می­شود، سیلی­مارین و اسیدلینولئیک می­باشند (24). بخشی از سیلی­مارین، سیلی­بینین با دو ایزومر A و B است که اثرات قوی بر سلول­های توموری نظیر پروستات، کلون و مثانه اعمال می­کند (25).

گیاه دارویی پرسیاوشان (Adiantum capillus-veneris L.) متعلق به تیره­ی بسپایکیان است. اثرات متفاوتی از قبیل: ضداستفراغ، ضدسرفه، تب­بر، مسکن و غیره به این گیاه نسبت داده می­شود (26). محل رویش این گیاه دارویی در اروپای جنوبی، کوه‏های آلپ و سواحل آتلانتیک و همچنین شمال ایران است (27). از جمله ترکیبات متفاوت در پرسیاوشان می­توان به فلاونوئیدها، استرهای سولفات، هیدروکسی سینامیک­اسید، کافئیک‏اسید، کاپیلارین، موسیلاژ، انواع تری­ترپنوئیدها، استرول­ها، تانن، صمغ، کوئینیک­اسید، شیکیمیک­اسید و قند اشاره کرد (28). از طرفی ترکیبات متعدد آنتی­اکسیدانتی در این گیاه شناسایی شده است وتحقیقات متعدد اثرات ضدتوموری، ضدمیکروبی، ضدالتهابی، ضدآلرژی، ضد دیابت و تنظیم­کننده­ی فعالیت تیروئید را نیز به آن نسبت داده­اند (35-29).

زردآلو، Prunus armeniaca L.، به‏عنوان یکی از درختان هسته دار مناطق معتدله در بسیاری از نقاط ایران کشت و کار می­شود. مناطق عمده­ی کشت زردآلو در کشور شامل استان‏های آذربایجان شرقی، غربی، سمنان، تهران، یزد، کرمان، زنجان، و خراسان رضوی است و ایران بعد از ترکیه مقام دوم در تولید زدآلو را در جهان دارد (36). بر طبق مطالعات روان و همکاران (37) هسته­های زردآلو و هلو که به‏شکل خام آن مصرف می­شوند سبب القای مرگ برنامه ریزی شده سلولی و تمایز در سلول­های توموری می­شوند. سلول­های سرطانی DU145 و LNCaP پروستات انسان تغییرات مورفولوژیکی مرتبط با مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی و به‏همان اندازه افزایش بیان Bax و فعالیت آنزیم کاسپاز-3 را، بعد از اضافه کردن عصاره­ی هسته­ی زردآلو را نشان می­دهند (37). هسته­های زردآلو و هلو متشکل از موادی نظیر گلیکوزیدها به‏شکل آمیگدالین، روغن­هایی نظیر اولئیک‏اسید و لینولئیک­اسید، روغن­های فرار مانند بنزالدئید هستند (38). علاوه­براین، هسته­ی زردآلو حاوی پلی­فنول­هایی نظیر فلاونوئیدها و گالیک اسید نیز است (38، 39). در مطالعه­ایی که اخیرا منتشر شده، افزودن غلظت­های بالای عصاره­ی هسته­ی زردآلو به محیط کشت سلول­های سرطان کلون HT-29 در یک دوره­ی 24 ساعته، سبب کاهش تکثیر سلول‏ها شده بود. این‏درحالی است که غلظت­های پایین سبب افزایش تکثیر شده بودند. علاوه بر این محققین مشاهده کردند که غلظت­های بالا پس از گذشت 72 ساعت باعث افزایش تکثیر و غلظت­های پایین سبب کاهش تکثیرسلول‏ها شده­ بودند (40).

اطلاعات کمی راجع به مقایسه تاثیر گیاهان مختلف در القای مرگ برنامه­ریزی شده و اثرات ضد تکثیری آن‏ها بر علیه سلول­های سرطانی وجود دارد. در این تحقیق بر آن شدیم که به مقایسه­ی اثرات ضدسرطانی (در قالب سمیت سلولی و بررسی مرگ برنامه­ریزی شده) عصاره­های اتانولی چند گیاه متفاوت (بومادران، سرخارگل، خارمریم، پرسیاوشان و هسته­ی زردآلو) در غلظت­های متفاوت با کمک آزمون MTT و رنگ‏آمیزی فلوروسنت آکریدین نارنجی-اتیدیوم­بروماید، بر علیه رده­ی سلول­های سرطانی سینه MCF-7 بپردازیم.

 

مواد و روش‌ها

­­ این مطالعه­ی پژوهشی در زمستان سال 1398 در آزمایشگاه کشت سلول دانشگاه رازی انجام گرفت.

تهیه عصاره گیاهی: نمونه­های گیاه بومادران در خرداد 98 از شهرستان کرمانشاه جمع­آوری، شسته و خشک شدند. هسته‏های زردآلو نیز پس از مصرف میوه­ی آن، تهیه و خشک شدند. سه گیاه پرسیاوش، دانه­ی خارمریم و سرخارگل از عطاری تهیه شدند. جهت تهیه عصارهای الکلی، نمونه­های گیاهی در الکل 70 درصد خیسانده شدند (41). برای اجرای کار، نمونه­های گیاهی (بومادران، سرخارگل، دانه­ی خار مریم، هسته زردآلو و پرسیاوشان) با استفاده از دستگاه آسیاب پودر شدند. 10 گرم از پودر به‏دست آمده به 100 میلی­لیتر الکل 70 درصد اضافه شد و برای مدت 72 ساعت در دستگاه همزن در دمای اتاق مخلوط شد. در ادامه محلول گیاه و الکل سانتریفیوژ شد و مایع رویی با کمک کاغذ صافی واتمن 1 صاف شد. سپس در جهت جداسازی الکل با کمک دستگاه روتاری (Heidolph Rotary Evaporator 4011) نمونه عصاره به بالن تقطیر دستگاه اضافه شد و در خلا در 45 درجه سانتی‏گراد، بادور 120 و زمان 15 دقیقه جداسازی صورت گرفت. فاز آبی در آون (Memmert) در 45 درجه‏ی سانتی­گراد برای مدت 48 ساعت خشک شده، پودر شد و تا زمان استفاده در فریزر 20- سانتی‏گراد نگهداری شد. از عصاره­های خشک شده، غلظت­های متفاوت 5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی­لیتر آب برای استفاده تهیه شد.

رده­ی سلولی MCF-7 از رده­های سلولی سرطان سینه، از بانک سلولی انسیتیو پاستور تهیه شد و جهت فرآیند کشت مورد استفاده قرار گرفت. محیط کشت DMEM (Gibco) مکمل شده با 10 درصد سرم گوساله­ی جنینی FBS (Gibco) همراه با 1 درصد آنتی­بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین (Sigma)، جهت اجرای آزمایش‏ها مورد استفاده قرار گرفت. سلول‏ها پس از کشت در محیط کشت DMEM مکمل شده با FBS و آنتی‏بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین در انکوباتور (Binder) حاوی 5 درصد دی­اکسیدکربن، هوای اتمسفری مرطوب، و 37 درجه­ سانتی­گراد کشت و تکثیر شدند. از سلول­های پاساژ سوم جهت مراحل کار استفاده شد. جهت شمارش سلولی و بررسی تعداد سلول­های زنده، از رنگ تریپان بلو و لام هموسایتومتر استفاده شد (42).

بررسی تاثیر سمیت عصاره­های گیاهی بر سلول­های سرطان سینه: جهت بررسی سمیت عصاره­های گیاهی بر    سلول­های سرطان سینه از تست MTT (Sigma) استفاده شد. جهت انجام آن پودر MTT به‏حالت محلول با غلظت 5 میلی­گرم در میلی­لیتر در بافر DPBS حل شد. در ادامه محلول تهیه شده با استفاده از فیلتر 2/0 میکرومتر جهت حذف آلودگی­های احتمالی و همچنین باقی­مانده­های حل نشده­ی پودر MTT فیلتر شد. رنگ تا زمان استفاده در فریزر نگهداری شد. سلول­های مورد نظر با غلظت 10000 سلول در پلیت 96 خانه کشت شدند. محیط رویی این سلول‏ها DMEM مکمل شده با 10 درصد سرم گوساله­ی جنینی و آنتی‏بیوتیک­های پنی­سیلین و استرپتومایسین بود. برای هر عصاره 4 غلظت در سه تکرار سلول در چاهک­ها کشت شد. سلول‏ها در شرایط یکسان در انکوباتور کشت سلول 5 درصد دی­اکسیدکربن، هوای اتمسفری مرطوب، و 37 درجه­ی سانتی­گراد کشت شدند. علاوه­براین، جهت رسم نمودار استاندارد و محاسبه­ی تعداد     سلول­های گروه­های تیماری، سلول‏ها با غلظت­های متفاوت 10000، 20000، 30000، 40000، 50000 سلول در سه تکرار در پلیت 96 خانه در همان روز کشت شدند. پس از گذشت 24 ساعت از کشت، محیط کشت رویی خارج شد و به سلول‏ها محیط جدید با غلظت­های متفاوت عصاره­های اتانولی بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوشان و هسته­ی زردآلو در غلظت­های متفاوت (5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی­لیتر) اضافه شد. بعد از طی زمان انکوباسیون 24 ساعت، 20 میکرولیتر از محلول MTT به سلول‏ها اضافه شد. در ادامه، سلول‏ها برای مدت زمان 4 ساعت در انکوباتور انکوبه شدند. پس از پایان زمان انکوباسیون، مایع رویی برداشته شد. به‏هر چاهک 100 میکرولیتر محلول DMSO (Sigma) اضافه شد. پس از حل شدن کریستال‏های بنفش رنگ، در دستگاه الایزاریدر  BioTek (Power Wave XS2)با طول موج 570 نانومتر خوانش انجام گرفت (43).

سنجش میزان مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی با کمک رنگ آکریدین­نارنجی-اتیدیوم­بروماید: برای انجام این آزمون و بررسی القای مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی، غلظت­های مختلف عصاره­های الکلی گیاهی (5/12، 25، 50 و 100 میکروگرم در میلی­لیتر) به محیط کشت سلول­های سرطان سینه اضافه شد. بعد از گذشت 24 ساعت از کشت، به‏وسیله­ی رنگ آمیزی آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید، مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی سلول‏ها مورد بررسی قرار گرفت. برای‏ این ‏منظور، پس از اتمام دوره­ی کشت، مایع رویی سلول‏ها حذف شدند و با محلول بافر DPBS شست‏وشو انجام گرفت. در ادامه، سلول‏ها توسط محلول پارافرم­آلدهید 4 درصد برای مدت زمان 15 دقیقه ثابت شدند. سپس مایع رویی حاوی محلول ثابت کننده، حذف شد و به آن DPBS اضافه شد. در ادامه، در زمان عکسبرداری به‏هر چاهک 2 میکرولیتر محلول آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید (نسبت حجمی 1:1 هر کدام از رنگ­ها) اضافه شد و پپیپتاژ شد. نهایتا، نمونه­ها زیر میکروسکوپ فلورسانس ارزیابی، شمارش و عکس‏برداری شدند (44).

تحلیل آماری

جهت اجرای آزمون MTT، همان‏طور که در قسمت مواد و روش­ها ذکر شد، غلظت­های متفاوت سلولی کشت شدند تا بتوان در اکسل نمودار استاندارد را رسم کرد. از فرمول رگرسیونی که نمودار استاندارد ارائه داد، با کمک OD حاصل از آزمون MTT عصاره­های الکلی گیاهی مختلف و در غلظت­های متفاوت، تغییرات تعداد سلولها محاسبه شد. پس از محاسبه تعداد سلول‏ها با توجه به این‏که حدقل سه تکرار برای هر تیمار وجود دارد، نمونه­ها وارد نرم افزار SPSS (ورژن 16) شد و آنالیز آماری در قالب طرح فاکتوریل کاملا تصادفی و مقایسه میانگین دانکن صورت گرفت. جهت آزمون مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی نیز در قالب طرح فاکتوریل کاملا تصادفی و مقایسه میانگین دانکن، آنالیز آماری صورت گرفت. داد­ه‏ها در سطح معنی‏داری 5 درصد مورد آنالیز قرار گرفتند.

 

نتایج

نتایج این مطالعه نشان داد که افزودن غلظت­های متفاوت عصاره­های گیاهان ذکر شده (بومادران، سرخارگل، پرسیاوش و هسته­ی زردآلود) به محیط کشت سلول­های سرطانی، سبب کاهش تکثیر و افزایش مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی در سلول‏های سرطان سینه شده بود (جدول 1و 2 شکل 1). بیش‏ترین میزان کاهش تکثیر و افزایش مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی، مربوط به غلظت 100 میکروگرم در میلی­لیتر بود (05/0>p). البته بایستی توجه داشت که کم‏ترین میزان کاهش تکثیر و افزایش میزان مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی مربوط به غلظت 100 میلی­گرم در میلی­لیتر از عصاره­های پرسیاوش و سرخارگل بود که نسبت به سایر عصاره­ها با همان غلظت اختلاف معنی­دار نشان می­داد (جدول 1و 2) (05/0>p). در مطالعه‏ی حاضر کمترین اثر کشندگی و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی مربوط به عصاره­ی اتانولی دانه­ی گیاه خار مریم بود (05/0<p). هرچند که غلظت 100 این عصاره در مقایسه با سایر غلظت­های آن بیش‏ترین تاثیر را داشت (05/0>p). علاوه‏براین، غلظت 100 عصاره­ی خارمریم نسبت به سایر عصاره­ها با همین مقدار،کم‏ترین تاثیر کشندگی و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی را داشت.

 

جدول 1: بررسی میزان سمیت سلولی غلظت­های مختلف عصاره­ی گیاهان مختلف (بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوش و هسته­ی زردآلو)- با کمک آزمون MTT

تیمار

تعداد سلول­های زنده پس از آزمون MTT

شاهد

bc66/85 ±10994

عصاره بومادران غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

f76/92 ±10048

عصاره بومادران غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

j92/78 ±8916

عصاره بومادران غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

i12/75±9242

عصاره بومادران غلظت 100 میکروگرم در میلی‏لیتر

l45/52±7750

عصاره خارمریم غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

a01/68±11525

عصاره خار مریم غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

b40/75±11141

عصاره خار مریم غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

c61/97±10843

عصاره خار مریم غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

hi60/83±9287

عصاره سرخارگل غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

d07/63±10585

عصاره سرخارگل غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

ed74/175±10441

عصاره سرخارگل غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

h92/104±9430

عصاره سرخارگل غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

o13/148±6596

عصاره پرسیاوش غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

g15/89±9876

عصاره پرسیاوش غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

j52/39±8929

عصاره پرسیاوش غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

k63/65±7982

عصاره پرسیاوش غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

n36/49±6769

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

e16/114±10313

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

i09/55±9232

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

k09/55±7958

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

m98/64±7302

میانگین­های دارای حروف متفاوت در هر ستون اختلاف معنی­دار دارند.

میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون نشان­­دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار بین گروههای تیماری است.

 

جدول 2: درصد زنده­مانی سلول­های سرطان سینه رده­ی (MCF-7) پس از تیمار با غلظت­های مختلف عصاره­ی گیاهان مختلف (بومادران، خارمریم، سرخارگل، پرسیاوش و هسته­ی زردآلو) – با کمک ارزیابی آکریدین نارنجی- اتیدیوم بروماید

 

تیمار

درصد زنده­مانی پس از بررسی مرگ برنامه ریزی شده سلولی با رنگ­آمیزی آکریدین نارنجی-اتیدیوم بروماید

شاهد

a76/0 ±56/99

عصاره بومادران غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

a79/0 ± 17/98

عصاره بومادران غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

cde94/1 ± 12/91

عصاره بومادران غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

ef16/1 ± 24/88

عصاره بومادران غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

h14/2 ± 89/72

عصاره خارمریم غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

a32/1 ± 68/98

عصاره خار مریم غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

a39/2 ± 94/97

عصاره خار مریم غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

ab63/0 ± 93/96

عصاره خار مریم غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

def09/2 ± 21/89

عصاره سرخارگل غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

ab25/2 ± 93/95

عصاره سرخارگل غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

bcd67/0 ± 93/92

عصاره سرخارگل غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

ef74/2 ± 03/88

عصاره سرخارگل غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

j29/2 ± 11/60

عصاره پرسیاوش غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

bc40/1 ± 8/93

عصاره پرسیاوش غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

f47/2 ± 80/86

عصاره پرسیاوش غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

g94/2 ± 28/80

عصاره پرسیاوش غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

j88/3 ± 33/59

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر

ab38/2 ± 96/95

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر

ef10/1 ± 13/87

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر

f41/2 ± 17/85

عصاره هسته­ی زردآلو غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر

i 27/2± 28/65

 

میانگین­های دارای حروف متفاوت در هر ستون اختلاف معنی­دار دارند.

میانگین­های دارای حروف مشترک در هر ستون نشان­­دهنده­ی عدم اختلاف معنی­دار بین گروههای تیماری است.

 

 

 

شکل1: رنگ آمیزی همزمان اتیدیوم بروماید-آکریدین نارنجی سلول­های سرطانی تیمار شده با غلظت­های مختلف عصاره گیاهی مختلف (a1: شاهد، a2، غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a3: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a4: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، a5: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره بومادران، b1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خارمریم، b2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، b3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، b4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره خار مریم، c1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، c4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره سرخارگل، d1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش، d2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش ، d3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش ، d4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره پرسیاوش، e1: غلظت 5/12 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هسته­ی زردآلو ، e2: غلظت 25 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هسته­ی زردآلو ، e3: غلظت 50 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هسته­ی زردآلو ، e4: غلظت 100 میکروگرم در میلی لیتر عصاره هسته­ی زردآلو).

 

بحث

بیشتر بیماران سرطانی در اثر رشد اولیه­ی تومور جان خود را از دست نمی­دهند، بلکه در پی رشد و توسعه­ی آن جانشان در معرض خطر قرار می­گیرد. جلوگیری و مهار رشد تومور مهاجم و متاسازی، ابزاری امیدوارکننده جهت کاهش مرگ و میر بیماران مبتلا به تومورهای بدخیم است. در سال‏های اخیر مطالعات بر روی داروهای ضدتومور رو به افزایش است. برخی از این مطالعات بر روی مواد طبیعی انجام می­گیرد تا قابلیت جایگزینی درمان در برخی سرطان‏ها از جمله سرطان سینه بررسی شد (47-45). برخی بخش­های داروهای گیاهی از قبیل، ریشه­ها، ساقه­ها، برگ­ها و گل­ها برای تولید غذا و درمان بر علیه برخی از بیماری­ها مورد استفاده قرار می­گیرند که می­توانند حاوی متابولیت­های اولیه و ثانویه باشند. متابولیت­های اولیه همان کربوهیدراتها، پروتئین­ها، و لیپیدها هستند درحالی‏که متابولیت­های ثانویه شامل فلاونوئیدها، کاروتنوئیدها، ترپنوئیدها هستند که نقش مهمی در انواع فعالیت­های بیولوژیکی برعهده دارند. علی­رغم افزایش تحقیقات در این زمینه، هنوز ابهامات زیادی برای گسترش استفاده کاربردی از این ترکیبات وجود دارد.

در مطالعه­ی حاضر، غلظت­های بالای عصاره­های هیدروالکلی کلیه گیاهان مورد استفاده، در مقایسه با غلظت‏های پایین آن اثرات معنی­دار به مراتب بالاتری در زمینه­های ضدتکثیری و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی نشان می­داد. علاوه­براین، غلظت 100 میکروگرم در میلی­لیتر از گیاهان سرخارگل و پرسیاوش در مقایسه با سه گیاه دیگر تاثیر ضدتکثیری و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی بالاتری را نشان می­داد.

در مطالعات دیگر نیز تاثیرات مثبت این عصاره­ها بر سلول­های سرطانی مختلف ثبت شده است. در مطالعه­ی جعفریانی و همکاران (21) که از عصاره­ی آبی سرخارگل بر سلول­های سرطانی آستروسایتوما استفاده کردند، تاثیر مثبت غلظت 1000 میکروگرم بر میلی­لیتر را طی آزمون MTT مشاهده کردند که این غلظت سبب کاهش بقای سلول‏ها شده بود. در مطالعه­ی دیگر تاثیر عصاره­ی هیدروالکلی گل­های سرخارگل و ماده­ی موثره­ی آن (Cichoric acid) بر سلول­های سرطان کولون انسانی Cavo-2 و HCT-116 مورد بررسی قرار گرفت. اثرات سمی این ترکیبات بر تکثیر سرطانی هر دو رده تایید شده بود (48). علاوه­براین، بخش هگزان عصاره­ی ریشه­ی سه گونه­ی سرخارگل اثرات ضد سرطانی خود را اثبات کرده­اند (49). در مطالعه­ایی دیگر تاثیر عصاره­ی هیدروالکلی ریشه­ی مخلوط دو گونه­ی سرخارگل بر رده­های مختلف سلولی در غلظت­های متفاوت مورد ارزیابی قرار گرفت. مشاهده شد که عصاره­ی مخلوط سبب افزایش رشد سلول­های سرطانی Hela و QBC-939 می­شود (50). عصاره­ی گیاه سرخارگل از ترکیبات متعددی شامل، ترکیبات قطبی (مشتقات کافئیک‏اسید)، غیرقطبی (آلکیل­آمیدها و متابولیت­های ثانویه­ی استیلنی) و ساختارهای با وزن­مولکولی بالا (پلی­ساکاریدها و گلیکوپروتئین­ها) تشکیل شده است. آلکیل­آمیدهای جداسازی شده از گونه­های سرخارگل اغلب متابولیت­های ثانویه­ای با یک یا بیش از یک گروه استیلنی در بخش انتهای زنجیره­ی خود هستند که فعالیت­های بیولوژیکی متعددی از خود نشان می­دهند (51). ترکیبات استیلنی منابع مختلف اثرات سمی برعلیه سلول­های سرطانی اعمال می­کنند و فعالیت سمیت سلولی داروهای ضدسرطانی را نیز افزایش می­دهند (52). مصرف عصاره­ی ریشه­ی آن سبب تحریک تولید سایتوکین TNF به‏وسیله­ی کانکاوالین-A توسط سلول­های طحال شده است (53). مطالعات دیگری نیز مشابه با مطالعه­ی حاضر تاثیر مثبت عصاره­ی پرسیاوش را بر سلول‏های سرطانی مورد ارزیابی قرار داده­اند. عصاره­ی پرسیاوش دارای اثرات ضدسرطانی است که فعالیت خود را از طریق پروتئین­های دخیل در چرخه­ی سلولی و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی یعنی Bcl-2 و سیکلین D1 اعمال می­کند (54). در مطالعه­ایی دیگر اثر سمیت بخش­های هوایی و زیرزمینی پرسیاوشان بر مهار رشد سلول­های رده­ی سرطان سینه مورد تایید قرار گرفته است (55). در بخش­های متعدد دنیا از گیاهان دارویی برای تقویت سلامتی استفاده می­شود عصاره­ی متانولی پرسیاوش اثرات ضدسرطانی را نشان داده است (56).

عصاره­ی هسته­ی زردآلو نیز اثرات مثبت ضدتکثیری و القای مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی بر سلول‏های مورد مطالعه اعمال کرده بود. گرچه این غلظت در مقایسه با بومادران و دانه­ی خارمریم اثرات معنی­دار بیش‏تری نشان می­داد، اما در مقایسه با سرخارگل و پرسیاوش تاثیر 100 میکروگرم در میلی­لیتر آن معنی­دار نبود. بررسی خواص آنتی­اکسیدانتی عصاره­ی واریته­های مختلف هسته­ی زردآلو در مطالعه دیگری نشان داده است که واریته­های Habbi، Waflu Chuli، Thukdeena و Balaani منابع غنی از ترکیبات بیواکتیو و آنتی­اکسیدانتی هستند. بیش‏ترین فعالیت مهار رشد سلول­های سرطانی (HepG2) در واریته­ی Waflu Chuli دیده شده هرچند که ارتباطی بین محتوی فیتوشیمیایی  و مهار تکثیر سلول­های سرطانی پیدا نشده است (57). در مطالعه­ی ما از مخلوطی از هسته­های واریته­های متفاوت زردآلو عصاره­گیری انجام گرفت. شاید اگر ما نیز مشابه با مطالعه­ی چن و همکاران (57) در سال 2019، از واریته­های مختلف عصاره­گیری انجام می­دادیم تاثیرات به‏مراتب مثبت‏تر را در این مطالعه مشاهده می­نمودیم و اختلافات بین واریته­ها نیز مشخص می­شد. در مطالعه­ی دیگر اثرات ضدتکثیری غلظت­های متفاوت عصاره­ی هسته­ی زردآلو بر روی سلول­های سرطان کولون HT-29 مورد ارزیابی قرار گرفت. پس از گذشت 24 ساعت، غلظت­های پایین محرک رشد سلول­های سرطانی بوده و غلظت­های بالا به­عنوان مهارکننده­ی رشد عمل کرده است. این‏در‏حالی بود که پس از گذشت 72 ساعت، غلظت پایین اثرات مهارکنندگی داشته و غلظت­های بالا اثرات محرکی برای تکثیر سلول­های سرطانی اعمال کرده­اند (40).

اثر سودمند غلظت بالای بومادران در مطالعه­ی ما مشاهده شده است هر چند که نسبت به غلظت بالای عصاره­ی سرخارگل، پرسیاوش و هسته­ی زردآلو معنی­دار نبود. شاهانی و همکاران (58) اثرات سودمند عصاره­ی متانولی گیاه بومادران را بر مهار رشد سلول­های سرطانی پروستات همراه با bleomycin مورد بررسی قرار داده­اند. این محققین برخلاف مطالعه­ی ما که از عصاره­ی اتانولی استفاده نمودیم، از عصاره متانولی و همچنین از غلظت­های بسیار بالای این عصاره در مطالعه­ی خود استفاده کردند (20، 50، 100، 500، 1000 و 2000 میکروگرم در میلی­لیتر) و اثرات ضدتکثیری را در ترکیب باbleomycin  و به‏تنهایی مشاهده نمودند. به‏علاوه، در آن مطالعه مشاهده شد که عصاره­ی متانولی بومادران سبب مهار رشد سلول­های طبیعی پوست انسان HFFF2 نمی­شود (54). متابولیت‏های Guaianolide جداسازی شده از عصاره­ی گیاه بومادران، پتانسیل ضدتکثیری بالایی را بر پنج رده­ی سلولی تومور سرطان ریه در انسان ارائه نموده و حتی در آن مطالعه گزارش شده که از سیس-پلاتین نیز قویتر عمل کرده است (59). مطالعات دیگری نیز اثرات ضدتکثیری عصاره­ بومادران را بر رده­های سرطانی سلول­های کبدی (60) نشان داده­اند. علاوه­براین در سال 2017، در مطالعه­ی دیگر بر روی سلول­های سرطانی پروستات (PC3) مشاهده شد که عصاره­ی هیدروالکلی بومادران علاوه­بر اعمال اثرات ضدتکثیری و مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی، قادر به مهار بیان تلومراز ترانس­کریپتاز معکوس انسانی در سلول­های سرطان پروستات انسان بود (61). براساس این مطالعه، آسیب کبدی به سلول‏ها و هپاتوسیت، ناشی از مصرف سیس­پلاتین در موش­های صحرایی پس از مصرف اسانس و عصاره­ی بومادران کاهش یافته بود (10).

در جستجوی داروهایی با اثرات ضدسرطانی و بدون اثرات جانبی که تنها سلول­های سرطانی را حذف کند، تلاش­های بسیاری صورت پذیرفته است و سنتز و استفاده از ترکیبات با پایه­ی طبیعی یا تغییر ساختار محصولات طبیعی می­تواند کمک­کننده باشد. یکی از محصولات طبیعی گیاه خار مریم است. در حقیقت از این گیاه برای حفاظت از بافت کبد در طول و بعد از شیمی درمانی و پرتودرمانی به‏عنوان نوعی درمان کمکی همچنین جهت درمان عوارض کبدی و صفراوی نیز استفاده می­شود (62). دانه­ی خار مریم غنی از سیلیمارین و مخلوطی از مولکول‏های پلی­فنولی است. یکی از ترکیبات موثر در این گیاه با اثرات ضدسرطانی، سیلیمارین است و بیشتر ماده­ی موجود در آن، سیلیبین است، نوعی از فلاونون خارمریم و فلاونولیگنان که اثرات ضدتوموری ویژه دارد (65-63). در مطالعه­ی حاضر در مقایسه با سایر عصاره­های گیاهی، عصاره­ی اتانولی دانه­ی خار مریم در مقایسه با سایر عصاره­ها در غلظت بالا پس از گذشت 24 ساعت از تیمار، کم‏ترین تاثیر کشنده­گی معنی دار را داشت. هرچند که غلظت 100 میکروگرم این عصاره درمقایسه با سایر غلظت­های پایینتر آن، بیش‏ترین کشندگی را نشان می­داد. افزودن عصاره­ی آبی خار مریم سبب مهار فعالیت سلول­های سرطانی معده شده است (66). پاسخ سلول­های مختلف به عصاره­ها و حتی ترکیبات مختلف متفاوت است. شاید اگر ما از غلظت­های به‏مراتب بالاتری در مورد بومادران و خارمریم حتی سایر عصاره­های موجود در این مطالعه استفاده می­کردیم، تاثیرات مثبت و معنی­دار بیشتری را مشاهده می­کردیم.

 

 

نتیجه­گیری

در پایان به‏نظر می­رسد که غلظت­های بالای عصاره­های گیاهی (100 میکروگرم در میلی­لیتر) مورد استفاده در این مطالعه در مقایسه با غلظت­های پایین اثرات معنی­داری بیشتری را نشان می­دهد. همچنین در بین غلظت­های 100 میکروگرم در میلی لیتر از عصاره گیاهان مورد استفاده در این مطالعه، گیاه سرخارگل و پرسیاوش در مقایسه با سه گیاه دیگر تاثیرات معنی­دار بالاتری را نشان دادند. مطالعات بیش‏تری نیاز است که تاثیر معنی­دار گیاهان دارویی را با هم مقایسه کند و علاوه­براین، غلظت­های بالاتر این ترکیبات نیز بایستی مورد بررسی قرار بگیرند.‏ هم‏چنین بررسی اثرات ضدسرطانی ترکیبی از عصاره­های گیاهان استفاده شده در این مطالعه در شرایط آزمایشگاهی و درون­تنی توصیه می­شود.

 

تشکر و  قدردانی

بدین وسیله از همکاری معاونت محترم پژوهشی و فناوری، مدیریت محترم امور پژوهشی و سرپرست محترم گروه برنامه‏ریزی و نظارت پژوهشی دانشگاه رازی جهت انجام این پژوهش قدردانی می­شود.

1. Ghoncheh M, Pournamdar Z, Salehiniya H. Incidence and mortality and epidemiology of breast cancer in the world. Asian Pac J Cancer Prev. 2016; 17(S3):43–6.
2. Chew HK. Adjuvant therapy for breast cancer: who should get what? West J Med. 2001;174(4): 284–7.
3. Greenwell M, Rahman PK. Medicinal plants: their use in anticancer treatment. Int. J. Pharm. Sci. Res. 2015; 6(10):4103-12.
4. Borneo R, Leone A.E, Aguirre A, Ribotta P, et al. Antioxidant capacity of medicinal plants from the province of Cordoba (Argentina) and their in vitro testing in a model food system. Food Chem. 2009; 112:664-70.
5. Wichtl M, Bisset NG, Czygan FC, Brinckmann JA, et al. Herbal drugs and phytopharmaceuticals: A handbook for practice on a scientific basis. Medpharm Scientific Publishers. 2001. 125-75.
6. Nair SC, Kurumboor SK, Hasegawa JH. Saffron chemoprevention in biology and medicine: a review. Cancer Biother. 1995;10(4): 257-64.
7. Amjad L, Majd A , Fallahian F, Saadatmand S. Comparative study of allergenicity of mature and immature pollen grains of Achillea wilhelmsii. J Arak Uni Med Sci. 2008; 11(2):1-9.
8. Asgary S, Naderi GH, Sarrafzadegan N, Mohammadifard N, et al. Antihypertensive and antihyperlipidemic effects of Achillea wilhelmsii. Drugs Exp Clin Res. 2000; 26(3): 89-93.
9. Ghahreman A.  Flore Iran. 11th Ed. Tehran: Research Institute of Forests and Rangelands; 1989.
10. Ghanbari S, Amjad L, Shahanipur K. The effect of essential oil of Achillea wilhelmsii flowers on cisplatininduced hepatotoxicity. Feyz. 2017; 21(5): 398-406.
11. Niazmand S, Khooshnood E, Derakhshan M. Effects of Achillea wilhelmsii on rat’s gastric acid output at basal, vagotomized, and vagal-stimulated conditions. Pharmacog Mag. 2010; 6(24): 282- 285.
12. Sharififar F, Pournourmohammadi SH, Arabnejad M. Immunomodulatory activity of extract aqueous of Achilleawilhelmsii C.Koch in mice. Indian J Exp Biol. 2009; 47(8): 668-671.
13. Dalali Isfahani L,Monajemi R, Amjad L. Cytotoxic effects of extract and essential oil Leaves of Achillea wilhelmsii C.Koch on colon cancers cells. Exp Animl Biol. 2013; 3: 1-6.
14. Amira MK, Abouelella Yasser E, Shahein Sameh S, Tawfik Ahmed M. Phytotherapeutic effects of Echinacea purpurea in gamma-irradiated mice. J Vet Sci. 2007;8(4):341-51.
15. Awang DVC, Kindack DG. Herbal medicine. Echinacea. Can Pharm J. 1991; 124:512-5.
16. Bauer R, Wagner H. Echinacea species as potential immunostimulatory drugs. EMPRJ. 1991; 5:253 - 321.
17. Schoneberger D. The influence of immune- stimulating effects of pressed juice from Echinacea purpurea on the course and severity of colds. Pharmacogn Res. 1992; 8:2-12.
18. Hashemi M, Soudy S. Study the effect of purple coneflower (Echinacea purpurea) extract in tardiness plethora and reproductive response of lien in mouse. Cell J. 2007; 4: 254-261.
19. Chung T, Sung M, Young C. Novel and therapeutic effect of caffeic acid and caffeic acid phenyl ester on hepatocarcinoma cells: complete regression of hepatoma growth and metastasis by dual mechanism. FASEB. 2004; 18(14): 1670-81.
20. El-Refaei MF, El-Naa MM. Antioxidant and apoptotic effects of caffeic acid phenethyl ester induced marked inhibition on human breast cancer cell line. Asian J Biochem. 2011; 6(1): 82- 89.
21. Jafaryani H, Sabooni F, Sanjarian F, Abdoosti V. Evaluation of cytotoxic effect of aerial part Echinacea purpurea extract on astrocytoma cancer cells. 2th National Conference on Sustainable Medicinal Plants and Agriculture. Hamedan. Assessment Environment Association Hegmataneh. 21 August 2014.
22. Tamayo C, Diamond S. Review of clinical trials evaluating safety and efficany of milk thistle. Integr. Cancer Ther. 2007; 6(2): 146-157.
23. Hogan FS, Krishnegowda NK, Mikhailova M, Kahlenberg MS. Flavonoid, silibinin, inhibits proliferation and promotes cell-cycle arrest of human colon cancer.J Surg Res. 2007; 143(1): 58-65.
24. Kroll DJ, Shaw HS, Oberlies NH. Milk thistle nomenclature: why it matters in cancer researcher and pharmacokinetic studies. Integr. Cancer Ther. 2007; 6(2): 158-168.
25. Mohan S, Dhanalakshmi S, Mallikarjuna GU, Singh RP, et al. Silibinin modulates UVB-induced apaptosis via mitochondrial protein, caspases activation, and mitogen-activated protein kinase signaling in human epidermal carcinoma A431 cell. Biochem Biophys Res Commun. 2004; 320(1): 183-189.
26. Ansari R, Ekhlasi-Kazaj K. Adiantum capillus-veneris. L: phytochemical cons-tituents, traditional uses and pharmacological properties. J Adv Sci Res. 2012; 3(4): 15-20.
27. Heber, PDR for herbal medicine. 3rd ed. London: Thomson publication; 2004. 542-3.
28. Nakane T, Maeda Y, Ebihara H, Arai Y, et al. Fern constituents: Triterpenoids from Adiantum capillus subsp. veneris. Chem Pharm Bull. 2002; 50(9): 1273–1275.
29. Guha P, Mukhopadhyay R, Pal PK, Gupta K. Antimicrobial activity of crude extracts and extracted phenols from gametophyte and sporophytic plant parts of Adiantum capillus subsp veneris. Allelopathy J. 2004; 13: 57-66.
30. Viral D, Shivanand P, Jivani NP. Anticancer evaluation of Adiantum venustum Don. J Young Pharm.2011; 3(1): 48-54.
31. Tantawy EL. Antimicrobial affects of alcoholic extracts of Adiantum capillus subsp. veneris. Biochem J. 2003; 2: 256-261.
32. Mabeza GF, Macfarlane J. Pulmonary actinomycosis. Eur Respir J. 2003; 21(3): 545–555.
33. Yuan Q, Zhang X, Liu Z, Song S, et al. Ethanol extract of Adiantum capillus subsp. veneris L. suppresses the production of inflammatory mediators by inhibiting nf-κb activation. J. Ethnopharmacol. 2013; 147(3): 603-611.
34. Ranjan V, Vats M, Gupta N, Sardana S. Antidiabetic potential of whole plant of Adiantum capillus subsp. veneris L. In streptozotocin induced diabetic rats. Int J Pharm Clin Res. 2014; 6: 341-347.
35. Vijayalakshmi A, Kiran Kumar Y. Evaluation of goitrogenic and antithyroidal effect of the fern Adiantum capillus subsp. veneris. Revista Brasileira de Farmacognosia Brazilian. J Pharmacogn. 2013; 23: 802-810.
36. Anonymous. FAO statistical database. 2011; Available at: http://apps.fao.org.
37. Ruan W, Lai M, Zhou J. Anticancer effects of Chinese herbal medicine, science or myth? J Zhejiang Univ SciB. 2006; 7(12):1006–14.
38. Bensky D, Clavey SES. Chinese Herbal Medicine Materia Medica. 3rd ed. Seattle, WA 98139, USA: Eastland Press Inc; 2004: 437–627.
39. Korekar G, Stobdan T, Arora R, Yadav A, et al. Antioxidant capacity and phenolics content of apricot (Prunus armeniaca L.) kernel as a function of genotype. Plant Foods Hum Nutr. 2011; 66(4): 376–83.
40. Cassiem W, Kock M. The anti-proliferative effect of apricot and peach kernel extracts on human colon cancer cells in vitro. BMC Complement Altern Med. 2019; 19(1):32.
41. Khacha-ananda S, Tragoolpua KH, Chantawannakul P, Tragoolpua Y. Antioxidant and anti-cancer cell proliferation activity of propolis extracts from two extraction methods. Asian Pac J Cancer Prev. 2013; 14(11): 6991-6995.
42. Kheradmand P, Vallian Boroujeni S, Esmaeili Mahani S. Evaluation of drug resistance to doxorubicin in MCF-7 breast cancer cell line as a result of insulin treatment. Cell & Tissue (JCT). 2019; 9 (4): 353-360.
43. Soltani L, RahmaniHR, Ph, Daliri Joupari M, Ghaneialvar H, Mahdavi AH, Shamsara M, Amirizadeh N. Evaluation of the effect of Chir99021 on proliferation of ovine fetal mesenchymal stem cells isolated from bone-marrow. Cell & Tissue (JCT). 2016; 6(4): 91-101.
44. Mohamadian Namaqi M, Parvaneh Tafreshi A, Abbasi Sh. The synthesis of albumin nanocarriers conjugated with a GSK3β inhibitor to investigate its effect on survival of breast cancer cell line MCF-7. Cell & Tissue (JCT). 2018; 9(3): 292-310.
45. Zamani Sh, Baghbani-Arani F, Sadat Shandiz SA. Evaluation of toxicity and anti-metastatic effects of Cerium oxide on human breast cancer MCF-7 and T47D cell lines nanoparticles. Cell & Tissue (JCT). 2018; 9(2): 150-159.
46. Zhou QM, Zhang H, Lu YY, Wang XF, et al. Curcumin reduced the side effects of mitomycin C by inhibiting GRP58-mediated DNA cross-linking in MCF-7 breast cancer xenografts. Cancer Sci. 2009; 100(11): 2040–2045.
47. Zhou QM, Wang XF, Liu XJ, Zhang H, et al. Curcumin enhanced antiproliferative effect of mitomycin C in human breast cancer MCF-7 cells in vitro and in vivo. Acta Pharmacol Sin. 2011; 32(2011): 1402–1410.
48. Tsai YL, Chiu CC, Chen JYF, Chan KC, et al. Cytotoxic effects of Echinacea purpurea flower extracts and cichoric acid on human colon cancer cells through induction of apoptosis. J. Ethnopharmacol. 2012; 143(3): 914–919.
49. Chicca A, Adinolfi B, Martinotti E, Fogli S, et al. Cytotoxic effects of Echinacea root hexanic extracts on human cancer cell lines. J. Ethnopharmacol. 2007; 110(1):148–153.
50. Cichello SA, Yao Q, He XQ. Proliferative activity of a blend of Echinacea angustifolia and Echinacea purpurea root extracts in human vein epithelial, HeLa, and QBC-939 cell lines, but not in Beas-2b cell lines. J Tradit Complement Med. 2016; 6(2): 193-197.
51. Pellati F, Benvenuti S, Prati F, Nieri P. Isolation, structure elucidation, synthesis, and cytotoxic activity of polyacetylenes and polyenes from echinacea pallida. Emerging Trends in Dietary Components for Preventing and Combating Disease. Chapter: 8. 2012; 131-149.
52. Dembitsky VM. Anticancer activity of natural and synthetic acetylenic lipids. Lipids. 2006; 41(10): 883–924.
53. Cadiz MP, Schara MR, Kemp BH, Johanson RMG. Echinacea purpurea root extract increases tumor necrosis factor production by concanavalin activated murine splenocytes. J Med Food. 2019; 22(11):1146-1150.
54. Rautray S, Panikar S, Amutha T, Rajananthini UA. Anticancer activity of Adiantum capillus veneris and Pteris quadriureta L. in human breast cancer cell lines.Mol Bio Rep. 2018; 45(6):1897-1911.
55. Hassanpour H, Shokrzadeh Lamouki M, Tabaripour R, Rezaei F, et al. The phytochemical study and antiprolifrative effect of hydroalcoholic extract of Adiantum capillus-veneris L. on MCF-7 and MRC-5 cell lines. Nova Biol. Rep. 2018; 5(2): 118-127.
56. Pourmorad F, Hosseinimehr SJ, Shahabimajd N. Antioxidant activity, phenol and flavonoid contents of some selected Iranian medicinal plants.Afr. J. Biotechnol. 2006; 5(11): 1142-1145.
57. Chen Y, Al-Ghamdi AA, Elshikh MS, Shah MH, et al. Phytochemical profiling, antioxidant and HepG2 cancer cells’ antiproliferation potential in the kernels of apricot cultivars. Saudi J Bio Sci. 2019; 27(1):163-172.
58. Shahani S, Hamzkanlu N, Zakeri N, Hosseinimehr SJ. Synergistic anti-tumoral effect of Achillea millefolium combined with bleomycin on prostate cancer cells. Res. Mol. Med. 2015; 3 (1): 12-17.
59. Li Y, Zhang ML, Cong B, Wang SM, et al. Achillinin A, a cytotoxic guaianolide from the flower of Yarrow, Achillea millefolium. Biosci Biotechnol Biochem. 2011; 75(8):1554-6.
60. Lin LT, Liu LT, Chiang LC, Lin CC. In vitro anti-hepatoma activity of fifteen natural medicines from Canada. Phytother Res. 2002; 16(5):440-4.
61. Ashtiani M, Nabatchian F, Galavi HR, Saravani R, et al. Effect of Achillea wilhelmsii extract on expression of the human telomerase reverse transcriptase mRNA in the PC3 prostate cancer cell line. Biomed. Rep. 2017; 7(3): 251-256.
62. Greenlee H, Abascal K, Yarnell E, Ladas E. Clinical applications of Silybum marianum in oncology. Integr. Cancer Ther. 2007; 6(2): 158–65.
63. Wellington K, Jarvis B. Silymarin: A review of its clinical properties in the management of hepatic disorders. BioDrugs. 2001; 15(7): 465–89. 
64. Mallikarjuna G, Dhanalakshmi S, Singh RP, Agarwal C, et al. Silibinin protects against photocarcinogenesis via modulation of cell cycle regulators, mitogen-activated protein kinases, and Akt signaling. Cancer Res. 2004; 64(17):6349–56.
65. Singh RP, Dhanalakshmi S, Tyagi AK, Chan DC, et al. Dietary feeding of silibinin inhibits advance human prostate carcinoma growth in athymic nude mice and increases plasma insulin-like growth factor-binding protein-3 levels. Cancer Res. 2002; 62(11):3063–9.
66. Öztürk B, Kocaoğlu EH, Durak ZE. Effects of aqueous extract from Silybum marianum on adenosine deaminase activity in cancerous and noncancerous human gastric and colon tissues. Pharmacogn Mag. 2015; 11(41): 143-146.