اثر نانو ذرات اکسیدآهن بر رشد و فیزیولوژی گیاه یونجه (Medicago sativa L) تلقیح یافته با Rhizobium meliloti

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

- دانشگاه اراک، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، اراک، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر برهم‌کنش تلقیح باکتریایی و تیمار آهن (نانو و کلات‌آهن) بر خصوصیات فیزیولوژیکی یونجه می‌باشد.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه اثرات تلقیح Rhizobium melilotiسویه استاندارد، غلظت‌های مختلف آهن (کلات آهن، ٠، ٥، ۱٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار نانو ذرات اکسیدآهن) و اثر متقابل تلقیح باکتریایی و تیمار آهن به‏مدت ٤٥ روز بر گیاه یونجه در قالب آزمایشات فاکتوریل در یک طرح کاملا تصادفی در سه تکرار مطالعه شده است. صفات مورد ارزیابی شامل شاخص‌های رشد، مقدار رنگیز‌ه‌های فتوسنتزی، پروتئین، پرولین، فعالیت آنتی‌اکسیدانت‏ها، درصد فعالیت بازدارندگی رادیکال دی‌فنیل‌پیکریل‌هیدرازیل (DPPH) و مقدار عناصر بودند.
نتایج: تلقیح ریزوبیومی به‏تنهایی اثرات سودمندی بر رشد یونجه نشان داد و باعث افزایش پارامترهای رشد، رنگیزه‌ها، میزان پروتئین و جذب پتاسیم و فسفر شد اما بر مقدار پرولین و آنتی‌اکسیدانت‌ها اثری نداشت. تیمار آهن بر پارامترهای رشد، رنگیزه‌ها، میزان پروتئین و جذب عناصر اثر مثبت داشت. بیشترین شاخص‌های رشد در غلظت 25 میکرومولار نانوآهن مشاهده شد. بیشترین مقدار پرولین و فعالیت آنتی‌اکسیدانتی در شاهد (μM 0 نانوآهن) سنجش شد. از این‌رو این غلظت برای گیاه یونجه تنش محسوب می‌شود. اثرات منفی ناشی از تیمار 0 میکرومولار نانوآهن بر گیاه یونجه تلقیح‌یافته با ریزوبیوم ملیلوتی کاهش یافت. در واقع ریزوبیوم با کاهش شرایط تنش باعث افزایش مقاومت گیاهان تلقیح‌یافته می‌شود.
نتیجه‏گیری: هم‏زیستی ریزوبیوم-یونجه همراه با نانوکود آهن علاوه بر افزایش رشد گیاه می‌تواند باعث افزایش مقاومت گیاه نسبت به تنش‌ها ‌شود. بیشترین مقدار پارامترهای رشد، رنگیزه‌ها و پروتئین در گیاهان تلقیح‌یافته با ریزوبیوم ملیلوتی و 10 میکرومولار نانوآهن اندازه‌گیری شد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 یونجه Medicago sativa یکی از مهم‏ترین محصولات علوفه‌ای خانواده لگوم است که در سراسر جهان کشت می‌شود. در ریشه‌ی اغلب گیاهان خانواده‌ی لگومینوزه از جمله یونجه برآمدگی‌هایی (گرهک) حاوی باکتری ریزوبیوم قرار دارد (۱). ریزوبیوم از ریزوباکترهای محرک رشد گیاه (PGPR) Plant Growth Promoting Rhizobacter است. این باکتری‌ها به‌طور مستقیم با تثبیت نیتروژن، محلول‌سازی فسفر، افزایش آهن در دسترس، تولید ویتامین و هورمون‌های گیاهی (اکسین، سیتوکینین، ژیبرلین و آبسیزیک ‌اسید) و به‌طور غیرمستقیم با رهاسازی آهن از ریزوسفر، تولید آنتی‌بیوتیک، تخریب اتیلن از طریق آنزیم ACC دآمیناز و مقاومت به تنش‌های زیستی و غیرزیستی باعث افزایش رشد گیاه می‌شوند (٢). در سال‌های اخیر کاربرد ریزوباکترهای محرک رشد گیاهان به‏عنوان کود زیستی، بازده محصولات کشاورزی را بدون اثرات نامطلوب بر خواص خاک بالا برده است زیرا تولید محصولات کشاورزی مستلزم استفاده‌ی مداوم از کودهای شیمیایی است که تعادل طبیعی را برهم می‌زنند، سبب انباشت آلاینده‌ها شده و سود اقتصادی را کاهش می‌دهند (٣).

آهن از عناصر ضروری کم‌مصرف است که در فتوسنتز، تنفس و تثبیت نیتروژن نقش دارد، در بخش کاتالیزوری بسیاری از آنزیم‌های اکسیداسیون و احیا قرار گرفته و برای سنتز کلروفیل و RNA مورد نیاز است. آهن در طبیعت به ‏دو فرم وجود دارد. فرم نسبتا محلول در آب (آهن فرو Fe2+) و فرم غیرمحلول (آهن فریک Fe 3+). آهن فریک فرم پایدار غالب در محیط‌های غنی از اکسیژن و خاک‌های خنثی و قلیایی است. یکی از مشکلات عمده خاک‌های قلیایی که بخش عمده‌ای از خاک مناطق خشک و نیمه‌خشک است، کمبود آهن قابل استفاده گیاه به‏دلیل pH بالای این خاک‌ها می‌باشد. با وجودی که بیشتر خاک‌ها آهن زیادی دارند ولی بیشتر آهن خاک‌ها به فرم هیدروکسید یا سایر کمپلکس‌های غیرمحلول رسوب کرده و در دسترس گیاه قرار نمی‌گیرد. انتخاب گیاه مناسب با تحمل بالا در خاک‌های قلیایی، اسیدی کردن خاک، افزودن سولفات‌آهن(ΙΙ) به خاک که سبب اسیدی شدن خاک و افزایش حلالیت آهن می‌شود و استفاده از کلات‌آهن از راه‌های کاهش کمبود آهن می‌باشد (٤). استفاده از ریزوباکترهای محرک رشد که قادر به تولید سیدروفور یا سیستم جذب آهن هستند نیز مفید است (٥). یکی از مهم‏ترین کاربردهای فناوری نانو در کشاورزی، استفاده از نانوکودها جهت تغذیه گیاهان می‌باشد. با بهره‌گیری از نانوکودها، عناصر غذایی به‏آرامی و با سرعتی مناسب در تمام فصل رشد گیاه آزاد می‌شوند و به‏دلیل کاهش آبشویی عناصر، گیاهان قادر به جذب بیشتر عناصر خواهند بود و آلودگی‌های زیست محیطی کاهش می‌یابد. نانو ذرات به‏علت سطح ویژه، چگالی بیشتر، نواحی واکنشی زیاد روی سطوح از واکنش‌پذیری زیاد برخوردار هستند. بنابراین جذب نانوکودها توسط گیاه آسان‌تر است. نانواکسید آهن سبب اسیدی شدن خاک، افزایش حلالیت عناصری مثل مس و روی، افزایش نسبت +Fe2 به +Fe3 و در نتیجه سبب افزایش جذب عناصر فوق و افزایش رشد گیاه می‌شود (٦). نانو ذرات می‌توانند دارای اثرات خنثی، منفی یا مثبت بر رشد گیاهان، همچنین رشد و توسعه همزیستی ریزوبیومی داشته باشند. غلظت نانو ذرات مهم‏ترین عامل تعیین‌کننده سمیت نانو ذرات است، زیرا حتی نانو ذرات کمتر سمی مثل نانو ذرات اکسیدروی نیز می‌توانند در غلظت‌های بالا مهارکننده باشند و نانو ذرات بسیارسمی مانند نقره می‌توانند در غلظت‌های پایین تحریک‌کننده رشد گیاهان باشند (7). غلظت‌های محیط زیستی نانو ذرات بر جوامع میکروبی خاک، گردش مواد مغذی و انتشار گازهای گلخانه‌ای تاثیر می‌گذارد (8). علاوه بر غلظت، نوع نانو ذرات، اندازه آن‏ها، روش کاربرد، گونه گیاهی هدف و شرایط آزمایشگاهی (9 و 10) نیز می‌تواند در نوع پاسخ موثر باشد. برخی مطالعات نشان می‌دهد که حضور نانو ذرات در خاک می‌تواند منجر به کاهش تنوع و عملکرد میکروارگانیسم‌های خاک شوند (11) درحالی‌که مطالعاتی نیز بیان‌کننده اثرات مثبت نانو ذرات بر جوامع میکروبی خاک و عملکرد آن‏ها (12) است. مثال‌های متعددی بیان‌کننده اثرات مثبت یا منفی نانو ذرات بر روی همزیستی ریزوبیومی است. به‏عنوان مثال، رشد و نمو گرهک در گیاهان سویا در معرض نانو ذرات Fe3O4 افزایش یافته است (13). همچنین در بررسی اثر نانو ذرات اکسیدآهن  Fe2O3 بر گرهک‌سازی و برقراری همزیستی در pea-Rhizobium در محیط ورمیکولیت، غلظت 3 گرم در لیتر نانو ذرات طی 20 روز اثر منفی و در مدت 35 روز اثر مثبت داشت ولی با افزایش غلظت تا 6 گرم در لیتر بدون توجه به تعداد روزهای در معرض (20 تا 35 روز) اثر معنی‌داری (نه منفی و نه مثبت) نداشت (14). البته باید توجه داشت که اکثر مطالعات ریزوبیومی در محیط بدون خاک یا هیدروپونیک انجام شده، که در این محیط‌ها فراهمی زیستی و تاثیرپذیری نانو ذرات با سیستم خاک خیلی متفاوت است (7). به‏منظور بهره‌برداری از پتانسیل فناوری نانو برای بهبود امنیت غذایی جهان، کاهش اثرات بد ردپای محیطی نانو در کشاورزی و حفظ عملکرد و انعطاف‌پذیری اکوسیستم، احتیاج به تحقیقات روی برهم کنش‌های بین نانو ذرات و همزیست‌های ریزوبیومی می‌باشد. در این پژوهش تاثیر توام نانو ذرات اکسیدآهن و تلقیح باکتری ریزوبیوم بر شاخص‌های رشد، جذب عناصر و فیزیولوژی گیاه یونجه بررسی شد.

 

مواد و روش‌ها

تهیه سویه‌ی باکتریایی: ریزوبیوم ملیلوتی Rhizobium meliloti استاندارد به‏صورت آمپول لیوفیلیزه(Persian Type Culture Collection: PTCC1684) از سازمان پژوهش‌های علمی و صنعتی ایران خریداری و در شرایط استریل با کمک سوهان ضدعفونی شده، شکسته و با تزریق مقدار کمی آب استریل به‏حالت تعلیق درآمد. مقدار کمی از محلول باکتریایی فوق به محیط کشت YMA (15) جامد منتقل شد. پلیت‌ها در ٢٥ درجه سانتی‏گراد به‏مدت ٣ روز انکوبه شدند. سپس کلنی‌های ریزوبیوم ملیلوتی به اسلنت‌های محتوی محیط YMA جامد جهت ذخیره ماهیانه و استفاده در آزمایشات بعدی به یخچال انتقال یافتند.

آماده‌سازی مایه ‌تلقیح: در شرایط استریل یک لوپ ریزوبیوم ملیلوتی از محیط کشت جامد به ۱٠٠ میلی‏لیتر محیط کشت YMA مایع منتقل و در ٢٥ درجه سانتی‏گراد به‏مدت ٢٤ ساعت روی انکوباتور شیکردار با دور  rpm۱٠٠ کشت داده شد (15) غلظت مناسب ریزوبیوم جهت تلقیح موفقیت‌آمیز یونجه  cfu ml-1۱٠٥ می‌باشد (16). جهت تهیه غلظت فوق از جذب نوری استفاده شد. اگر جذب نوری محلول YMA مایع در طول‌موج ٦٢٠  نانومتر معادل ۱/٠ باشد غلظت ریزوبیوم  cfu ml-1۱٠٨ در نظر گرفته می‌شود (17). سپس غلظت  cfu ml-1۱٠٥ باکتری با رقیق نمودن محلول اولیه توسط YMA مایع تهیه شد.

آماده‌سازی و تلقیح بذر: بذر یونجه رقم همدانی Medicago sativa cv. Hamedani از مرکز تحقیقات سازمان جهاد کشاورزی اراک تهیه شد. بذرها توسط اتانول٧٠ درصد (٢ دقیقه) و هیپوکلریت ‌سدیم 1 درصد (٥ دقیقه) ضدعفونی سطحی و به دو گروه تقسیم شدند: گروه بذرهای تلقیحی، تعدادی بذر استریل در مایه تلقیح ریزوبیوم با غلظت  cfu ml-1۱٠٥ در درجه‌حرارت محیط به‏مدت ٢ ساعت تحت خلا حاصل از یک پمپ کوچک، به‏منظور تسهیل نفوذ سویه باکتریایی به‏درون بذر از طریق منافذ بذر، قرار گرفتند (16) و گروه بذرهای شاهد بدون تلقیح که در بافرفسفات استریل در همان شرایط قرار گرفتند.

تهیه و آماده‌سازی نانوآهن: نانو ذرات اکسیدآهن Fe2O3 از شرکت پیشگامان نانومواد مشهد تهیه شد. براساس کاربرد پراش اشعه ایکس XRD و تصویر میکروسکوپ SEM، ابعاد نانو ذرات اکسیدآهن استفاده شده بین 27 تا 40 نانومتر اندازه‌گیری شد (18). هر هفته ۱٦/٠ گرم از این ماده با آب مقطر دوبار تقطیر در بالن ژوژه به‏حجم ۱٠٠ میلی‏لیتر رسانده شد. مخلوط حاصل نیم ساعت در دستگاه اولتراسونیک با توان ۱٠٠ وات و فرکانس ٤٠ کیلوهرتز قرار داده شد (اولتراسونیک نانو مواد را پخش می‏کند). سپس به‏منظور حل کردن نانو ذرات، ٤ ساعت روی شیکر همراه مگنت گذاشته تا نانومواد دوباره به‏هم نچسبد (19).

کاشت گیاهان یونجه: بذر‌های یونجه تلقیح‌یافته با ریزوبیوم و بذرهای شاهد (تلقیح‌نشده) بر روی کاغذ صافی مرطوب درون پتری‌دیش‌های جداگانه ٢٤ ساعت در تاریکی و ٢٥ درجه سانتی‏گراد جهت جوانه‌زنی قرار گرفتند. سپس گیاهک‌های یک روزه به گلدان‌هایی با ابعاد ۱٤×۱٢سانتی‌متر حاوی پرلیت منتقل شدند. در هر گلدان ۱٥گیاهک قرار گرفت. گلدان‌ها در اتاق رشد با شرایط کنترل شده دوره نوری ١٢ ساعت نور و ١٢ ساعت تاریکی با درجه حرارت ٢٥ درجه سانتی‏گراد و ١٨ درجه سانتی‏گراد به‏هنگام روز و شب قرار گرفتند. آبیاری طی ٤٥ روز، هرهفته با ۱٠٠ میلی‏لیتر محلول نیمه‌هوگلند (غلظت 18میکرومولار کلات‌آهن) و یا محلول نیمه‌هوگلند فاقد کلات‌آهن و محتوی غلظت‌های مختلف نانو ذرات اکسیدآهن (0، ٥، ۱٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار) انجام شد (20). غلظت‌های فوق براساس غلظت آهن در محلول هوگلند (کمتر و بیشتر از 18 میکرومولار) انتخاب شدند. در غلظت‌های تیمار صفرآهن هیچ آهنی (نه نانو و نه کلات ‌آهن) در کل دوره دریافت نکرده است. برداشت نهایی در روز ٤٥ انجام شد.

اثبات حضور ریزوبیوم درون گیاهان تلقیح‌شده: از هر گلدان، ریشه یک گیاه در ۱٠ میلی‏لیتر محیط YMA مایع به وسیله انبرک له شد و یک لوپ استریل از محلول فوق به YMA جامد انتقال یافت (15) یک لوپ هم به ۱٠ میلی‏لیتر محیط YMA مایع منتقل شد، از این محلول نیز یک لوپ به محیط YMA جامد منتقل و غلظت یک‏صدم به‏دست آمد. پتری‌دیش‌های فوق به انکوباتور ٢٥ درجه سانتی‏گراد انتقال یافتند و ٢ روز بعد، ریزوبیوم‌ها براساس آزمایشات مورفولوژیکی، بیوشیمیایی و فیزیولوژیکی کتاب برگی Bergeys Manual of systematic Bacteriology شناسایی و شمارش شدند (21).

اندازه‌گیری فاکتورهای رشد: روز برداشت (روز٤٥)، ارتفاع، سطح و تعداد برگ، وزن تر و خشک برگ، ساقه و ریشه سه گیاه از هر تیمار اندازه‌گیری شد. جهت وزن خشک، نمونه‌ها ٢٤ ساعت در آون 75 درجه سانتی‏گراد، تا رسیدن به‏وزن ثابت قرار گرفتند.

اندازه‌گیری فاکتورهای بیوشیمیایی: سنجش کلروفیل a، b و کلروفیل کل با خواندن جذب عصاره برگ در‌ استن در طول‌موج‌های ٦٤٥ و ٦٦٣ نانومتر (22)، اندازه‌گیری کاروتنوئیدها با خواندن جذب عصاره در طول‌موج ٤٧٠ نانومتر (23)، اندازه‌گیری پرولین توسط معرف نین‌هیدرین (24)، مقدار پروتئین به‏روش برادفورد (25) با استفاده از پودر آلبومین سرم گاو BSA به‏عنوان محلول استاندارد انداره‌گیری شد. کمیت آنتی‌اکسیدانتی I% با آزمون مهار فعالیت ١و١دی‌فنیل-٢-پیکریل‌هیدرازیل DPPH تعیین شد (26)، به‏منظور تعیین فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌های آنزیمی، عصاره آنزیمی برگ تهیه شد (27). در عصاره فوق فعالیت سوپراکسید دیسموتاز SOD (27)، کاتالاز CAT (28) و گایاکول‌ پراکسیداز GPOX (29) سنجش شد.

اندازه‌گیری پتاسیم و سدیم در خاکستر بخش هوایی با دستگاه فلیم‌فوتومتر (مدلJEANWAYPFP7 ساخت انگلستان) و استانداردهای کلرور پتاسیم و سدیم (30)، اندازه‌گیری فسفر با خواندن جذب در طول‌ موج ٤٥٠ نانومتر(31)، اندازه‌گیری آهن و روی با دستگاه جذب اتمی (مدل AA680- Shimadzu ساخت ژاپن) و مقایسه با منحنی استاندارد حاصل از محلول‌های با غلظت‌های مختلف کلریدآهن و نیترات ‌روی (32) انجام شد.

 

 

آنالیز آماری

کل آزمایشها در سه تکرار، در طرح کاملا تصادفی در قالب آزمایشهای فاکتوریل انجام شد. جهت آنالیز داده‌ها از نرم‌افزار 61SSPS، مقایسه میانگین‌ها از آزمون دانکن و رسم نمودارها از نرم‌افزار Excel استفاده شد.

 

نتایج

در این آزمایش سویه استاندارد ریزوبیوم ‌ملیلوتی پس از فعال‌سازی جهت مایه‌ تلقیح استفاده شد. پس از ٣ روز کشت حاصل از ریشه گیاهان تلقیح ‌شده، کلنی‌های حلقوی، به‏قطر ٤-٢ میلی‌متر، محدب و برجسته، نیمه‌شفاف، مات، لزج و موسیلاژی در پتری‌دیش‌ها ظاهر شد که تائید کننده باکتری ریزوبیوم ملیلوتی بود. پس از واکشت، کلنی‌های منفرد، کدر و موسیلاژی تشکیل شد. به‏دنبال رنگ‌آمیزی گرم، ریزوبیوم ملیلوتی به‏رنگ صورتی درآمد.در غلظت‌های یک‏صدم قادر به‏شمارش کلنی‌های منفرد باکتری شدیم، پس از شمارش تعداد کلنی‌ها آن‏ها را در عکس رقت ضرب کردیم و تعداد باکتری در هر تیمار مشخص شد. بررسی‌های میکروسکوپی و شمارش باکتری (جدول ١) حضور و نفوذ  باکتری را به‏طور وسیعی در ریشه گیاهان تلقیح‌ شده نشان می‌دهد. برای ریشه‌ گیاهان غیرتلقیحی نیز این مراحل انجام شد ولی هیچ کلنی باکتری و گرهکی دیده نشد.

 

جدول ١: نتایج شمارش باکتری ریزوبیوم در ریشه گیاهان تلقیح شده و تیمارهای مختلف آهن

 

تیمار آهن

کلات آهن

μM 18

نانو ذرات اکسیدآهن (میکرومولار μM)

صفر μM

μM ٥

μM۱٠

μM٢٠

μM٢٥

تعداد کلنی شمارش شده در گیاهان تلقیحی

۱٠٢× ٧٥

۱٠٢× ۱۱٢

۱٠٢× ٤۱

۱٠٢× ٣٠٢

۱٠٢× ٥٠

۱٠٢× ٥٣

 

نتایج آنالیز واریانس (جداول ٢ تا ٥) اثر معنی‌دار (سطح ٠٥/٠) تلقیح باکتریایی را بر سطح و تعداد برگ، ارتفاع، عمق ریشه، وزن تر و خشک ساقه، برگ و ریشه، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، پروتئین، پتاسیم، فسفر، روی و آهن (سطح ٠۱/٠)، اثر معنی‌دار (سطح ٠۱/٠) تیمار آهن و اثرمتقابل تلقیح باکتریایی-تیمار آهن را بر سطح برگ، ارتفاع، عمق ریشه، وزن تر و خشک ساقه، برگ و ریشه، مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی، پرولین، پروتئین، پتاسیم، فسفر، آهن و روی گیاهان یونجه ٤٥ روزه نشان می‌دهد. تیمار آهن بر کمیت آنتی‌اکسیدانتی 1%  و فعالیت آنزیم‌های SOD، CAT و GPOX اثر معنی‌دار (سطح ٠١/٠) و اثر متقابل تلقیح باکتریایی-تیمارآهن بر فعالیت آنزیم SOD (سطح ٠١/٠)، کمیت 1% و آنزیم‌های CAT و GPOX اثر معنی‌دار (سطح ٠٥/٠) را نشان می‌دهد. تلقیح باکتریایی اثر معنی‌داری بر میزان پرولین، کمیت I%، فعالیت SOD، CAT و GPOX نداشته است. تیمار آهن، تلقیح باکتریایی و اثر متقابل تیمارآهن-تلقیح باکتریایی بر میزان عنصر سدیم اثر معنی‌داری ندارد. تیمار آهن و اثرمتقابل تیمار آهن-تلقیح باکتریایی بر تعداد برگ اثر معنی‌داری نشان نمی‌دهند.

 

 

جدول ٢: جدول آنالیز واریانس اثر تلقیح باکتریایی، تیمارآهن و اثرمتقابل تلقیح باکتریایی-تیمارآهن بر وزن تر و خشک گیاه یونجه٤٥ روزه. مقایسه برای هر ستون جداگانه انجام شده است.

منابع تغییر

وزن ساقه

وزن برگ

وزن ریشه

تر

خشک

تر

خشک

تر

خشک

تلقیح باکتریایی

٭٠٤/١

٭٠٦٥/٠

٭٣/٠

٭٧٢/٠

٭٠٠٥/٠

٭٢٦/٠

تیمار آهن

٭٭٧٢/١٨١

٭٭٤٧/١١٤

٭٭٤٢/١٦٣

٭٭١٥/٦٨

٭٭٨٩/١٦٥

٭٭٧/١٤٨

اثرمتقابل تلقیح و آهن

٭٭۱/٢٥٥

٭٭٤٣/۱٦٥

٭٭٦٧/٢٧٣

٭   ٢٧/۱٣٢

٭٭٥٢/٢٥٥

٭٭٠٤/٢٣٠

nsمعنی­دار نیست               ٭ معنی‌دار در سطح ٠٥/٠         ٭٭  معنی‌دار در سطح٠١/٠

 

 

جدول ٣: آنالیز واریانس اثر تلقیح باکتریایی، تیمارآهن و اثرمتقابل تلقیح باکتریایی-تیمارآهن بر رنگیزه‌های فتوسنتزی، پرولین، پروتئین و عمق ریشه یونجه ٤٥ روزه. مقایسه برای هر ستون جداگانه انجام شده است.

منابع تغییر

کلروفیل a

کلروفیل b

کلروفیل کل

کارتنوئید

پرولین

پروتئین

عمق ریشه

تلقیح باکتریایی

٭٦/٠

٭٠٥/٠

٭١٤٨/٠

٭٥٣/٢

ns    ٤٢/٠

٭٠٧٨/٠

٭٢١/١

تیمارآهن

٭٭٦٦/٤٣٣

٭٭٩٨/٢٦۱

٭٭٤٥/٥٣٩

٭٭٧۱/۱٥٦

٭٭٣٣/۱٢٢

٭٭٥٦/٢٥٦

٭٭٥٧/۱٧۱

اثرمتقابل تلقیح و تیمار آهن

٭٭٥٥/٤٤٨

٭٭٧٨/٢٨٦

٭٭٠٤/٥٨٣

٭٭٢٣/١٩٩

٭٭٧٥/٤٩

٭٭٨٩/٤٠٥

٭٭٣٩/٢٥٤

nsمعنی­دار نیست               ٭ معنی‌دار در سطح ٠٥/٠         ٭٭  معنی­دار در سطح٠١/٠

 

 

جدول٤: آنالیز واریانس اثر تلقیح باکتریایی، تیمارآهن و اثرمتقابل تلقیح باکتریایی-تیمارآهن بر فعالیت سوپراکسیددیسموتاز، گایاکول‌پراکسیداز، کاتالاز، 1%  و ارتفاع گیاه یونجه ٤٥ روزه. مقایسه برای هر ستون جداگانه انجام شده است.

منابع تغییر

سوپراکسیددیسموتاز

گایاکول پراکسیداز

کاتالاز

I کمیت آنتی‌اکسیدانتی ٪

ارتفاع

تلقیح باکتریایی

ns٠٨/٠

ns٠٠٤/٠

ns٤٢/۱

ns۱٠٦/٠

٭٤٥/٠

تیمارآهن

**٩٩/٣

**۱٤/٣

**٢٦/٣

**٣٧/٢

٭٭٨١/۱٦٣

اثرمتقابل تلقیح و تیمار آهن

٭٭٥٨/٣

٭٢٩/٢

٭٣/٢

٭٢٧/٣

٭٭٨٣/٢٠١

nsمعنی­دار نیست               ٭ معنی‌دار در سطح ٠٥/٠         ٭٭  معنی­دار در سطح٠١/٠

 

 

جدول ٥: آنالیز واریانس اثر تلقیح باکتریایی، تیمار آهن و اثر متقابل تلقیح باکتریایی-تیمار آهن بر میزان پتاسیم، فسفر، سدیم، آهن و روی، سطح و تعداد برگ گیاه یونجه ٤٥ روزه. مقایسه برای هر ستون جداگانه انجام شده است.

منابع تغییر

پتاسیم

فسفر

سدیم

آهن

روی

سطح برگ

تعداد برگ

تلقیح باکتریایی

٭٧٩/٣

٭٤٦/٤

ns٠۱٧/٠

٭٭٦٧/۱

٭٥٤/٠

٭٤٧/٠

٭٩٦/١٧

تیمارآهن

٭٭٣٩/٥٤٠

٭٭۱/۱٦۱

ns٢٧/٣

٭٭٤٣/٢٠٨

٭٭٧/۱٣٠

٭٭٨٣/۱٠٣

ns٩٧/٠

اثرمتقابل تلقیح و تیمار آهن

٭٭٩٤/۱۱٩

٭٭٩۱/۱٥٣

ns٢٧/٢٥

٭٭٦٨/۱٩٦

٭٭٢۱٦/۱٥٩

٭٭٤٩/۱٤٣

ns۱٢/٢

nsمعنی­دار نیست               ٭ معنی‌دار در سطح ٠٥/٠         ٭٭  معنی­دار در سطح٠١/٠

 

 

 

کم‏ترین و بیش‏ترین ارتفاع، عمق ریشه و سطح برگ به‏ترتیب متعلق به گیاهان شاهد (تلقیح ‌نشده و صفر آهن) و گیاهان تلقیح‌ شده در غلظت ١٠ میکرومولار نانو ذرات اکسید آهن است. در گیاهان تلقیح ‌شده در غلظت ١٠ میکرومولار نانوآهن به‏ترتیب افزایش ٦/۱، ٣٩/٤ و ٤/۱ برابری ارتفاع، عمق ریشه و سطح برگ نسبت به شاهد مشاهده می‌شود. با افزودن آهن هم در گیاهان تلقیح‌ نشده و هم گیاهان تلقیح ‌شده، سطح برگ، ارتفاع گیاه و عمق ریشه افزایش معنی‌داری می‌یابد ولی این افزایش در گیاهان تلقیح‌ شده بیش از گیاهان تلقیح ‌نشده است. افزایش سطح برگ، ارتفاع و عمق ریشه نسبت به شاهد حتی در حضور ٥ میکرومولار نانوآهن بیش از کلات‌آهن است. در عدم حضور آهن در گیاهان تلقیح‌ شده به‏ترتیب افزایش ۱٣/٤، ٣/۱٠ و ٠٨/٢٩ درصدی سطح برگ، ارتفاع و عمق ریشه نسبت به گیاهان شاهد مشاهده می‌شود (شکل۱).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل١: مقایسه میانگین اثرمتقابل تلقیح باکتریایی-تیمار آهن (کلات‌آهن Fe- EDTA 18میکرومولار، ٠، ٥، ١٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار نانو ذرات اکسیدآهن) بر (a) سطح برگ(Cm2) ، (b) ارتفاع بخش هوایی  (Cm)و  (c)طول ریشه گیاه یونجه ٤٥ روزه. خطوط نشان دهنده SE و حروف غیرمشابه نشان‌دهنده معنی‌دار بودن براساس آزمون دانکن است. –R: عدم تلقیح، +R: تلقیح با ریزوبیوم.

 

 

کم‏ترین وزن تر و خشک ساقه، برگ و ریشه در شاهد و بیش‏ترین در گیاهان تلقیح‌ شده و ۱٠ میکرومولار نانوآهن به‏ترتیب با افزایش ٦٢/٢٥ و ٨ برابری وزن تر و خشک ساقه، ٠٥/٤ و ٣٧/٤ برابری وزن تر و خشک برگ، ٢/۱٧ و ٥/٢٠ برابری وزن تر و خشک ریشه مشاهده شد. با افزودن آهن هم در گیاهان تلقیح ‌شده و هم تلقیح ‌نشده، شاخص‌های فوق افزایش داشتند ولی این افزایش در گیاهان تلقیح ‌شده بیش از تلقیح‌ نشده است. در عدم حضور آهن در گیاهان تلقیح ‌شده به‏ترتیب افزایش ٢٥/۱ و ٤٦/۱ برابری وزن تر و خشک ساقه، ٢٣/۱ و ٢٥/۱ برابری وزن تر و خشک برگ و ٤/٢ و ٣ برابری وزن تر و خشک ریشه مشاهده شد. افزایش شاخص‌های وزنی نسبت به شاهد حتی در حضور ٥ میکرومولار نانوآهن بیش از کلات‌آهن است (شکل٢).

 

B

 

A

 

D

 

C

 

F

 

E

 

شکل ٢: مقایسه میانگین اثر متقابل تلقیح باکتریایی و تیمارآهن بر شاخص­های وزنی گیاه یونجه.(a) وزن تر ساقه، (b) وزن خشک ساقه، (c) وزن تر برگ، (d) وزن خشک برگ، (e) وزن تر ریشه، (f) وزن خشک ریشه. خطوط نشان دهنده SE و حروف غیرمشابه نشان­دهنده معنی­دار بودن براساس آزمون دانکن است. -R : عدم تلقیح، +R: تلقیح با ریزوبیوم.

 

کم‏ترین میزان کلروفیل a، b، کلروفیل کل و کارتنوئید در شاهد و بیش‏ترین میزان به‏ترتیب با ٨٩/٢، ٥٤/٧، ٨٢/٣ و ٧٥/٨ برابر افزایش نسبت به شاهد در گیاهان تلقیح­ شده و تحت غلظت ١٠ میکرومولار نانو آهن مشاهده می‌شود. بین میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی گیاهان تلقیح‌شده تحت تیمار ٢٥ میکرومولار و ١٠ میکرومولار تفاوت معنی‌داری مشاهده نمی‌شود. با افزودن آهن هم در گیاهان تلقیح­ شده و هم تلقیح‌ نشده مقدار رنگیزه‌ها افزایش معنی‌داری می‌یابد ولی این افزایش در گیاهان تلقیح‌ شده بیشتر است. افزایش مقدار رنگیزه‌ها در حضور ٥ میکرومولار نانوآهن بیش از کلات ‌آهن است (شکل ٣).

بیش‏ترین میزان پرولین (٠٤١٦/٠ میکرومولار در گرم) در شاهد و کم‏ترین (٠٣٥/٠ میکرومولار در گرم) در گیاهان تلقیح‌شده و صفر آهن مشاهده شد یعنی تلقیح باکتریایی باعث کاهش ٨٦/١٥ درصد پرولین شده است. در سایر تیمارها اختلاف معنی‏داری بین گیاهان تلقیح­ شده و تلقیح ­نشده مشاهده نمی­شود (شکل ٤). کمترین میزان پروتئین کل در شاهد و بیش‏ترین در گیاهان تلقیح ‌شده و غلظت ١٠ میکرومولار نانوآهن با افزایش ٦۱/٢ برابری نسبت به شاهد مشاهده شد. با افزودن آهن هم در گیاهان تلقیح‌ شده و هم گیاهان تلقیح‌ نشده میزان پروتئین کل افزایش معنی­داری نشان داد. این افزایش در گیاهان تلقیح شده بیش از گیاهان تلقیح­ نشده است. افزایش میزان پروتئین کل در حضور٥ میکرومولار نانو آهن بیش از کلات ­آهن می­باشد. در عدم حضور آهن در گیاهان تلقیح ­شده افزایش ٦٨/۱٨ درصدی میزان پروتئین نسبت به گیاهان تلقیح ­نشده مشاهده می‏شود (شکل٤).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل٣: مقایسه میانگین اثرمتقابل تلقیح باکتریایی و تیمار آهن (کلات ‌آهن Fe-EDTA 18میکرومولار،٠، ٥، ١٠، ٢٠ و٢٥ میکرومولار نانو ذرات اکسید آهن) بر مقدار رنگیزه‌های فتوسنتزی (mg/g FW). کلروفیل a (a)، کلروفیل b (b)، کلروفیل کل (c)، کاروتنوئیدها (d). خطوط نشان دهنده SE و حروف غیرمشابه نشان‌دهنده معنی­دار بودن براساس آزمون دانکن است. –R: عدم تلقیح، +R: تلقیح باکتریایی.

 

 

 

 

 

 

شکل٤: مقایسه میانگین اثر متقابل تلقیح باکتریایی و تیمار آهن (0، ٥، ۱٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار نانو و کلات‌ آهن Fe-EDTA 18میکرومولار) بر میزان پرولین(a) (μmol/g FW) و پروتئین کل (mg/g FW) (b) گیاهان یونجه ٤٥ روزه. خطوط نشان دهنده SE و حروف غیرمشابه نشان­دهنده اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها مطابق آزمون دانکن است. –R: عدم تلقیح، +R: تلقیح باکتریایی.

 

بیش‏ترین میزان توانایی مهار رادیکال آزاد 1%، فعالیت سوپراکسید دیسموتازSOD، گایاکول ‌پراکسیداز GPOX و کاتالاز CAT در شاهد مشاهده ‌شد. بین گیاهان تلقیح ‌شده و تلقیح‌ نشده از نظر مقدار  1%، فعالیت SOD، GPOX و CAT اختلاف معنی‌داری مشاهده نمی‌شود، ولی در حضور آهن کاهش معنی‌دار I%، فعالیت SOD، GPOX و CAT نسبت به شاهد مشاهده می‌شود. بین تیمارهای آهن اختلاف معنی‌دار از نظر 1% و فعالیت SOD، GPOX و CAT مشاهده نمی‌شود (شکل٥).

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

شکل٥: مقایسه میانگین اثر متقابل تلقیح باکتریایی و تیمارآهن (0، ٥، ۱٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار نانو آهن و کلات‌ آهن Fe-EDTA 18 میکرومولار) بر مقدار کمی آنتی‌اکسیدانت1% (a) ، میزان فعالیت سوپراکسید دیسموتاز (b) SOD، گایاکول‌پراکسیداز (c) GPOX و کاتالاز (d) CAT گیاهان یونجه ٤٥ روزه. خطوط نشان دهنده SE و حروف مشابه نشان­ دهنده عدم اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها مطابق آزمون دانکن است. –R: عدم تلقیح، +R: تلقیح باکتریایی.

 

کم‏ترین مقدار عناصر پتاسیم، فسفر، آهن و روی در شاهد اندازه‌گیری شد. بیش‏ترین مقدار پتاسیم و فسفر در گیاهان تلقیح شده و غلظت ١٠ میکرومولار نانوآهن به‏ترتیب با ٥١/٣ و ١٥/٧ برابر افزایش نسبت به شاهد مشاهده می‌شود. بیش‏ترین مقدار آهن و روی در گیاهان تلقیح ‌شده و ٢٥ میکرومولار نانوآهن به‏ترتیب با ٩٤/٣ و ٧٤/٥ برابر افزایش نسبت به شاهد مشاهده می­شود. با افزودن آهن هم در گیاهان تلقیح ­شده و هم تلقیح ­نشده مقدار تمام عناصر افزایش معنی­داری می­یابد ولی این افزایش در گیاهان تلقیح ­شده بیش از گیاهان تلقیح ­نشده است. افزایش میزان پتاسیم و فسفر نسبت به شاهد حتی در حضور ٥ میکرومولار نانوآهن بیش از کلات‌ آهن است. در عدم حضور آهن در گیاهان تلقیح ­شده افزایش ٨٨/٢٩، ٦١/٦٧، ٢٢/٣٣ و ٩٣/٢٧ درصدی میزان پتاسیم، فسفر، آهن و روی به‏ترتیب نسبت به شاهد مشاهده می­شود (شکل ٦).

 

B

 

A

 

D

 

C

 

شکل٦: مقایسه میانگین اثرمتقابل تلقیح باکتریایی و سطوح مختلف آهن (0، ٥، ۱٠، ٢٠ و ٢٥ میکرومولار نانو آهن و کلات ‌آهن Fe-EDTA 18 میکرومولار) بر مقدار پتاسیم (a) mg/g DW، فسفر (b) mg/g DW، آهن (c) μg/g DW و روی (d) mg/g DW گیاهان یونجه ٤٥ روزه. خطوط نشان دهنده SE و حروف مشابه نشان­ دهنده عدم اختلاف معنی­دار بین میانگین­ها مطابق آزمون دانکن است. –R: عدم تلقیح، +R: تلقیح باکتریایی.

 

بحث

آهن به‏عنوان یک ریزمغذی در تشکیل کلروفیل، فتوسنتز و تنفس نقش اساسی دارد، برای برقراری همزیستی و عملکرد گرهک‌های درگیر در تثبیت نیتروژن ضروری است ولی به‏دلیل آهکی بودن یک‏سوم خاک‌های زیرکشت، گیاهان از کمبود آهن رنج می­برند (33). ازطرفی باکتری‌های محرک رشد مثل ریزوبیوم از طریق مکانیسم‌های مختلف مانند تثبیت بیولوژیکی نیتروژن و تولید هورمون‌های محرک رشد که نتیجه‌ آن بهبود جذب آب و عناصر غذایی توسط گیاه است، می‌توانند رشد گیاه را افزایش دهند. استفاده از کودهای میکروبی می‌تواند استفاده از کودهای شیمیایی نیتروژنی را کاهش داده و رشد گیاه را با کاهش قیمت تولید و خطرات محیطی افزایش دهد (٥).

در این مطالعه سطح برگ، ارتفاع، عمق ریشه، وزن تر و خشک گیاه در اثر تلقیح با ریزوبیوم نسبت به گیاهان تلقیح ‌نیافته افزایش معنی‌دار یافتند. ریزوباکترهای محرک رشد گیاهان PGPR از طریق افزایش ریشه‌های فرعی، جوانه‌زنی، سطح برگ، افزایش وزن، تجمع کربوهیدرات‌ها، جذب مواد مغذی، تولید هورمون‌های گیاهی، تثبیت نیتروژن، تنطیم تولید اتیلن ریشه، محلول کردن فسفات، تولید سیدروفور و کاهش سمیت فلزات سنگین سبب رشد گیاهان می‌شوند (34). تلقیح گیاه Chickpea با PGPR سبب افزایش طول ریشه، وزن تر و خشک ریشه و ساقه گیاه شد (35).

در این تحقیق کاربرد آهن (نانو و کلات‌ آهن) سبب افزایش معنی‌دار رشد یونجه شد. بیشترین میزان متعلق به گیاهان تحت تیمار ٢٥ میکرومولار نانوآهن بود. حتی کاربرد ٥ میکرومولار نانو آهن تاثیر بهتری از کلات ‌آهن داشت. در گیاهانی که هیچ آهنی دریافت نکردند کاهش معنی‌دار پارامترهای رشد مشاهده شد، نتایج مشابه در کاهو گزارش شده است (٦). آهن یک عنصر ضروری رشد گیاهان است زیرا برای عملکرد مناسب اغلب فرآیندهای متابولیک و آنزیماتیک مربوط به انتقال الکترون تنفسی و فتوسنتزی، تثبیت نیتروژن، سنتز پروتئین، هورمون و DNA ضروری است (٦). در کمبود آهن کلروفیل به‏مقدار کافی تولید نمی‌شود. کاهش کلروفیل منجر به کاهش فتوسنتز، کاهش رشد و عدم تشکیل برگ‌های جدید می‌شود. ترکیبات نانوآهن به‏علت کوچک بودن و حلالیت بالا سریع‏تر توسط گیاهان جذب می‌شوند و کم‍‍‌بودهای گیاه را جبران می‏کنند. بنابراین استفاده از نانو ذرات اکسیدآهن در گیاهان کارآمدتر از کودهای معمولی است و کاربرد این مواد سبب افزایش رشد گیاه می‌شود (36). افزایش پارامترهای رشد گیاه Cowpea در تیمار با نانو کود آهن بسیار بیشتر از تیمار Fe-EDDHA بود (37). نانو ذرات اکسیدآهن Fe3O4 در غلظت 4 میلی‏گرم در لیتر سبب افزایش معنی‌دار ارتفاع گیاه، طول ریشه، وزن و مقدار کلروفیل گیاه یونجه در محیط هیدروپونیک نسبت به کنترل شد (38). هیچ یک از غلظت‌های نانو ذرات اکسید آهن (5 تا 40 میکرومولار) اثر منفی بر رشد گیاه پریوش نداشت، اگرچه بیش‏ترین مقدار پارمترهای رشد در سطح 30 میکرومولار و کمترین در شاهد فاقد نانو ذرات اکسید آهن مشاهده شد (39).

در این تحقیق تیمار آهن همراه تلقیح باکتریایی اثرات معنی‌داری بر رشد گیاه یونجه نشان داد. کمترین شاخص‌های رشد در شاهد و بیشترین در گیاهان تلقیح‌شده و غلظت 10 میکرومولار نانوآهن به‏دست آمد. تلقیح خیار با آزوسپیریلیوم همراه تیمار آهن سبب افزایش ٧٢ درصدی زیست توده شد، درحالی‌که تلقیح بدون آهن تنها ٤٩ درصد افزایش به‏دست آمد (40). در مطالعه‌ای پاسخ سه ژنوتیپ Medicago truncatula تلقیح‌ یافته با دو سویه سینوریزوبیوم به کمبود آهن بررسی شد. نتایج اثرات مثبت تلقیح ریزوبیومی را بر تولید بیوماس گیاهان تحت شرایط کمبود آهن نشان داد. در هر دو سویه باکتری افزایش مقدار سیدروفور و اکسین مشاهده شد. سیدروفور می‏تواند مقدار آهن دردسترس را افزایش دهد و اکسین با افزایش رشد طولی ریشه در تغذیه معدنی گیاه می‌تواند موثر باشد. کمبود آهن سبب کاهش معنی‌دار بیوماس گیاه و مقدار کلروفیل شد. بیش‏ترین پراکسیداسیون لیپید و نشت الکترولیت‌ها (مشخصه تنش اکسیداتیو) در شرایط کمبود آهن مشاهده شد. تلقیح سینوریزوبیومی اثرات منفی کمبودآهن بر رشد گیاه و آثار تنش اکسیداتیو را از بین برد (41). آهن ماده مغذی مهمی در تثبیت نیتروژن گرهک لگوم‌ها است. تقاضا برای این ریزمغذی هنگام برقراری همزیستی افزایش پیدا می‌یابد، زیرا جزء سازنده پروتئین‌های کلیدی از قبیل نیتروژناز است. در ساختمان این آنزیم آهن، مولیبدن و گوگرد شرکت دارد، لذا فراهم بودن این عناصر در خاک برای فعالیت این باکتری ضروری می‌باشد. از طرفی نیتروژن یکی از عناصر پرمصرف ضروری گیاه است که برای سنتز آنزیم‌ها، پروتئین‌ها، کلروفیل، DNA و RNA مورد نیاز است و PGPR‌ها طی تثبیت نیتروژن ملکولی آن را برای گیاه تامین می‌کنند (42).

در این مطالعه تلقیح یونجه با ریزوبیوم ملیلوتی باعث افزایش معنی‌دار رنگیزه‌های فتوسنتزی شد. نتایج مشابه در تلقیحCicer arietinum با ریزوبیوم لگومینوزاروم، مشاهده شد. افزایش این رنگیزه‌ها به افزایش تثبیت نیتروژن توسط این باکتری‌ها بر می‌شد. ترکیبات نیتروژنه ایجاد شده از تثبیت نیتروژن در گرهک‌های ریشه به شکل آلانتوئین و اسیدهای آلانتوئیک به ریشه ترشح و سپس به برگ منتقل می‌شوند و در آنجا برای بیوسنتز کلروفیل و پروتئین‌های ضروری برای فتوسنتز استفاده می‌شوند (43). تیمار دانه ذرت با ریزوباکتر محرک رشد با اسیدی کردن خاک باعث افزایش جذب منیزیوم و فسفر می‌شود (44) یعنی جذب منیزیوم که در ساختمان کلروفیل وجود دارد در اثر تلقیح افزایش می‌یابد (34). ریزوبیوم، نیتروژن اتمسفری (N2) را به فرم قابل استفاده گیاه (NH4) تبدیل و در دسترس گیاه قرار می‌دهد. با توجه به نقش نیتروژن و منیزیوم در بیوسنتز کلروفیل، مقدار کلروفیل برگ گیاهان تلقیح شده افزایش می‌یابد و این هم سازوکاری جهت افزایش محصولات فتوسنتزی و در نتیجه رشد بهتر گیاه تلقیح‌شده، می‌شود (45).

در بررسی حاضر با افزایش سطح آهن میزان رنگیزه‌های فتوسنتزی نسبت به گیاهان شاهد (صفرآهن) افزایش معنی‌داری یافت و بیشترین رنگیزه‌ها در گیاهان تحت غلظت ٢٥ میکرومولار نانوآهن اندازه‌گیری شد. نتایج مشابه در سویا (13)، ریحان (46) و خیار (40) مشاهده شد. نقش عمده آهن، سنتز پروتئین‌های همراه کلروفیل است. کمبود آهن ساختار کلروپلاست و میزان فتوسنتز را کاهش می‌دهد، به‏همین علت کلروز رخ می‌دهد. اگر آهن به‏مقدار کافی و قابل جذب، در دسترس گیاه نباشد تولید کلروفیل در برگ کاهش می‌یابد. کلروپلاست حاوی ترکیبات متعدد حاوی آهن است، پروتئین‌هایی شامل ترکیبات همی مانند سیتوکروم‌ها، P450، پروتئین‌های حاوی آهن (2Fe-2S)، این ترکیبات در چرخه انتقال الکترون دستگاه فتوسنتزی و واکنش‌های ردوکس شرکت دارند (33).

در این مطالعه بیش‏ترین میزان رنگیز‌ه‌های فتوسنتزی در گیاهان تلقیح‌شده تحت غلظت ١٠ میکرومولار نانوآهن و کمترین در شاهد مشاهده شد. با افزودن آهن (هم گیاهان تلقیح ‌شده و هم تلقیح ‌نشده) مقدار رنگیزه‌ها افزایش معنی‌داری نشان داد و این افزایش در گیاهان تلقیح ‌شده بیشتر است. نتایج مشابه در خیار مشاهده شد (40). افزایش آهن در گیاهان تلقیح شده و در نتیجه افزایش کلروفیل، می‌تواند ناشی از سیدروفورهای تولیدی توسط RPGR باشد که به کسب آهن گیاهان کمک می‌کند (40). سیدروفورها مولکول‌های پپتیدی کوچک با وزن مولکولی کم هستند که تمایل بالایی به Fe3+ دارند (44).

در این مطالعه میزان پرولین در گیاهان تلقیح‌یافته تفاوت معنی‌داری نسبت به گیاهان تلقیح‌نشده نداشتند. از آن‏جا که در بسیاری از گیاهان، پرولین در پاسخ به تنش‌های زیستی و غیرزیستی انباشته می‌شود (47). بنابراین تلقیح ریزوبیومی برای یونجه یک تنش محسوب نمی‌شود و گیاه نیازی به افزایش مقدار پرولین ندارد.

در گیاهان تحت غلظت صفر میکرومولار نانو آهن افزایش معنی‌دار میزان پرولین نسبت به گیاهان تحت غلظت‌های مختلف آهن (کلات یا نانو) مشاهده شد. با کاربرد آهن مقدار پرولین کاهش معنی‌داری نشان داد. بین سطوح مختلف آهن در خصوص مقدار پرولین تغییر معنی‌داری مشاهده نشد. از آنجا که در اکثر گیاهان میزان پرولین در تنش‌های زیستی و غیرزیستی افزایش می‌یابد (47) بنابراین کمبود آهن به‏عنوان تنش غیر زیستی عمل کرده و باعث شده محتوای پرولین در گیاهانی که آهن دریافت نکرده­اند، افزایش پیدا کند ولی هیچ‏ یک از غلظت‌های آهن به‏کار رفته در این تحقیق برای گیاه یونجه تنش نبوده است. پرولین در تنظیم اسمزی و حفاظت غشای سلولی از طریق جذب رادیکال‌های آزاد نقش دارد و سبب مقاومت به تنش می‌شود. افزایش پرولین نوعی راهبرد تنظیم اسمزی نیز است. پرولین از دو ماده گلوتامات (پیش‌ماده بیوسنتز کلروفیل) و اورنیتین تولید می‌شود بنابراین می‌تواند منجر به کاهش رشد گیاه شود (47). بیشترین میزان پرولین در گیاهان شاهد اندازه‌گیری شد. تلقیح باکتریایی باعث کاهش معنی‌دار پرولین شده است. در سایر تیمارها (آهن) اختلاف معنی‌داری بین گیاهان تلقیح‌ شده و تلقیح‌ نشده مشاهده نمی‌شود. تلقیح باکتریایی در تنش‌های زیستی و غیرزیستی میزان پرولین را نسبت به گیاهان تلقیح نشده کاهش می‌دهد که این نشان‌دهنده بهبود شرایط تنشی توسط تلقیح باکتریایی است (48).

تلقیح ریزوبیومی یونجه میزان پروتئین را افزایش داد. باکتری‌های محرک رشد گیاه با تثبیت بیولوژیکی نیتروژن سبب رشد گیاه می‌شوند. نیتروژن عنصر ضروری در ساخت اسیدهای نوکلئیک و پروتئین‌ها است. آمونیوم حاصل از همزیستی ریزوبیوم لگوم به‏شکل آمینواسید در تشکیل پروتئین استفاده می‌شود (49).

در این بررسی کم‏ترین میزان پروتئین در گیاهان شاهد (صفرآهن) مشاهده شد، با افزایش غلظت آهن میزان پروتئین افزایش معنی‌داری یافت. کاربرد ریزمغذی‌ها به‏ویژه آهن باعث افزایش معنی‌دار مقدار پروتئین دانه‌های گندم شده است است (50). با توجه به نقش ساختاری عناصر ریزمغذی آهن، منگنز و روی در برخی آنزیم‌ها و همچنین نقش موثر آن‏ها در سنتز پروتئین‌ها، با مصرف این عناصر علاوه بر افزایش پروتئین و عملکرد، افزایش مقاومت گیاهان تحت تنش‌های محیطی مورد انتظار است (50). عنصر آهن در متابولیسم نیتروژن دخالت دارد. نیتروژن یکی از عناصر ضروری در ساخت پروتئین است. آهن به‌طور غیرمستقیم سبب افزایش جذب نیتروژن می‌شود (٤).

در این مطالعه کم‏ترین و بیش‏ترین میزان پروتئین به‏ترتیب در شاهد و گیاهان تلقیح‌ شده تحت غلظت ۱٠ میکرومولار نانوآهن مشاهده شد. با افزودن آهن، افزایش معنی‌دار پروتئین مشاهده شد. این افزایش در گیاهان تلقیح‌ شده بیشتر بود. یکی از سازوکارهای افزایش رشد گیاه توسط RPGRها، تثبیت بیولوژیکی نیتروژن است. نیتروژن تثبیت شده برای سنتز اسیدهای آمینه استفاده می‌شود (34). نتایج مشابه در لوبیا دیده شده است. در کمبود آهن گرهک‌ها نقش مهمی در احیا آهن فریک دارند و جذب آهن را افزایش می‌دهند. مقدار بالای آهن در گرهک سبب فعالیت نیتروژناز می‌شود، آمونیوم تولید شده برای ساخت اسکلت کربنی و سنتز اسیدهای آمینه استفاده می‌شود (42).

تلقیح ریزوبیوم اثر معنی‌داری بر توانایی مهار رادیکال آزاد DPPH و فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌ها (SOD، GPOX و CAT) نداشت زیرا ریزوبیوم همزیست طبیعی گیاه است بنابراین گیاه تحت تنش نیست تا آنتی‌اکسیدانت تولید کند. نتایج مشابه در کاهو گزارش شده است (51). از آنجا که تولید متابولیت­های ثانویه مثل آنتی‌اکسیدانت‏ها، توکوفرول و محافظت کننده‌های اسمزی مثل پرولین به‏دنبال تنش رخ می‌دهد (51 و 52). بنابراین عدم افزایش آنتی‌اکسیدانت‌ها دلیل دیگری بر این مسئله است که تلقیح ریزوبیومی برای یونجه تنش نیست.

گیاهانی که نانوآهن دریافت نکردند بیشترین میزان 1% و فعالیت SOD، GPOX و CAT را داشتند. در حضور آهن میزان 1% و فعالیت آنتی‌اکسیدانت‏ها نسبت به شاهد کاهش معنی‌دار پیدا کرد. در گیاهان تحت غلظت‌های مختلف آهن تغییر معنی‌داری مشاهده نشد. تحت شرایط نامساعد محیطی و تنش‌های مختلف، میزان تولید گونه‌های فعال و واکنش‌گر اکسیژن ROS افزایش می‌یابد. ROSها سبب تخریب نوکلئیک ‌اسیدها، اکسیداسیون پروتئین‌ها و پراکسیداسیون لیپیدهای سلول می‌شوند (52). گیاهان در مقابل تنش‌های محیطی سازوکارهای متعدد دفاعی دارند. تولید انواع مختلف متابولیت‌های ثانویه ابزاری جهت مقابله با تنش، تحمل تنش و سازش به شرایط تنشی محیط و بنابراین بقا گیاه در برابر تنش است. سیستم دفاعی گیاهان دربرابر ROSها، تولید انواع آنتی‌اکسیدانت‌ها است (52). آنتی‌اکسیدانت‏ها متابولیت‌های ثانویه هستند که در شرایط نامساعد مانند محدودیت عناصر مغذی تولید می‌شوند. غلظت فلزات نقش مهمی در تعادل آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی دارد. غلظت بالا و پایین فلزات باعث تجمع رادیکال‌های آزاد و در نتیجه آسیب غشایی می‌شود (53). ترکیبات نانوآهن به‏علت کوچک بودن و حلالیت بالا به‏سرعت توسط گیاه جذب می‌شوند و کمبود مواد غذایی گیاهان را برطرف می‌کنند. بنابراین با کاربرد این مواد شرایط بهینه برای رشد گیاه ایجاد می‌شود و از ایجاد هرگونه تنش در گیاه جلوگیری می‌شود (36 و 37). نتایج مشابه در مطالعه Ocimum Basilicum تحت تاثیر کلات آهن و نانو کود آهن مشاهده شده است (46).

بیشترین میزان توانایی مهار رادیکال آزاد 1% و فعالیت آنتی‌اکسیدانت‌ها در گیاهان شاهد (عدم تلقیح و صفرآهن) مشاهده شد. بین گیاهان تلقیح­ شده و تلقیح­ نشده، همچنین بین تیمارهای مختلف آهن از این نظر اختلاف معنی‌داری مشاهده نشد، ولی در حضور آهن کاهش معنی‌دار فاکتورهای فوق رخ داد. کاربرد سویه‌های PGPR می‌تواند اثرات ناشی از تنش مانند مرگ سلولی برنامه‌ریزی شده و فعالیت آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی را تنظیم کند (54). در تنش‌های غیرزیستی مانند تنش فلزات، تلقیح ریزوباکتر، آنزیم‌های آنتی‌اکسیدانتی مانند SOD و CAT را کاهش می‌دهد (55). بنابراین تلقیح ریزوباکتر می‌تواند ابزار مفیدی برای کم‏کردن تنش در گیاهان باشد (51).

تلقیح باکتریایی باعث افزایش میزان عناصر پتاسیم، فسفر، آهن و روی شد. تلقیح باکتریایی دانه از طریق محلول کردن فسفات، پتاسیم، تثبیت نیتروژن، کلات کردن آهن و مس، میزان عناصرمعدنی دردسترس گیاه را افزایش می‌دهد (49). فراوانی پتاسیم در خاک زیاد است ولی قسمت کوچکی از آن می‌تواند در دسترس گیاه قرار بگیرد زیرا به بارهای منفی خاک باند می‌شود. برخی باکترهای خاک با ترشح اسیدهای ارگانیک، پتاسیم خاک را محلول و در دسترس گیاه قرار می‌دهند (56). فسفر دومین ماده مغذی مهم گیاهی است. خاک‌ها معمولا مقادیر بالای فسفر دارند اما بیشتر فسفر خاک به‏شکل فسفات‌ آهن و آلومینیوم در خاک اسیدی و فسفات‌‌ کلسیم در خاک قلیایی رسوب می‌کند. ریزوباکترها قادر به تشکیل کمپلکس‌های محلول فسفر هستند (٥). سویه­های ریزوبیوم با آزاد سازی آنزیم‌هایی مثل فسفاتاز و یا ترشح اسیدهای ارگانیک مانند سیتریک‌ اسید، گلوتامیک ‌اسید، کربونیک ‌اسید و گلوکونیک ‌اسید، توانایی متحرک ‌سازی فسفرهای باند شده (غیرمحلول) را دارند (49). اثرات سودمند تلقیح باکتریایی اساسا ناشی از تغییرات فیزیولوژیک و مورفولوژیک ریشه مثل افزایش تعداد تارهای کشنده و ریشه‌های جانبی گیاهان تلقیح شده می‌باشد که سبب کارایی جذب آب و مواد معدنی توسط ریشه می‌شود (35).

تیمارآهن باعث افزایش معنی‌دار میزان عناصر پتاسیم، فسفر، آهن و روی شد. حتی افزایش مقدار عناصر فوق در غلظت 5 میکرومولار نانوآهن بیش از کلات‌آهن بود. نتایج مشابه در سویا (57) و گندم (58) گزارش شده است. مقادیر بالای آهن در ریشه ظرفیت جذب آنیون‌ها از قبیل فسفر را افزایش می‌دهد (58). در مطالعه حاضر کمترین میزان آهن، روی، پتاسیم و فسفر در گیاهانی که هیچ آهنی دریافت نکردند مشاهده شد. کمبود آهن باعث برهم خوردن تعادل غذایی و کمبود عناصری از جمله پتاسیم، منگنز، روی و فسفر و در نهایت اختلال در رشد گیاه می‌شود. در کمبود آهن به علت کاهش دسترسی به انرژی، جذب آنیون‌ها (انتقال فعال اولیه یا ثانویه) در سلول‌های ریشه کاهش می‌یابد. همچنین در اثر کمبود آهن جذب کاتیون‌هایی مثل پتاسیم کم می‌شود که می‌تواند به‏علت نقش آهن در ساختار و فعالیت انتقال‌دهنده‌های کاتیون‌هایی مثل پتاسیم باشد (59). استفاده از نانوآهن در افزایش غلظت عناصر در گیاهان کارآمدتر از کودهای معمولی است. احتمالا خصوصیت ذرات نانو، حلالیت بیشتر، سطح تماس بیشتر ذرات نانو با ریشه گیاهان علت این امر است (٦). استفاده از نانو آهن میزان جذب پتاسیم، منگنز، فسفر، روی، آهن و منیزیوم را در گیاه اسپاتی ‌فیلوم افزایش داد (36).

کم‏ترین مقدار عناصر در شاهد و بیش‏ترین مقدار پتاسیم و فسفر در گیاهان تلقیح‌ شده تحت غلظت ۱٠ میکرومولار نانوآهن و بیشترین مقدار آهن و روی هم در گیاهان تلقیح‌شده تحت غلظت ٢٥ میکرومولار نانوآهن مشاهده شد. یکی از مهم‏ترین فواید اثر متقابل بین گیاه و RPGRهای محرک رشد، افزایش جذب مواد مغذی است. ریزوباکترها قادر به افزایش تحرک آهن با آزادسازی ترکیبات کلات کننده به‏صورت سیدروفور هستند (60). سیدروفورها مولکول‌های پپتیدی کوچک با زنجیره‌های کناری هستند که می‌توانند جایگاهی با میل ترکیبی بالا برای یون‌های فریک تهیه کنند. در شرایط کمبود آهن، آنزیم‌هایی برای سنتز سیدروفور و پروتئین رسپتور در غشا بیرونی ریزوباکتر سنتز می‌شود و سیدروفور آزاد می‌شود. سپس کمپلکس سیدروفور-آهن تشکیل می‌شود، این کمپلکس محلول و به‏درون سلول با گیرنده های غشایی ویژه منتقل می‌شوند (٥). در مطالعه گیاه خیار تلقیح با آزوسپیریلیوم تحت کمبود آهن، علائم کمبود عناصر معدنی به‏سرعت برطرف شد. علت می‌تواند به سیدروفورهای آزادشده توسط آزوسپیریلیوم نسبت داده شود (40). در کمبود آهن آزوسپیریلیوم ترکیبات فنولی ترشح می‌کند که به‏سرعت اختلالات تغذیه‌ای ناشی از کمبود آهن را بهبود می‌دهد. بررسی ریشه و گرهک‌های لوبیای تلقیح‌شده، حضور پروتئین IRT1 را نشان می‌دهد. مقدار این پروتئین در کمبود آهن افزایش می‌یابد. IRT1 ناقل آهن است اما می‌تواند ناقل دیگر کاتیون‌های دوظرفیتی از قبیل Zn2+ و Cd2+ تحت کمبود آهن باشد. در لگوم‌ها به‏واسطه ترشح پروتون توسط پمپ پروتون و تراوش کربوکسیلیک ‌اسیدها (مخصوصا سیتریک ‌اسید و مالیک ‌اسید) در منطقه ریزوسفر، این منطقه اسیدی می‌شود بنابراین حلالیت عناصر و جذب آن‏ها افزایش می‌یابد (41).

 

نتیجه­گیری

آهن یکی از عناصر ضروری است که نقش‌های مهمی در متابولیسم گیاه بازی می‌کند. به‏همین علت، فقدان آهن به‏عنوان یک تنش غیرزیستی بر کل فرآیندهای رشدی گیاه یونجه اثر منفی گذاشت. کمبود آهن باعث کاهش جذب عناصر غذایی گیاه شد. غلظت ٢۵ میکرومولار و 10 میکرومولار نانوآهن با بیشترین درصد افزایش شاخص‌های رشدی، به‏ترتیب غلظت مطلوب برای یونجه تلقیح‌ نشده و گیاهان تلقیح‌ شده به‏دست آمد. اثرات منفی ناشی از نبود ریزمغذی آهن باعث کاهش پروتئین و کاهش ذخایر آهن و ایجاد حالت تنشی برای گیاه شد. چون در تنش‌های مختلف غیر زیستی تولید گونه‌های فعال و واکنش‌گر اکسیژن ROS افزایش می‌یابد و تولید انواع متابولیت‌های ثانویه مانند آنتی‌اکسیدانت‌ها و پرولین از سازوکارهای دفاعی گیاهان در برابر تنش‌ها است. گیاه یونجه در پاسخ به تنش کمبود آهن از این سازوکارها استفاده کرد.

تلقیح ریزوبیومی مستقیم و غیرمستقیم بر تمامی فرآیندهای رشدی یونجه اثر مثبت گذاشت. این اثرات به‏دلیل سازوکارهای متعدد است. به‏دنبال تلقیح ریزوبیومی، افزایش پارامترهای رشد، رنگیزه‌های فتوسنتزی، جذب عناصر، میزان پروتئین که می‌تواند ناشی از تثبیت N2 و جذب بیشتر نیتروژن از محیط باشد رخ داد. تلقیح ریزوبیومی اثرات منفی ناشی از فقدان آهن (صفر میکرومولار) را کاهش داد. مکانیسم‌های دفاعی گیاهان در برابر تنش در گیاهان تلقیح‌شده با شدت کمتر مشاهده شد. همین کاهش تولید متابولیت‌های ثانویه در گیاهان تلقیح‌یافته تحت تنش خود دلیل دیگری بر تاثیر تلقیح بر رشد غیرمستقیم گیاهان در شرایط تنش است، زیرا تولید متابولیت‌های ثانویه خود هزینه‏بر است. بنابراین تلقیح ریزوبیومی یونجه با افزایش سطح جذب ریشه و جذب عناصر، افزایش سطح برگ و رنگیزه­های فتوسنتزی و در نتیجه فتوسنتز بیشتر، افزایش جذب نیتروژن و در نتیجه افزایش تولید پروتئین سبب افزایش مستقیم رشد گیاه در شرایط تنش و عدم تنش می‌شود. بیش‏ترین مقدار تمامی شاخص‌های رشد متعلق به گیاهان تلقیح‌شده و تیمار ۱٠ میکرومولار نانو آهن می‌باشد. لازم به‏ذکر است استفاده از هر ماده‌ای که در خاک پایدار و بی‌حرکت است مانند نانو ذرات، بایستی با احتیاط انجام شود. نانو ذرات فوق، عناصر هستند، بنابراین در محیط زیست تجزیه نمی‌شوند، ممکن است غلظت یک نانو ذره در حال حاضر سمی نباشد ولی بعد از ده سال کاربرد دائمی آن در خاک سمی شود. به‏نظر می‌رسد بسیاری از نانو ذرات پایدار و نسبتا بی‌تحرک در خاک بسته به نوع نانوذره و خصوصیات خاک، در بیوتای خاک و بافت‌های گیاه ذخیره می‌شوند بنابراین لازم است دائم از طریق آزمایشهای مختلف، اثرات افزودن تکراری نانو ذرات بر روی ویژگی‌های خاک و موجودات زنده آن بررسی شد تا غلظت آنها به آستانه سمی نرسد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از حوزه معاونت محترم پژوهشی و فناوری دانشگاه اراک جهت حمایت مالی و اجرایی این تحقیق تشکر و قدردانی می‌کنند.

1. Delic D, Stajkovic-Srbinovic O, Radovic J, Kuzmanovic D. et al., Difference in symbiotic N2 fixation alfalfa, Medicago sativa L. cultivars and Sinorhizobium spp. strains in field conditions.  Romanian Biotechnological Letters. 2013; 18 (6): 8743-8750.
2. Laranjo M, Alexandre A, Oliveira S. Legume growth-promoting rhizobia: An overview on the Mesorhizobium genus. Microbiological Research. 2014; 169(1): 2-17.
3. Pesakovic M, Karaklajic-Stajic Z, Milenkovic S, Mitrovic O. Biofertilizer affecting yield related characteristics of strawberry (Fragaria  ananassa Duch.) and soil micro-organisms. Scientia Horticulturae. 2013; 150: 238-243.
4. Thomine S, Vert G. Iron transport in plants: better be safe than sorry. Current Opinion Plant Biology, 2013; 16(3): 322-327.
5. Niranjana SR, Hariprasad P. Understanding the mechanism involved in PGPR-mediated growth promotion and suppression of biotic and abiotic stress in plants. Springer Science, Business Media New York. 2014; 59-109.
6. Roosta HR, Jalali M, Vakili Shahrbabaki MA. Effect of nano-chelate, Fe-Eddha and FeSo4 on vegetative growth, physiological parameters and some nutrient elements concentration of four varieties of lettuce (Lactuca sativa L) in NFT system. Journal of Plant Nutrition; 2015; 38(14): 2176-2184.
7. Tian H, Kah M, Kariman Kh. Are Nanoparticles a Threat to Mycorrhizal and Rhizobial Symbioses? A Critical Review. Frontiers in microbiology. 2019; 10:1-15.
8. McKee MS, Filser J. Impacts of metal-based engineered nanomaterials on soil communities. Environmental Science: Nano. 2016; 3(3): 506–533.
9. Hatami M, Kariman K, Ghorbanpour M. Engineered nanomaterial-mediated changes in the metabolism of terrestrial plants. The Science of Total Environment. 2016; 571: 275–291.
10. Kah M, Kookana RS, Gogos A, Bucheli TD. A critical evaluation of nanopesticides and nanofertilizers against their conventional analogues. Nature Nanotechnology. 2018; 13(8): 677–684.
11. Asadishad B, Chahal S, Akbari A, Cianciarelli V. et al. Amendment of agricultural soil with metal nanoparticles: effects on soil enzyme activity and microbial community composition. Environtal Science and Technology. 2018; 52(4): 1908–1918.
12. Karunakaran G, Suriyaprabha R, Manivasakan P, Yuvakkumar R. et al. Effect of nanosilica and silicon sources on plant growth promoting rhizobacteria, soil nutrients and maize seed germination. Iet Nanobiotechnology. 2013; 7(3): 70–77.
13. Burke DJ, Pietrasiak N, Situ SF, Abenojar EC, et al.  Iron oxide and titanium dioxide nanoparticle effects on plant performance and root associated microbes. International Journal of Molecular Science. 2015; 16(10): 23630–23650.
14. Sarabia-Castillo CR, Fernández-Luqueño F.  TiO2, ZnO, and Fe2O3 Nanoparticles Effect on Rhizobium Leguminosarum-Pisum Sativum L. symbiosis. Ciudad Obregón: 3rd Biotechnology Summit 2016, 2016; 144–149.
15. Molla AH, Shamsuddin ZH, Halimi MS, Morziah M, et al., Potential for enhancement of root growth and nodulation of soybean co-inculated whit Azospirillum and Bradyrhizobium in laboratory systems. Soil Biology and Biochemistry. 2001; 33(2001): 457-463.
16. Caetano-Anolles G, Wall LG, De Micheli AT, Macchi EM, et al. Role of motility and chemotaxis in efficiency of nodulation by Rhizobium meliloti. Plant Physiology.1988; 86(4): 1228-1235.
17. Bai Y, Zhou X, Smith DL. Crop ecology, management and quality: enhanced soybean plant growth resulting from coinoculation of Bacillus strains with Bradyrhizobium japonicum. Crop Science. 2003; 43: 1774-1781.
18. Askary M, Talebi SM, Amini F, dousti balout bangan A.  Effects of Iron nanoparticles on  Mentha piperita L. under salinity stress. Biologija . 2017; 63(1): 65-75.
19. Prasad TNV, Sreeprasad TS, Sajanlal PR, Pradeep T. Effect of nanoscales zinc oxide on the germination, groeth and yield of peanut. Journal of Plant Nutrition. 2012; 35(6): 905-927.
20. Dokhe SA, Mahajan P, Kamble R, Khanna A. Effect of nanoparticles suspension on the growth of mung (Vigna radiata) seedlings by foliar spray method. Nanotechnology Development. 2013; 3(1): 1-5.
21. Holt JG, Kreig NR, Sneath PHA, Staley JT, et al. Bergeys manual of determinative bacteriology. Williams and Wilkins Baltimore USA. 1994.
22. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology. 1949; 24(1): 1-15.
23. Lichtenthaler HK, Wellburn AR. Determinations of total carotenoids and chlorophylls a and b of leaf extract in different solvents. Biochemical Society Transactions.1983; 11(5): 591-592.
24. Bates LS, Waldren RP. Teare Rapid determination of free prolin for Water stress studies. Plant and soil.1973; 39: 205-207.
25. Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantification of microgram guantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 1976; 72(1-2): 248-254.
26. Abe N, Murata T, Hirota A. Novel 1,1-diphenyl-2-picryhy-drazyl- radical scavengers, bisorbicillin and demethyltrichodimerol, from a fungus. Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1998; 62(4): 661-662.
27. Giannopolitis CN, Ries SK. Superoxide dismutases: I. occurrence in higher plants. Plant Physiology.1997; 59(2): 309-314.
28. Cakmak I, Marschner H. Manesium deficiency and high light intensity enhance activities of superoxide dismutase, ascrobate peroxidase and glutathione reductase in bean leaves. Plant Physiology.1992; 98(4):1222-1227.
29. Polle A, Otter T, Seifert F. Apoplastic peroxidases and lignification in needles of Norway spruce (Picea abies L.). Plant Physiology. 1994; 106(1): 53-56.
30. Wang BS, Zhao KF. Comparison of extractive methods of Na+, K+ in wheat leave. Plant Physiology Comunication.1995; 31(1): 50-52.
31. Kohler J, Caravaca F, Roldan A. Interactions between a plant growth promoting rhizobacterium, an AM fungus and a phosphate-solublising fungus in the rhizosfere of Lactuca sativa. Applied Soil Ecology.2007; 35 (3): 480-487.
32. Celik MC, Tureli M, Celik Y, Yanar U, et al., Fatty acid composition of the blue crab (CallinectessapidusRathbun, 1896) in the North Eastern Mediterranean. Food Chemistry. 2004; 88: 271-273.
33. Briat JF, Dubos C, Gaymard F. Iron nutrition, biomass production and plant product quality. Trends in Plant Science. 2015; 20(1): 33-40.
34. Prasad R, Kumar M, Varma  A. Role of PGPR in Soil Fertility and Plant Health. Soil Biology. 2015; 42: 247-260.
35- Khalid S, Asghar HN, Akhtar MJ, Aslam A, et al., Biofortification of iron in chickpea by plant growth promoting rhizobacteria. Pakistan Journal Botany. 2015; 47(3): 1191-1194.
36. Mohamadipoor R, Sedaghathoor S, Mahboub-Khomami A. Effect of application of iron fertilizer in two methods foliar and soil application on growth characteristics of Spathyphyllum illusion. European Journal of Experimental Biology. 2013; 3(1): 232-240.
37. Jokar L, Ronaghi A, Karimian N, Ghasemi-Fasaei R. Effect of different Fe levels from Fe-nano-chelate and Fe-EDDHA Sources on growth and some nutrients concentration in cowpea in a calcareous soil. Journal Science & Technology. Greenhouse Culture. 2014; 6 (22): 19.
38. Kokina I, Plaksenkova I, Jermajonoka M, Petrova A. Impact of iron oxide nanoparticles on yellow medick (Medicago falcate L.) plants.  Journal of Plant Interactions. 2020; 15(1): 1-7.
39. Askary m, Amirjani m, Saberi t. Comparison of the effects of nano-iron fertilizer with iron-chelate on growth parameters and some biochemical properties of  Catharanthus roseus. Journal of plant nutrition. 2017; 40(7): 974-982.
40. Pii Y, Penn A, Terzano R, Crecchio C, et al.  Plant-microorganism-soil interactions influence the Fe availability in the rhizosphere of cucumber plants. Plant Physiology and Biochemistry. 2015; 87: 45-52.
41. Kallala N, Mۥsehli W, Jelali K, Kais Z. et al.,  Inoculation with efficient nitrogen fixing and indolacetic acid producing bacterial microsymbionet enhance tolerance of the model legume Medicago truncatula to iron deficiency. Biomed Research International. 2018; 2018: 1-14.
42. Slatni T, Vigani G, Salah IB, Kouas S, et al. Metabolic changes of iron uptake in N2-fixing common bean nodules during iron deficiency. Plant Science. 2011; 181(2): 151-158.
43. Bejandi T, Sharifi R, Sedghi M, Namvar A. Effects of plant density Rhizobium inoculation and microelements on nodulation chlorophyll content and yield of chickpea (Cicer arietinum L.). Annals of Biological Research. 2012; 3(2): 951-958.
44. Sharma P, Kumawat KC, Kaur S. Plant growth promoting rhizobacteria in nutrient enrichment: current perspectives. Biofortification of Food Crops. 2016; 4: 263-289.
45. Bashan Y, Bustillos JJ, Leyva LA, Hernandez JP, et al. Increase in auxiliary photoprotective photosynthetic pigments in wheat seedlings induced by Azospirillum brasilense. Biology and Fertility of Soils. 2006; 42(4): 279-285.
46. Peyvandi M, Parande H, Mirza M. Comparison of nano Fe chelate with Fe chelate effect on growth parameters and antioxidant enzymes activity of Ocimum Basilicum. New Cell Molecular Biotecnology. 2011; 1(4): 89-99.
47. Verbruggen N, Hermans C. Proline accumulation in plants. Amino Acids. 2008; 35: 753-759.
48- Rabie GH, Almadani AM. Role of bioinoculants in development of salt- tolerance of Vicia faba plants under salinity stress. African Journal of biotechnology. 2005; 4(3): 210-222.
49. Naveed M, Mehboob I, Hussain MB, Zahir ZA. perspective of rhizobial inoculation for sustainable crop production. Plant Microbes Symbiosis.2015; 209-239.
50. Rawashdeh HM, Florin S. Foliar application with iron as a vital factor of wheat crop growth, yield quantity and quality: A Review. International Journal of Agricultural Policy and Research.2015; 3(9): 368-376.
51. Kohler J, Antonio Hernandes J, Caravaca F, Roldan A. Induction of antioxidant enzymes is involved in the greater effectiveness of a PGPR Versus AM fungi with respect to increasing the tolerance of lettuce to sever salt stress. Environmental and Experimental Botany. 2009; 65(2-3): 245-252.
52. Foyer CH, Noctor G. Redox homeostis and antioxidant signaling: a metabolic interface between stress perception and physiological responses. Plant Cell. 2005; 17: 1866-1875.
53. Yadav SK. Heavy metals toxicity in plants: An overview on the role of glutathione and phytochelatins in heavy metal stress tolerance of plants. South Africa Journal Botany. 2010; 76(2): 169-179.
54. Jha Y, Subramanian RB. PGPR regulate caspase-like activity, programmed cell death and antioxidant enzyme activity in paddy under salinity. Physiology Molecular Biology Plants. 2014; 20(2): 201-207.
55. Selvakumar G, Panneerselvam P, Ganeshamurthy AN. Bacterial mediated alleviation of abiotic stress in crops. In: Maheshwari DK (ed) Bacteria in agrobiology: stress management. Springer Berlin. 2012; 205-224.
56. Maheshwari DK, Dheeman S, Agarwal M. Phytohormone-producing PGPR for sustainable agriculture. Springer International Publishing Switzerland. 2015; 159-189.
57. Kobraee S, NoorMohamadi G, HeidariSharifAbad H, DarvishKajori F, et al. Micronutrients Distribution in soybean plant with Zn, Fe and Mn application. Annual Review & Research in Biology. 2013; 3(2): 83-91.
58. Abbas G, Hussain F, Anwar Z, Khattak JZK, Ishaque M, Asmat U. Effect of iron on the wheat crop (Triticum aestivum L.) by uptake of nitrogen, phosphorus and potassium. Asian Journal Agriculture Science. 2012; 4(3): 229-235.
59. Mahmoudi  K. Differences in responses to iron deficiency between two legumes: lentil (Lens culinaris) and chickpea (Cicer arietinum). Journal of Plant Physiology. 2005; 162(11): 1237-1254.
60. Saha R, Saha N, Donofrio RS, Bestervelt LL. Microbial sidrophores: a mini review. Journal Basic Microbiology.2013; 53(4): 303-317.