مطالعه اثر محافظتی کروسین بر ماست‏سل‌ها و عروق خونی و تغییرات بیوشیمیایی تخمدان و سرم موش‌های سوری متعاقب استرس اکسیداتیو ناشی از بوسولفان

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه ارومیه، دانشکده دامپزشکی، گروه علوم پایه، ایران

چکیده

هدف: هدف این مطالعه ارزیابی اثرات محافظتی کروسین بر ماست‏سل­ها و عروق خونی و تغییرات بیوشیمیایی تخمدان و سرم در موش‌های درمان شده با بوسولفان می‏باشد.
مواد و روش‏ها: در این مطالعه تجربی30 سر موش نژاد NMRI در6 گروه مساوی در یک دوره 21 روزه مورد مطالعه قرار گرفتند. گروه کنترل سالم، حلال بوسولفان به حجم 1/0 میلی لیتر و گروه بوسولفان، فقط بوسولفان با دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم تک دوز دریافت کردند. گروه‌های تجربی شماره 1،2،3 کروسین را به‏ترتیب با دوزهای 100،200،400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه به‏همراه بوسولفان با دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم  تک دوز دریافت نمودند. گروه کنترل مثبت، کروسین با دوز 400 میلی‏گرم برکیلوگرم روزانه دریافت نمود. پایان دوره تخمدان چپ موش‏ها جهت مطالعه ماست‏سل‏ها و عروق خونی و تخمدان راست و سرم خونشان جهت ارزیابی‏های بیوشیمیایی مورد استفاده قرار گرفتند. دادههای حاصله با استفاده از نرم افزار SSPS و روش آماری AVONA یک طرفه و تست تعقیبی yekuT مورد مقایسه قرار گرفتند و اختلاف در سطح 5/0>p معنی‌دار توصیف شد.
نتایج: نتایج نشان داد بوسولفان باعث افزایش معنی‌دار ماست‏سل­ها (011/0p=) و کاهش معنی‏دار عروق خونی (009/0p=) و افزایش معنی‌دار مالون‏دی‏آلدئید (000/0p=) و کاهش معنی‏دار آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (000/0p=) نسبت به گروه کنترل شد، در حالی‏که کروسین در تمامی دوزهای مورد استفاده در مطالعه حاضر به‏خصوص در دوز 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم به‏طور قابل توجهی آثار نامطلوب بوسولفان را تعدیل نمود.
نتیجه‏گیری: متعاقب این تحقیق مشخص شدکه کروسین به‏علت خاصیت آنتی‏اکسیدانتی می‏تواند به‏طور قابل توجهی عوارض سوء بوسولفان را کاهش دهد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان به‏عنوان یکی از علل اصلی مرگ و میر در جهان به‏شمار می‏رود. شیمی‌درما­­­­­نی روش متداول درمان سرطان می­باشد. بوسولفان از جمله داروهای شیمی‌درمانی بوده که به‏طور گسترده مورد استفاده قرار می گیرد. این دارو دارای اثرات جانبی متعددی از جمله سمیت­های تولید مثلی می‏باشد (1).

بوسولفان عموما‏ جهت درمان لوسمی مزمن، سرطان تخمدان و همچنین قبل از عمل پیوند مغز استخوان در بیماران سرطانی مورد استفاده قرار می گیرد. آسیب داروهای شیمی درمانی از جمله بوسولفان به DNA سلول منجر به القای پیری و در شرایطی آپوپتوزیس می‏شود. این دارو توانایی القای آپوپتوزیس را در سلول­های زایا دارد. بوسولفان از گروه داروهای آلکیله کننده بوده و یک دی متان سولفانات می‏باشد (2). همچنین بوسولفان از داروهای سیتوتوکسیک نیز بوده و وقتی هیدرولیز می‏شود گروههای متان سولفونات آزاد کرده و این متان سولفونات نهایتا به اسید متان سولفونیک و تتراهیدروفوران تبدیل شده که باعث آلکیله شدن DNA شده و از همانند سازی  DNAو ترجمه RNA ممانعت می‏کند (3). آلکیله شدن باعث Cross Linking در  DNAنیز شده و در نهایت از تکثیر سلول‏های سرطانی جلوگیری کرده و باعث آپوپتوزیس سلول‏ها ازطریق مسیر P53 می‏گردد (4).

عدم تعادل بین آنتی‌اکسیدانت­ها و اکسیدانت­ها باعث ایجاد استرس اکسیداتیو می‌شود (5، 6) که برای کاهش اثرات استرس اکسیداتیو بایستی از آنتی‌اکسیدانت‌ها استفاده کرد (7). در سال‌های اخیر تحقیقات نشان داده که نمونه‌های گیاهی می‌توانند به‏عنوان داروهای موثری به‏عنوان آنتی‌اکسیدانت مناسب مورد استفاده قرار بگیرند (8، 9).

کلاله گل زعفران Crocus sativus)) شامل مواد شیمیایی متنوعی می‌باشد (10). کروسین موجود در زعفران به‏عنوان کاروتنوئید گلیکوزیله با تاثیر متنوع فارماکولوژیکی می‌باشد (11) که از جمله این تاثیرات می‌توان حفاظت سلول‌های عضله قلبی در آسیب‌های هیپوکسی (12) و خاصیت حفاظتی آنتی‌اکسیدانتی روی سلول‌های سرطانی (13، 14) و خاصیت ضدافسردگی (15، 16) و خاصیت ضدالتهابی (17) را نام برد. مطالعات نشان داده کروسین دارای ترکیبات کاروتنوئید، مونوترپن آلدئید، پیکروکروسین و سافرانال می‏باشد (18).

مطالعه حاضر با هدف تعیین اثرات سوء بوسولفان در تخمدان و سرم و اثر محافظتی کروسین متعاقب تنش اکسیداتیو ناشی از مصرف بوسولفان در موش‏های سفید کوچک آزمایشگاهی تحت درمان با دوزهای متفاوت کروسین انجام گرفت.

 

مواد و روش‌ها

در این مطالعه 30 سر موش سوری نژاد NMRI بالغ سالم با وزن 25-22 گرم از شرکت مد زیست سامانه پیشرو تهران تهیه شد و در شرایط 12 ساعت روشنایی و 12ساعت تاریکی در دمای 25-20 درجه سانتی‏گراد و رطوبت 60-30 درصد در حیوان‏خانه دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه نگه‏داری شدند. موش­ها محدودیتی از نظر دسترسی به آب و غذا نداشتند.

مطالعه حاضر براساس دستورالعمل کار با حیوانات آزمایشگاهی کمیته اخلاقی دانشگاه ارومیه انجام شد (کد اخلاقی: AECVU-197-2019). تمامی آزمایشات این تحقیق در آزمایشگاه بافت شناسی و جنین شناسی دانشکده دامپزشکی  دانشگاه ارومیه انجام گرفت.

موش‌ها به‏طور تصادفی به 6 گروه 5 تایی تقسیم شدند:

گروه کنترل سالم، حلال BSF (بوسولفان) را به‏مقدار 50 درصد DMSO و 50 درصد PBS با حجم 1/0 میلی‏لیتر به‏صورت داخل صفاقی (IP) تک دوز و گروه بوسولفان، فقط بوسولفان با دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم داخل صفاقی، تک‏دوز به حجم 1/0 میلی‏لیتر دریافت کردند (19).

گروه‌های تجربی شماره 1،2،3 کروسین را به‏ترتیب با دوزهای 100،200،400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه داخل صفاقی به حجم 3/0 میلی‏لیتر به‏همراه بوسولفان با دوز 10 میلی‏گرم بر کیلوگرم داخل صفاقی تک دوز به‏حجم 1/0 میلی‏لیتر دریافت نمودند. گروه کنترل مثبت فقط کروسین با دوز 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه داخل صفاقی به‏حجم 3/0 میلی‏لیتر دریافت نمود.

بعد از 21 روز تیمار پیوسته، موش‌ها به‏وسیله کتامین 10 درصد (محصول انستیتو پاستور ایران) به‏میزان 75 میلی‏گرم بر کیلوگرم و زایلازین 2 درصد (محصول انستیتو پاستور ایران) به‏میزان 3 میلی‏گرم بر کیلوگرم بیهوش شده و نمونه‌های خون توسط سرنگ‌های استریل مستقیما ازقلب (بطن راست) با این روش که سرسوزن شماره 24 در طرف چپ قفسه سینه از بین دنده­های پنج و شش عبور داده شده و به‏طرف قلب جلو رانده می­شود و به‏این ترتیب خون موش­ها جمع‏آوری شده و در داخل لوله­های آزمایش قرار گرفتند. سرم­ها از نمونه­های خون گرفته شده پس از سانتریفوژ با rpm 000 3 به‏مدت 51 دقیقه، جدا شدند و سپس داخل میکروتیوب استریل ریخته شده و تا زمان آزمایشات بیوشیمیایی در دمای 70- درجه سانتی‏گراد نگه‏داری شدند. در مرحله بعدی موش­ها با دوز بالای داروی بیهوشی کتامین 081 میلی‏گرم بر کیلوگرم آسان کشی شدند. سپس تخمدان چپ موش­هاخارج شده و جهت مطالعات ماست‏سل­ها و عروق خونی در محلول ثبوتی (فرمالین بافری 01   درصد) قرار داده شدند و پس از اطمینان از ثبوت بافتی، با پارافین قالب­­­­­‌گیری شده و سپس توسط میکروتوم از بافت‌های تخمدانی مقاطع سریالی به ضخامت 5 میکرومتر تهیه شد. نیمی از مقاطع بافتی جهت رنگ آمیزی تولوئیدن بلو برای شمارش ماست سل­ها و نیمی دیگر از مقاطع بافتی هم جهت رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین- ائوزین برای شمارش عروق خونی اختصاص یافتند. بعد از رنگ آمیزی­های اختصاصی، شمارش ماست‏سل­ها در تمامی قسمت­های مقاطع بافتی هر تخمدان به‏دقت انجام گرفته و ثبت شدند. همین‏طور تمامی مقاطع عروقی در همه قسمت­های مقاطع بافتی تخمدان­­­­ها هم به‏دقت شمارش شده و ثبت شدند (02).

تخمدان راست موش­ها نیز جهت ارزیابی مالون‏دی‏آلدئید (Malondialdehyde) خارج شده و به‏همراه سرم­ها در دمای 70- درجه سانتی‏گراد تا روز انجام آزمایشات قرار گرفتند. MDA شاخص پراکسیداسیون لیپیدی بوده و جهت تعیین میزان پراکسیداسیون لیپیدی، مقدار تولید MDA در بافت تخمدان با استفاده از روش واکنش تیوباربیتوریک اسید (Thiobarbituric acid) مورد اندازه‌گیری قرار گرفت که به‏منظور انجام این آزمایشcc 1 از بافت هموژن شده) 10 درصد وزن حجمی از بافت­های تخمدان فریز شده با  KCl 10درصد هموژن شدند) باcc 2 از محلول MDA مخلوط شدند و به‏مدت 15دقیقه درون  boilerدر دمای 100 درجه سانتی‏گراد قرار داده شدند و با دور rpm 10000 به‏مدت 10 دقیقه سانتریفوژ شده و در نهایت پس از سرد کردن میکروتیوب‏ها روی یخ، میزان جذب مایع رویی در طول موج 550 نانومتر به‏وسیله دستگاه الایزا  (Biottech-ELX-808iu)محاسبه شد که پس از محاسبه میزان پروتئین در بافت به‏روش Bradford protein Assay مقدار مالون‏دی‏آلدئید بر حسب نانومول بر میلی‏گرم پروتئین بیان شد (21).

در نمونه‏های سرم به‏منظور ارزیابی آنزیم سوپراکسید دیسموتاز (Superoxide dismutase) از کیت Zell Bio GmBh (محصول شرکت Zell Bio کشور آلمان ، Cat n: Z185-S, Gmbh) بنابر راهنمای شرکت سازنده کیت استفاده شد. دراین کیت از واکنش تبدیل آنیون سوپراکسید به پراکسیدهیدروژن و اکسیژن استفاده می­شود. اندازه‏گیری SOD در کیت مذکور بر اساس تولید رادیکال‌های سوپراکسید تولید شده در سامانه گزانتین و گزانتین اکسیداز انجام می‏شود که با نیترو بلوتترازولیوم (Nitro Blue Tetrazolium) واکنش نشان داده و رنگ فورمازان (ارغوانی رنگ) ایجاد می‌کند. در این روش رادیکال‏های سوپراکسید باعث تبدیل NBT به NBTH2 ارغوانی رنگ می‏شوند. با افزودن سرم به محیط آزمایش، تولید رنگ ارغوانی توسط SOD مهار می شود و با سنجش تغییر رنگ ایجاد شده در طول موج 560 نانومتر فعالیت SOD برحسب درصد مهار تولید NBTH2 اندازه‌گیری شده و میزان این واکنش بر اساس میلی‌مول در دقیقه بیان می‏شود (22).

داده‏های حاصله با استفاده از نرم افزار SPSS (Version 16.00, USA) و روش آماری ANOVA یک‏طرفه و تست تعقیبی توکی  Tukeyمورد مقایسه آماری قرار گرفتند و اختلاف بین گروه‌ها در سطح 05/0>p معنی‌دار توصیف شد و تمامی داده‌ها با میانگین و معیار خطا نشان داده شدند.

 

نتایج

در این مطالعه میانگین تعداد ماست‌سل‌ها در تخمدان چپ گروه‌های آزمایشی مورد ارزیابی قرارگرفت و نتایج نشان داد که میانگین تعداد ماست‌سل‌ها در گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین 200 و 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه دریافت‌کننده بوسولفان کاهش داشت و این کاهش دارای اختلاف معنی‌داری بود (034/0p= و 024/0p=)، و در گروه دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین100 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه هم کاهش نشان داد که این کاهش فاقد اختلاف آماری معنی‌داری بود (504/0p=). ارزیابی‌های آماری مشخص کرد که میانگین تعداد ماست‌سل‌ها در گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین100و 200 و 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه کنترل افزایش داشت که این افزایش فاقد اختلاف  معنی‌داری بود (314/0p= و 999/0p= و 977/0p=). در گروه دریافت‌کننده کروسین400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نیز نسبت به گروه کنترل اختلاف آماری معنی‌داری مشاهده نشد (0/1P=) (نمودار 1)، (شکل 1).

 

 

نمودار 1: مقایسه میانگین تعداد ماست‏سل­ها در تخمدان چپ گروه­ها­ی مختلف آزمایشی (روش آماری ANOVA یک‏طرفه و تست تعقیبی توکی Tukey)

حروف نامشابه نمایان‌گراختلاف معنی‏دار در سطح 05/0p< می‏باشند.

 

 

 

شکل 1: برش عرضی تخمدان چپ درگروه کنترل (A)، گروه بوسولفان (B)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (C)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین 200 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (D)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین 400 میلی‏گرم برکیلوگرم روزانه (E)، گروه کروسین 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (F)، که پیکان‏های زرد نشان‏دهنده ماست‏سل­ها می‌باشند. (رنگ‏آمیزی تولوئیدن بلو، درشت‏نمایی x400)

 

مطالعات حاصل از ارزیابی آماری نشان داد که میانگین تعداد عروق خونی در گروه دریافت‌کننده بوسولفان نسبت به گروه کنترل کاهش یافته که این کاهش از نظر آماری دارای اختلاف معنی‌داری بود (009/0p=). در گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین 100 و 200 و 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه بوسولفان افزایش میانگین تعداد عروق خونی دیده شد که این افزایش از نظر آماری دارای اختلاف معنی‌داری نبود (978/0p= و 390/0p= و 942/0p=). بین گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین 100 و 200 و 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه اختلاف آماری معنی‌داری مشاهده نشد (808/0p= و 000/1p= و 891/0p=). همچنین در گروه دریافت‌کننده کروسین 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه کنترل اختلاف آماری معنی‌داری از نظر میانگین تعداد عروق خونی مشاهده نشد (919/0p=) (نمودار 2)، (شکل 2).

 

نمودار 2: مقایسه میانگین تعداد عروق خونی تخمدان چپ در گروه­های آزمایشی (روش آماری ANOVA یک طرفه و تست تعقیبی توکیTukey )

حروف نامشابه نمایان‌گر اختلاف معنی‏دار در سطح 05/0p< می‏باشند.

 

شکل 2: برش عرضی تخمدان چپ درگروه کنترل (A)، گروه بوسولفان (B)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین 100 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (C)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین200 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (D)، گروه بوسولفان به‏همراه کروسین 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (E)، گروه کروسین 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه (F) که پیکان‏های قرمز نشان دهنده عروق خونی، پیکان‏های سبز نشان دهنده جسم زرد، پیکان‏های آبی نشان دهنده فولیکول آترتیک پیش آنترم، پیکان‏های قهوه‏ای نشان دهنده فولیکول آترتیک آنترم‏دار، پیکان‏های سفید نشان دهنده فولیکول در حال رشد ثالث و پیکان های سیاه نشان دهنده فولیکول در حال رشد بالغ می‏باشند (رنگ‏آمیزی هماتوکسیلین–ائوزین، درشت‏نمائی x100).

 

نتایج ارزیابی میانگین غلظت مالون‏دی‌آلدئید در تخمدان راست موش‌های گروه‌های آزمایشی نشان داد که میانگین سطح مالون‏دی‌آلدئید در گروه دریافت‌کننده بوسولفان افزایش معنی‌داری نسبت به گروه کنترل داشت (014/0p=). گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به‏همراه کروسین 100 و200 و 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه دریافت‌کننده بوسولفان کاهش نشان داد، ولی فاقد اختلاف معنی‏دار بود (117/0p= و 226/0p= و 308/0p=). همچنین نشان داده شد که گروه دریافت‌کننده کروسین400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه کنترل دارای افزایش بدون اختلاف معنی‌داری بود (085/0p=)، ( نمودار 3).

 

نمودار 3: مقایسه میانگین غلظت مالون‏دی‏آلدئید (MDA) تخمدان راست درگروه­های مختلف آزمایشی (روش آماری ANOVA یک‏طرفه و تست تعقیبی توکی Tukey)

حروف نامشابه نمایان‌گر اختلاف معنی‏دار در سطح 05/0p< می‏باشند.

بررسی نتایج مطالعه حاضر نشان داد میانگین سطح آنزیم SOD سرم در گروه دریافت‌کننده بوسولفان کاهش معنی‌داری نسبت به گروه کنترل دارد (000/0p=). مطالعات بعدی مشخص کرد که میانگین سطح آنزیم SOD در گروه‌های دریافت‌کننده بوسولفان به همراه کروسین 100 و 200 و 400 میلی گرم بر کیلوگرم روزانه  نسبت به گروه دریافت‌کننده بوسولفان افزایش یافته بود که دارای اختلاف معنی‏دار بودند (014/0p= و 000/0p= و 001/0p=). هر سه گروه دریافت‌کننده بوسولفان به همراه کروسین 100 و 200 و 400 میلی گرم بر کیلوگرم روزانه نسبت به گروه کنترل فاقد اختلاف معنی‌داری بودند (294/0P= و 914/0P= و 980/0P=). ارزیابی‌ها نشان داد که گروه دریافت‌کننده کروسین 400 میلی‏گرم بر کیلوگرم روزانه از نظر سطح آنزیمی SOD در سرم نسبت به گروه کنترل افزایش داشت که این افزایش دارای اختلاف معنی‌داری بود (007/0p=) (نمودار 4).

 

 

نمودار 4: مقایسه میانگین غلظت آنزیم سوپراکسید دیسموتاز(SOD) سرم در گروه­های مختلف آزمایشی (روش آماری ANOVAیک‏طرفه و تست تعقیبی توکی Tukey)

حروف نامشابه نمایان‌گر اختلاف معنی‏دار در سطح 05/0p< می‏باشند.

 

بحث

مطالعه حاضر نشان داد که میانگین تعداد ماست‏سل‏ها به‏عنوان سلول‏های پیش التهابی در بافت تخمدان گروه دریافت کننده Bsf به‏طور معنی‏دار نسبت به گروه‏های کنترل و دریافت کننده Bsf+Cr  به‏خصوص کروسین با دوزهای 200 و 400 میلی‏گرم به‏ازای هر کیلوگرم وزن بدن افزایش معنی‏دار نشان داد. این یافته نشان دهنده اثر التهابی Bsf بر بافت تخمدان بوده و کروسین دارای اثر محافظتی قابل ملاحظه‏ای می‏باشد. در همین راستا بررسی میزان MDA به‏عنوان شاخص استرس اکسیداتیو در بافت تخمدان نشان داد که در گروه Bsf نسبت به گروه‏های درمان شده با کروسین به‏طور معنی‏دار بیشتر بوده و این یافته نیز اثر محافظتی کروسین را در برابر Bsf به اثبات می‏رساند. همچنین بررسی میزان آنزیم SOD به‏عنوان عامل دفاع سلولی در برابر رادیکال‏های آزاد (23) در سرم خون گروه‏های درمان شده با کروسین نسبت به گروه Bsf افزایش معنی‏دار نشان داد، که این یافته نیز حاکی از وجود اثر محافظتی کروسین بر روی بافت تخمدان می‏باشد.  به‏طور کلی نشان داده شده است که گونه­های فعال اکسیژن (Reactive Oxygen Species) در سلول می‏توانند باعث اختلال در عملکرد سیستم آنتی‏اکسیدانتی شده و منجر به ایجاد استرس اکسیداتیو (Oxidative Stress) میشود (24، 25).  لذا در مطالعه حاضر، استرس اکسیداتیو ایجاد شده در گروه دریافت کننده بوسولفان موجب افزایش میانگین تعداد ماست‏سل‏ها به‏عنوان سلول ترشح کننده واسطه‏های شیمیایی التهابی مانند هیستامین و هپارین گردید. آزاد شدن هیستامین و فاکتورهای کموتاکتیک در پاسخ به استرس‌های حاد فیزیکی و شیمیایی به‏وسیله ماست‌سل‌های دگرانوله شده، باعث افزایش نفوذپذیری عروق خونی و فراخونی سلول‌های ایمنی می‌شود (26، 27). مطالعات نشان داده افزایش ماست‌سل‌ها با ناباروری در جنس نر نیز در ارتباط است (28). در مطالعات و تحقیقات قبلی عصاره گل زعفران تاثیرات آنتی‏اکسیدانتی و ضدالتهابی مشابهی را نشان داده بود (29). آسیب­های شدید به DNA متعاقب استرس اکسیداتیو، روند رونویسی­RNA و در نهایت سنتز پروتئین‏های ضروری در سلول‏ها را دچار اختلال می‏کند و سلول­ها دچار آپوپتوز می‏گردند (30). افزایش بیش از حد تراکم ROS به‏دنبال استفاده بعضی از داروها همانند بوسولفان نیز باعث استرس اکسیداتیو می‏شود (31، 32).

لازم به‏ذکر است که افزایش مقاطع عروقی به‏معنای افزایش واسکولاریته می‏باشد، یعنی هم عروق تخمدان افزایش یافته و هم جریان خون بافت تخمدان بهبود پیدا کرده است. بنابراین آنتی‏اکسیدانت‏ها با کاهش تنش اکسیداتیو باعث آنژیوژنز در بافت‏های مختلف می­شود (33) و ارزیابی نتایج این مطالعه نشان می‏داد که کروسین با افزایش خونرسانی و رگ‌زایی بافت تخمدان می‏تواند سبب افزایش فعالیت تخمدان از لحاظ عملکردی گردد که این فرایند تاثیر مثبت بر روند فعالیت تولید مثلی جنس ماده دارد.

همان‏طورکه بیان شد، در ارزیابی‌های بیوشیمیایی مطالعه حاضر مشخص شد که بوسولفان غلظت مالون‏دی‌آلدئید تخمدان را به‏صورت معنی‌داری افزایش داد. استرس اکسیداتیو از طریق مکانیسم­هایی مانند پراکسیداسیون لیپیدها، آسیب اکسیداتیو پروتئین و DNA باعث آسیب سلولی می‌شود (34). یکی از محصولات جانبی پراکسیداسیون لیپیدی، MDA می‌باشد که به‏عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی مطرح می‌باشد (35). در حقیقت MDA جهت ارزیابی میزان آسیب پراکسیداتیو لیپیدی کاربرد دارد (36). مولکول‌های مالون دی‌آلدئید با نفوذ به‏درون ساختار غشا سلول، موجب عدم تقارن در توزیع اجزای لیپیدی غشا می‌گردند. با توجه به این‌‌که پراکسیداسیون لیپیدی یک فرآیند به‏واسطه رادیکال‌های آزاد است، بنابراین بوسولفان با افزایش گونه‌های فعال اکسیژن باعث افزایش پراکسیداسیون لیپیدی می‌شود و گسترش پراکسیداسیون لیپیدی منجر به تخریب در غشا شده و نیز اکسیداسیون اسیدهای چرب و غیراشباع در غشاهای بیولوژیکی ممکن است باعث اختلال در عملکرد غشا، کاهش سیالیت آن، غیرفعال کردن گیرنده‌های غشا و افزایش نفوذپذیری غیراختصاصی به یون‌ها و اختلال در ساختار غشا گردد (37). در مطالعه حاضر مشخص شد که کروسین با دارا بودن خاصیت آنتی‏اکسیدانتی توانست از آسیب‌های وارده به غشا در اثر دریافت بوسولفان بکاهد و در نتیجه باعث کاهش MDA گردد.

بوسولفان مورد استفاده در شیمی درمانی باعث تولید رادیکال­های آزاد می‏شود و یکی از اثرات تولید رادیکال‏های آزاد در یک محیط بیولوژیکی مثل سلول، حمله به اسیدهای چرب غیراشباع موجود در ساختمان غشا سلولی است که می‏تواند باعث پارگی غشاء سلول، بروز نکروز و در نهایت فیبروز بافتی شود. واکنــش رادیکال‏های آزاد با زنجیره‏های اســیدهای چرب غیراشــباع فسفولیپیدها منجر به شکستن پیوندهای دوگانه آن‏ها، پراکسیداسیون و تخریب غشــاهای لیپیدی می‏شود (38). مالون‏دی‏آلدئید محصول نهایی پراکسیداسیون اسیدهای چرب است و سنجش میزان مالون‏دی‏آلدئید به‏عنوان شاخص پراکسیداسیون لیپیدی در تعیین میزان رادیکال‏های آزاد از اهمیت بالینی ویژه‏ای برخوردار می‏باشد (39). طبق مطالعات انجام گرفته گیاهان دارویی مثل کروسین به‏عنوان مکمل و یا جایگزین مناسب جهت کاهش عوارض داروهای شیمی درمانی مورد استفاده در درمان سرطان، گزینه مناسبی هستند زیرا طی تحقیقات انجام شده ترکیبات موجود در گیاهان دارویی می‏تواند عوارض داروهای شیمی درمانی را کاهش داده و ناهنجاری‏های ناشی از آن‏را تا حدودی اصلاح نمایند. لذا، استفاده از کروسین در مطالعه حاضر موجب کاهش معنی‏دار سطح MDA در بافت تخمدان شد و این نشان دهنده نقش محافظتی کروسین در برابر استرس اکسیداتیو حاصل از بوسولفان می‏باشد.

با توجه به این‌که استرس اکسیداتیو در نتیجه عدم تعادل بین تولید رادیکال‌های آزاد و گونه‌های فعال اکسیژن از قبیل آنیون سوپراکسید، رادیکال آزاد هیدروکسیل، هیدروژن پراکسید از یک طرف و تضعیف  سیستم دفاع آنتی‏اکسیدانتی از طرف دیگر ایجاد می‌شود، بنابراین استرس اکسیداتیو باعث ایجاد اثرات مخرب روی ماکرومولکول‌ها از جمله DNA، پروتئین‌ها و لیپیدها می‏گردد (40). در سیستم‌های بیولوژیکی هوازی برای مقابله با رادیکال‌های آزاد و گونه‌های فعال اکسیژن، مکانیسم‌های دفاعی طراحی شده است تا اثرات زیان‌بار این عوامل مهاجم را خنثی نموده یا به‏حداقل برسانند. برخی از اجزای سیستم دفاعی شامل آنزیم‌ها مانند سوپراکسید دیسموتاز، گلوتاتیون پراکسیداز، کاتالازها هستند که در داخل بدن سنتز می‌شوند، ولی برخی دیگر از اجزای این سیستم مانند ویتامینE، بتاکاروتن باید از طریق رژیم غذایی تامین شوند (41). آنتی اکسیدانت‌های آنزیمی و غیرآنزیمی سیستم‌های اصلی دفاعی بدن در برابر آسیب‌های ناشی از رادیکال‏های آزاد هستند (42). خصوصیت مهم این آنزیم‏ها، قابل القا بودن آن‏ها تحت شرایط استرس اکسیداتیو است (43). آنیون سوپراکســید اولین رادیکال آزاد مشــتق از اکســیژن است که به‏وســیله SOD به اکسیژن و پراکســید هیدروژن خنثی می‏شود. آنزیم‏های کاتالاز (Catalase) و گلوتاتیون­پراکسیداز (Glutatione Peroxidase) موجب تبدیل پراکســید هیدروژن به آب و اکسیژن می‏شوند (44). مجموعــه آنزیمی سوپراکســید ­­دیســموتاز و کاتالاز بــه‏علت اثرات مهاری بر تشــکیل رادیکال‏های اکســیژن اولین خط دفاعی سلول در برابر مســمومیت ناشی از رادیکال­های آزاد هستند و مواجهه سلول با اســترس اکســیداتیو منجر به القای آن‏ها می‏شود (45، 46). در مطالعه حاضر مشخص شد که کروسین به‏دلیل دارا بودن خواص آنتی‏اکسیدانتی و خنثی‌سازی رادیکال‌های آزاد و از دسترس خارج کردن آ‏ن‏ها برای واکنش‌های اکسیداتیو، از خواص اکسیداتیو بوسولفان می‌کاهد و آنزیمSOD که وظیفه جمع‌آوری یون سوپراکسید افزایش یافته توسط بوسولفان و خنثی سازی آن‏را به‏عهده دارد، با مصرف کروسین افزایش می‌یابد. همچنین مطالعه حاضر نشان داد که میانگین تعداد ماست‏سل‏ها در بافت تخمدان به‏عنوان یکی از سلول‏های شاخص التهاب بافتی، با استفاده از کروسین در شرایط استرس اکسیداتیو کاهش می‏یابند، ولی جهت اثبات کامل این موضوع مطالعه سایر سلول‏های التهابی مانند، انواع لکوسیت‏ها و عوامل بیوشیمیایی مربوطه همانند، عوامل استرس نیتروزاتیو در بافت تخمدان مورد لزوم می‏باشد.

 

نتیجه­گیری

در نتیجه‏گیری نهایی از این مطالعه می‏توان اظهار نمود که با به‏کارگیری کروسین همراه بوسولفان می‏توان اثرات مخرب بوسولفان در بدن را کاهش داد و نتایج حاصل از شیمی درمانی را بهبود بخشید که این می‏تواند با خاصیت از بین برندگی رادیکال­های آزاد و کاهش استرس اکسیداتیو توسط کروسین که یک آنتی‏اکسیدانت می باشد، قابل توجیه باشد. لذا طراحی کارآزمایی­های بالینی به‏منظور استفاده همزمان کروسین با بوسولفان در شیمی درمانی توصیه می‏شود تا از این طریق بتوان در جهت تولید داروهای مکمل به‏منظور کاهش عوارض ناشی از داروهای ضدسرطانی قدمی مثبت برداشته شود.

تشکر و قدردانی

این مقاله از پایان‌نامه دکترای تخصصی بافت شناسی مقایسه‏ای به‏شماره ثبت 6-1830-640 استخراج شده و با مساعدت‏های کارکنان آزمایشگاه بافت شناسی و جنین شناسی و معاونت محترم پژوهشی دانشکده دامپزشکی دانشگاه ارومیه به انجام رسیده است که از ایشان صمیمانه تقدیر و تشکر می‌شود.

1. Shahrooz R, Mones Moloody-Tappe, Razi M, Zarei L, Mohammadi V. Investigation of the Effect of Coenzyme Q10 Supplementation on Apoptosis Gene Expression and Oxidative Stress after Busulfan Injection in Rats. Yafteh. 2020; 21(4): 118-130.
2. Slattery JT, Risler L.J. Therapeutic drug monitoring of busulfan in hcmatologic stem cell transplantation. Ther Drug Monit. 1998; 20(5): 543-92.                                           
3. Probin V, Wang Y, Bai A, Zhou D. Busulfan Selectively Induces Senescence but Not Apoptosis in W138 Fibroblasts via a p53-Independent but Extracellular Signal- Regulated Kinasep38 Mitogen-Activated Protein Kinase- Dependent Mechanism,: J pharmacol Exp Ther. 2006; 319(2): 551-60.
4. Giovannini P, Howes MR, Edwards SE. Medicinal plants used in the traditional management of diabetes and its sequelae in Central America: A review. J Ethnopharmacol. 2016; 184: 58-71.
5. Chen J, Bhandar B, Kavdia M. Interaction of ROS and RNS with GSH and GSH/GPX Systems. The FASEB Journal. 2015; 29: 636-37.                                                    
6. Yancey DM, Guichard JL, Ahmed MI, Zhou L, et al, Cardiomyocyte mitochondrial oxidative stress and cytoskeletal breakdown in the heart with a primary volume overload. American journal of physiology Heart and circulatory physiology. 2015; 308(6): 651-63.                                                                               
7. Agarwal A, Durairajanayagam DS du Plesis. Utility of antioxidants during assisted reproductive techniques. An evidence based review. 2014; 12: 112.
8. Bray TM, Bettger WJ. The physiological role of zinc as an antioxidant. Free Radical Biology and Medicine. 2009; 8(3): 281-91.                                                                                  
9. Rogalska A, Marczak A, Gajek A, Marzena S, et al. Induction of apoptosis in human ovarian cancer cells by new anticancer compounds, epothilone A and B. Toxicol In Vitro. 2013; 27 (1): 239-49.
10. Abdullaey FIE-AJ. Biomedical properties of saffron and its potential use in cancer therapy and chemoprevention trials. Cancer Detect Prev. 2004; 6(28): 426-3221.
11. D’Alessandro AM, Mancini A, Lizzi AR, De Simone A, et al. Crocus sativus stigma extract and its major constituent crocin possess significant antiproliferative properties against human prostate cancer. Nutr Cancer. 2013; 65(6): 930- 42.
12. Kim SH, Lee JM, Kim SC, Park CB, et al. Proposed cytotoxic mechanisms of the saffron carotenoids crocin and cancer cell lines. Bioch Cell Biol.  2014; 92(2): 105-33.
13. Yang Y, Karakhanova S, Werner J, Bazhin AV. Reactive oxygen species in cancer biology and anticancer therapy. Curr Med Chem. 2013; 20(30): 3677-92.                       
14. Wu Y, Pan R, Geng P. The effect of Crocin against hypoxia damage of myocardial cell and its mechanism. Chinese J Appl Physiol. 2010; 26(4): 453-7.
15. Pohanka M. Alzheimer´s disease and oxidative stress: a review. Curr Med Chem. 2014; 21(3): 356-64.
16. Wang Y, Han T, Zhu Y, Zheng CJ, et al. Antidepressant properties of bioactive fraction from the extract of Crous sativus L. J Nat Med. 2010; 64(1): 3013-024.
17. Nam KN, Park YM, Jung HJ, Lee JY, et al. Anti-inflammatory effects of crocin and crocetin in rat brain microglial cells. Eur J Pharmacol. 2010; 648(1-3):106-110.
18. Salomi MJ, Nair SC, Panikkar KR. Inhibitory effects of Nigella sative and saffron (Crocus sativus) on chemical carcinogenesis in mice. Nutr Cancer. 1991; 16(1): 67-73.
19. De-Zhi W, Xin-Hua Z, Yu-Lin Y, Xin-Min Z. Optimal dose of busulfan for depleting testicular germ cells of recipient mice before spermatogonial transplantation. Asian Journal of Andrology 2010; 12(2): 263–270.
20. Gretchenl HL. Animal tissue techniques. 4th Edn., W. H. Freeman and co., Sanfrancisco. 1979; 119-121, 149, 210, 312-313.
21. WG Niehaus Jr, Samuelsson B. Formation of malonaldehyde from phospholipid arachidonate during microsomal lipid peroxidation. Eur J Biochem. 2001; 6(1): 126-30.
22. Yasuda M, Takesue S, Honda M, Nozoe T, et al. Prognostic significance of serum superoxide dismutase activity in patients with gastric cancer. Gastri ccancer. 2002; 5(3): 0148-53.
23. Gaytan F, Carrera G, Pinilla F, Aguilar R, et al. Mast cells in the testis, epididymis and accessoryglands of the rat: effects of neonatal steroid treatment. J Androl. 1989; 10(5): 350-358.
24. Janda J, Nfonsam V, Calienes F, Sligh JE, et al. Modulation of ROS levels in fibroblasts by altering mitochondria regulates the process of wound healing. Archives of Dermatological Research. 2016; 308(4): 239-48.                                       
25. Waiz SA, Raies-Ul-Haq M, Dhanda S, Kumar A, et al. Heat stress and antioxidant enzyme activity in bubaline (Bubalus bubalis) oocytes during In vitro maturation. International Journal of Biometeorology. 2016; 0(9): 1357-66.                                                                                                             
26. Gupta SC1, Kim JH, Prasad S, Aggarwal BB. Regulation of survival, proliferation, invasion,angiogenesis, and metastasis of tumor cells through modulation of inflammatory pathways bynutraceuticals. Cancer Metastasis Rev. 2010; 29(3): 405-34.
27. Stone KD, Prussin C, Metcalfe D. IgE, mast cells, basophils, and osinophils. J Allergy Clin Immunol. 2010; 125(2 Suppl 2): S73-S80.                     
28. Roaiah MM, Khatab H, Mostafa T. Mast cells in testicular biopsies of azoospermic men.  Andrologia 2007; 39(5): 185-89.                                                                                     
29. Hosseinzadeh H, Younesi HM. Antinociceptive and anti-inflammatory effects of Crocus sativus L. stigma and petal extracts in mice. BMC Pharmacol 2002; 2: 7.
30. Liu GY, Sun YZ, Zhou N, Du XM, et al. 3,3‘-OH curcumin causes apoptosis in HepG2 cells through ROS-mediated pathway. European Journal of Medicinal Chemistry. 2016; 112: 157-63.
31. Tripathi A, Chaube SK. Reduction of phosphorylated Thr-161 Cdk1 level participates in roscovitine-induced Fas ligand-mediated apoptosis in rat eggs cultured in vitro. In vitro Cell Dev Biol Anim. 2015; 51(2): 174–82.                                                
32. Tripathi A, Chaube SK. Roscovitine inhibits extrusion of second polar body and induces apoptosis in rat eggs cultured in vitro. Pharmacol Rep. 2015; 67(5): 866–74.
33. Tremellen K. Oxidative stress and male infertility aclinical perspective. Hum Reprod Update. 2008; 14(3): 243-58.
34. Saki F, Beigi M, Sadoughi MA, Adeli OA. The effect of low (7.5 mg/kg) of Asprin on ovary tissue during implantation period in Mice (NMRI). Yafte. 2012; 14(3): 85-90.
35. Radak Z, Inoue A, Kizakit M, Ishis OH, et al. Superoxide dismutase reduces oxidative damage in skeletal muscle of rats during exhaustive exercise. JAPPL Physiol. 1995; 79: 129-35.                                                                               
36. De Lamirande E, Leduc BE, Iwasaki A, Hassouna M, et al. Increased reactive oxygen species formation in semen of patients with spinal cord injury. Fertil Steril. 1995; 63(3): 637–42.
37. Hernandez-Munoz R, Montiel-Ruiz C, Vazquez-Martinez O. Royal jelly-induced neurite outgrowth from rat pheochromocytoma pc12 cells requires integrin signal independent of activation of extracellular signal-regulated kinase. Biomed Res. 2000; 28(3): 139-46.
38. Esterbauer H, Schaur RJ, Zoliner H. Chemistry and biochemistry of 4-hydroxynonenal, malondialdehyde and related aldehydes. Free Radic Biolo Med. 1991; 11(1): 81-128.
39. Cohen G, Riahi Y, Sunda V, Deplano S, et al. Signaling properties of 4- hydroxyalkenals formed by lipid peroxidation in diabetes. Free Radic Biol Med. 2013; 65: 978-87.
40. Chandra K, Salman AS, Mohd A, Sweety R, et al. Protection against FCA induced oxidative stress induced DNA damage as a model of arthritis and In vitro anti-arthritic potential of costus speciosus rhizome extract. Int J Pharmac Phyt Res. 2015; 7(2): 383-389.
41. Zarei S, Moradi H, Asadi S, Abbasalipourkair R, et al. Investigating the Effect of Zinc Oxide on Enzymatic Antioxidant Activity in Male Rats. Pajouhan Scie J. 2017; 15(3): 29-35.
42. Nordberg J, Arner E. Reactive oxygen species, antioxidant, and the mammalian thioredoxin system. Free Radic Biol Med. 2001; 31(11): 1287-312.
43. Oruc EO, Usta D. Evaluation of oxidative stress responses and neurotoxicity potential of diazinon in different tissues of Cyprinus carpio. Environ Toxicol Pharmacol. 2007; 23: 48-55.                                                                                                                               
44. Mates JM, Perez-Gomez C, Decastro IN. Antioxidant enzymes and human diseases. Clin Biochem. 1999; 32(8): 595-603.
45. John S, Kale M, Rathore N, Bhatnagar D. Protective effect of vitamine E in dimethoate and malathion induced oxidative stress in rat erythrocytes. J Nut Biochem. 2001; 12(9): 500-504.                                                                                                                                                                     
46. Michiels C, Raes M, Toussaint O, Remacle J. Importance of Se-glutathione peroxidase, catalase, and Cu/Zn-SOD for cell cervival against oxidative stress. Free Radic Biol Med. 1994; 17(3): 235-48.