بررسی اثر کلرید کبالت بر سطح برگ، کلروفیل، کاوتنوئید و بیان ژن ACC اکسیداز گیاه سیب زمینی Solanum tuberosum L. رقم وایت دزیره در کشت در شیشه

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: اتیلن یکی از هورمون‌های گیاهی است که در شرایط کشت در شیشه تولید می‌شود و تجمع آن با کاهش رشد و تغییرات مورفولوژیکی گیاه همراه است. هدف این مطالعه بررسی اثر کلرید کبالت به‏عنوان یک مهار کننده سنتز اتیلن بر رشد و برخی شاخص‌های فیزیولوژیکی و بیان ژن  (ACC) Aminocyclopropane 1-carboxylic acidاکسیداز سیب زمینی است.
مواد و روش‌ها: در این مطالعه ابتدا جوانه‌های جانبی گیاه به مدت 5 هفته در محیط کشت MS حاوی غلظت‌های صفر، 5، 10، 15، 20، 30، 40و 60 میلی‏گرم در لیتر CoCl2 در شرایط درون شیشه کشت داده شدند و غلظت بهینه انتخاب شد. سپس سطح برگ، میزان کلروفیل و کاروتنوئید و بیان ژن ACC اکسیداز بررسی شد.
نتایج: نتایج نشان داد که کلرید کبالت در محیط کشت از ایجاد ریشه‌های هوایی و نابجا جلوگیری کرد و سبب افزایش سطح برگ، میزان کلروفیل وکاروتنوئید شد. غلظت 20 میلی‌گرم در لیتر کلرید کبالت بهترین تاثیر را بر شاخص‌های رویشی نشان داد. همچنین در این غلظت بیان ژن ACC اکسیداز نسبت به گیاه شاهد کاهش یافت.
نتیجه گیری: کبالت با کاهش بیان ژن ACC اکسیداز سبب کاهش تولید و تجمع اتیلن در کشت در شیشه می‏شود و در نهایت رشد گیاه سیب زمینی به خوبی بهبود می‏یابد.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سیب‌زمینیSolanum tuberosum L.  یکی از 900 گونه جنس Solanum از خانواده Solanaceae و از مهم‏ترین محصولات غذایی جهان است که تولید آن به 275 میلیون تن در سال می‌رسد و 18 میلیون هکتار از اراضی جهان را به‏خود اختصاص داده است (1) .سیب‌زمینی دارای گلیکو‌آلکالوئید‌های فراوان و مقدار زیادی نشاسته است و به‏همین خاطر دارای ارزش غذایی، دارویی و صنعتی فراوانی است (2). این گیاه در معرض آفات و بیماری‌های مختلفی قرار گرفته و هر ساله مقدار زیادی از محصول آن از بین می‌رود. استفاده از فناوری‌های نوینی چون کشت بافت گیاهی می‌تواند کمک شایانی در افزایش کمیت و کیفیت محصولات، تولید گیاهان سالم و عاری از ویروس بنماید (1، 3 و 4). استفاده از فناوری کشت بافت گیاهی، دسترسی به گیاهانی سالم و عاری از بیماری و عوامل بیماری­زا و نیز دستیابی به اصلاحات ژنتیکی را ممکن ساخته است؛ همچنین کشت بافت گیاهی راه کوتاهی است که به‏وسیله آن می‏توان ژنهای مقاوم به عوامل بیماری­زا و ژن­های مقاوم به شرایط نامناسب مانند شوری و خشکی را به گیاه منتقل کرد (5). یکی از مشکلات کشت بافت سیب زمینی تولید و تجمع اتیلن در شیشه به‏عنوان یک فرآورده طبیعی متابولیسم گیاه است که در اثر قطع گیاهان در هنگام واکشت کردن و همچنین از برگ‏ها و جوانه­های جوان تولید می‏شود و بر رشد و نمو نمونه گیاهی اثر نا‌مطلوب می‏گذارد (6).

اثرات فیزیولوژیکی اتیلن در گیاهان شامل پیچید‌گی پهنک برگها، شکستن خواب دانه، جوانه‌زنی، القا ریشه‌زایی در برگ‌ها، ساقه و دمگل، تسریع رسیدگی میوه، دخالت در انتقال قطبی اکسین، افزایش نفوذ‌پذیری غشا (6)، ایجاد مقاومت در برابر تنش‏های زیستی، تکثیر و ریخت‌زایی گیاهان (7) و کاهش قدرت باززایی گیاه از پروتوپلاست سیب‌زمینی است (8). همچنین گزارشاتی مبنی بر تاثیر سیگنال‌ها و تنش‌های محیطی مانند خشکی، شوری، درجه حرارت بالا، شرایط غرقابی، حمله پاتوژن‌ها، ایجاد زخم و فلزات سنگین بر تولید اتیلن وجود دارد (9). قسمت عمده تولید و تجمع اتیلن در کشت بافت گیاهی در شرایط درشیشه در نتیجه زخمی کردن گیاه به‏صورت جدا‌کشت صورت می‌گیرد که سبب ایجاد ناهنجاری‌های زیستی و اثرات زیان‌باری از قبیل کاهش وزن خشک، کاهش میزان کلروفیل، کاهش سطح برگ، ایجاد ریشه‌های نا‏بجا افزایش فاصله میان‌گره‏ها می‌شود (10 و 11). برای کاهش اثرات منفی اتیلن میتوان از فعالیت یا بیوسنتز اتیلن جلوگیری نمود (8). برای این کار می‏توان از بازدارنده‌های سنتز اتیلن که منجر به کاهش اثرات منفی اتیلن در شرایط درشیشه می‌گردد استفاده نمود.

مسیر بیوسنتز اتیلن از آمینواسید متیونین شروع و ابتدا به S-‌آدنوزیل‌متیونین (SAM) تبدیل می‌شود و سپس توسط آنزیم  ACC‌ سنتاز به ACC (1- آمینو‌سیکلو‌پروپان- 1- کربوکسیلیک‌اسید) تبدیل می‌شود. این واکنش اولین واکنش محدود‌کننده سرعت در این مسیر است. در مرحله بعد، اکسیداسیون ACC به‏وسیله ACC اکسیداز سبب تشکیل اتیلن، دی‌اکسید کربن و یا سیانید می‌شود (6 و 12). گروهی از مواد مسدود کننده یا کاهش دهنده سنتز اتیلن هستند. این گروه شامل موادی هستند که با مسدود کردن قسمتی از مسیر بیوسنتز اتیلن مانع از تولید آن می­شود، مانند AVG (آمینواتوکسی‌وینیل‌گلایسین)،AOA  (آمینو‌استیک‌اسید) که از فعالیت  ACC‌سنتاز در همان مراحل اولیه سنتز اتیلن (تبدیلSAM  بهACC ) جلوگیری می‌کند (6).CoCl2  (کلرید کبالت) از مهارکننده‌های بیوسنتز اتیلن است که از تبدیل ACC  به اتیلن جلوگیری می‌کند (13 و 14). علاوه براین، کبالت (Co) دارای وزن مخصوص 8/756 و به‏عنوان یک عنصر ضروری جز سازنده چندین آنزیم وکوآنزیم در انسان و حیوانات پروکاریوت­ها است (12). همچنین کبالت برای گیاهان خانواده بقولات که تثبیت کننده­ ازت از طریق هم­زیستی هستند بسیار لازم است (15و 16). هدف از این مطالعه استفاده از کلرید کبالت در شرایط کشت در شیشه گیاه سیب زمینی، به‏منظور بررسی اثر این عنصر در کاهش بیان ژن ACC اکسیداز و در نتیجه تاثیر عدم تولید اتیلن بر برخی از شاخص­های رشد گیاه سیب زمینی است.

 

مواد و روشها

در این مطالعه از گیاهان سیب زمینی رقم وایت دزیره که قبلا در شرایط کشت بافت در آزمایشگاه فیزیولوژی گیاهی دانشگاه اصفهان موجود بود استفاده شد. جوانه­های این گیاهان روی محیط کشت موراشیک- اسکوگ (MS) (Murashige and Skoog) حاوی غلظت­های 0، 5، 10، 15، 20، 30، 40 و60 میلی­گرم در لیتر کبالت کلرید، رشد داده شدند. بخش هوایی گیاهچه­های سیب زمینی رشد یافته در محیط­های شاهد (MS) و تیمارهای 5، 10، 15، 20، 30، 40 و 60 میلی­گرم کبالت کلرید در لیتر پس از 5 هفته از محیط کشت جدا و میزان کلروفیل و کاروتنوئید به‏روش Arnon 1949 اندازه گیری شد (17).

جهت بررسی بیان ژن ACC اکسیداز از گیاهان کشت شده در محیط کشت MS و تیمار شده با 20 میلی­گرم در لیتر کبالت کلرید در پایان هفته سوم کشت استفاده گردید و RNA آن­ها طبق دستور العمل کیت استخراج RNX-Plus RNA (شرکت سیناژن) استخراج گردید. ارزیابی مقدار RNA استخراج شده با استفاده از دستگاه بیوفتومترو ژل اگارز یک درصد انجام شد. سپس طبق دستورالعمل، cDNA سنتز شد. برای بررسی میزان بیان ژن ACCاکسیداز(باAccession No: AYO989391، طراحی شده از ژنوم cDNA سیب زمینی توسط سایت NCBI) PCR ژن مورد نظر با پرایمرهای اختصاصی با توالی زیر انجام شد.

FW:5′-GGACATTGGGTGAACATTCC-3′

RV:3′-AGAAATGATGGCCTCACCAG-5′

در این آزمایش پرایمر ژن GAPDH (گلیسیرید آلدهید 3- فسفات دهیدروژناز) با توالی زیر به‏عنوان ژن کنترل داخلی برای تایید نتایج حاصل از RT-PCR مورد استفاده قرار گرفت.

FW:5′-ACCATCTTCCAGGAGCGAGA-3′

RV:3′- GCAAATGAGCCCCAGCCTTC-5

فاکتورهای اندازه گیری شده بـر اسـاس یک طـرح آمـاری کاملا

 تصادفی با 4 تکرار برای هر آنالیز انجام گرفت، داده­های حاصل با نرم افزار SPSS و تست دانکن در سطح معنی داری                0.05) (P≤ محاسبه گردید.

 

نتایج

کشت گیاهچه­های سیب زمینی Solanum tuberosum L. رقم وایت دزیره در محیط­های کشت MS حاوی غلظت‏های 15، 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2  به مدت 5 هفته در مقایسه با محیط کشت MS (شاهد) منجر به بهبود ظاهری رشد و عدم بروز ناهنجاری­های ناشی از تجمع اتیلن گردید.

کاهش رشد و تغییر خصوصیات مورفولوژی و ظاهری همچون ضعیف شدن ساقه و کاهش قطر آن، ظهور و رشد ریشههای مویین نابجا بر روی اندام هوایی گیاه در نوساقه­های رشد یافته در محیط کشت MS ساده به وضوح قابل مشاهده بود اما این علائم در غلظت­های مختلف CoCl2مخصوصا در غلظت بیشتر یا مساوی20میلی­گرم در لیتر CoCl2رویت نگردید. نتایج حاصل از شکل 1 نشان داد که غلظت­های  5 و 10و 15 میلی­گرم در لیتر CoCl2نسبت به شاهد افزایش سطح برگ نشان دادند، اما بیشترین سطح برگ با اختلاف بسیار زیاد نسبت به شاهد و سایر غلظت­های CoCl2 در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2 مشاهده شد. در غلظت­های 30 و 40و 60 میلی­گرم در لیتر CoCl2 میزان سطح برگ نسبت به شاهد اختلافی نشان نداد.

 

 

 

شکل 1: اثر غلظت­های مختلف CoCl2بر سطح برگ در گیاه سیب زمینی. داده‏ها میانگین چهار تکرار± انحراف معیار و حروف غیر مشترک بیانگر معنی دار بودن داده ها (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن است.

 

 

نتایج به­دست آمده در شکل 2 نشان دادکه غلظت­های 5، 10، 15، 20، 30 میلی­گرم در لیتر CoCl2  سبب افزایش مقدار کلروفیل a نسبت به شاهد شده است، اما غلظت 40 و 60 میلیگرم در لیتر CoCl2 میزان کلروفیلa کمتری نسبت به شاهد نشان داد. همچنین غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2بیشترین مقدار کلروفیل a را نسبت به شاهد و سایر غلظت­ها نشان داد. شکل 3 و4 نشان می­دهد که غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2 بیشترین میزان افزایش کلروفیل b و کلروفیل کل را نسبت به شاهد و سایر غلظت­ها نشان داد در حالی‏که سایر غلظت­ها اختلاف معنی­داری نسبت به شاهد نشان ندادند. شکل 5 نشان داد که غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2 بیشترین میزان کاروتنوئید را نسبت به شاهد و سایر غلظت­ها نشان داد در حالی‏که سایر غلظت­ها اختلاف معنی داری نسبت به شاهد نشان ندادند.

 

 

شکل 2: اثر غلظت­های مختلف CoCl2بر مقدار کلروفیل a در گیاه سیب زمینی. داده ها میانگین چهار تکرار± انحراف معیار و حروف غیر مشترک بیانگر معنی دار بودن داده ها (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن است.

 

شکل 3: اثر غلظت­های مختلف CoCl2بر مقدار کلروفیل b در گیاه سیب زمینی. داده ها میانگین چهار تکرار± انحراف معیار و حروف غیر مشترک بیانگر معنی دار بودن داده ها (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن است.

 

شکل 4 : اثر غلظت­های مختلف CoCl2بر مقدار کلروفیل کل در گیاه سیب زمینی. داده‏ها میانگین چهار تکرار± انحراف معیار و حروف غیر مشترک بیانگر معنی دار بودن داده ها (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن است.

 

 

شکل 5 : اثر غلظت­های مختلف CoCl2بر مقدار کاروتنوئید در گیاه سیب زمینی. داده ها میانگین چهار تکرار± انحراف معیار و حروف غیر مشترک بیانگر معنی دار بودن داده ها (05/0P≤) بر اساس آزمون دانکن است.

 

 

شکل 6: تعیین کیفیت RNA استخراج شده از گیاه توسط ژل آگارز یک درصد

 

 

نتایج حاصل از بررسی بیان ژن ACC اکسیداز پس از انجام RT-PCR بر روی بخش هوایی گیاه سیب زمینی رشد یافته در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2و گیاه شاهد (شکل 7) و آنالیز داده ها با استفاده از نرم افزار ImageJ (شکل 9) نشان داد که میزان بیان ژن ACC اکسیداز در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2 نسبت به شاهد کاهش یافته بود. این نتایج توسط نتایج حاصل از PCR ژن  GAPDH(ژن کنترل داخلی) شکل 8 تائید شد.

 

 

شکل 7: اثر CoCl2بر بیان ژن ACC اکسیداز. MS: گیاه رشد یافته در محیط کشت شاهد CoCl2: گیاه رشد یافته در محیط کشت حاوی 20 میلی گرم در لیتر کلرید کبالت

 

 

شکل 8 :کنترل داخلی، ژن GAPDH.

 

شکل9 : نتایج حاصل از آنالیز شدت باندهای DNA حاصل از RT-PCR با استفاده از نرم­افزار ImageJ در بخش هوایی گیاه سیب زمینی. MS: گیاه رشد یافته در محیط کشت شاهد CoCl2: گیاه رشد یافته در محیط کشت حاوی 20 میلی گرم در لیتر کلرید کبالت

 

 


 

بحث

در مطالعه حاضر مشاهده شد که گیاهچه­های سیب زمینی رشد کرده در محیط کشت دارای غلظت 20 میلی­گرم در لیتر CoCl2از نظر ظاهری و به‏طور کیفی به‏مراتب رشد بهتری را در مقایسه با گیاهان رشد یافته در محیط MS (کنترل) و سایر غلظت­های CoCl2 نشان داده و CoCl2 در این غلظت بیشتر از سایر غلظت‏ها مانع ظهور علائم مورفولوژیکی و ظاهری در روند رشد و نمو گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره گردید. افزایش سطح پهنک برگ و عدم ریشه زایی بخش­های هوایی در گیاهچه­های سیب زمینی از مهم‏ترین نمودهای ظاهری بازدارندگی اتیلن بود که در مطالعه حاضر مشاهده شد.

در غلظت­های کمتر کبالت به‏دلیل تولید بیشتر و تجمع اتیلن در شیشه، گیاهچه­ها رشد کمتری نسبت به بهترین غلظت کبالت (20 میلی­گرم در لیتر)، که بیشترین اثر بازدارندگی بر بیان ژن ACC اکسیداز را داشته، نشان دادند. بر اساس مطالعات پیشین، مشخص شد که اتیلن بازدارنده و کاهش دهنده تقسیم سلولی است. تجمع اتیلن در محیط کشت سبب کاهش چگالی سلولی می­شود. هنوز مکانیزم دقیق عمل‏کرد اتیلن در کاهش میتوز مشخص نیست اما احتمالا به‏دلیل تداخل در جهت­گیری میکروتوبول­ها میتوز کاهش می­یابد. اما در غلظت­های بالاتر احتمالا به دلیل سمیت کبالت میزان رشد گیاه کاهش یافته اشت. احتمالاا یون کبالت با ممانعت از بیان ژن ACC اکسیداز و کاهش تولید اتیلن در شرایط کشت در شیشه می­تواند بر روند تقسیم سلولی اثر گذاشته و با افزایش سرعت تقسیم سلولی و افزایش تعداد سلول در واحد سطح می­تواند رشد سیب زمینی را بهبود بخشیده و برگ­های بزرگ‏تری را تولید نماید. بر اساس این نتایج یون کبالت بیشترین افزایش سطح را در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر نشان داد. این نتایج با نتایج بدست آمده از افزایش سطح برگ در مطالعات پیشین در کاربرد از بازدارنده­های فعالیت و عمل‏کرد اتیلن (STS)(Silver thiosulphat) روی گیاه سیب زمینی، مطابقت دارد (18). اگرچه مکانیزم عمل یون نقره با یون کبالت در افزایش سطح برگ گیاه سیب زمینی کاملا متفاوت است اما در نهایت اثر رشد و نموی مشاهده شده از نظر سطح برگ مشابه هم هستند. همچنین Jayakumar و همکارانش (19) نشان دادند که غلظت مناسب کبالت سبب افزایش سطح برگ در گیاه سویا شد.

وجود فلزات سنگین و افزایش غلظت آن‏ها هم موجب بروز علائم سمیت در گیاهان می­شوند. وجود مقادیر سمی فلزات سنگین در محیط موجب کاهش رشد گیاهان و در حالت تشدیدتر باعث از بین رفتن گیاهان می­شود. احتمالا علائم به‏واسطه گستره­ای از روابط متقابل در سطح سلولی ملکولی می‏ باشد و کاهش رشد در غلظت­های بالای کبالت احتمالا به‏دلیل آسیب­های وارده در اثر سمیت غلظت­های بالای کبالت و یا احیانا تجمعROS   (Reactive oxygen species)است (20و21). مشخص شده که ROS می­تواند به آنزیم­های سیکل تری کربوکسیلیک اسید (TCA) و زنجیره انتقال الکترون در میتوکندری مانند ATP سنتتاز، سوکسینات دی هیدروژنار، اکونیتاز و NADH دی­هیدروژناز آسیب وارد کرده و آن‏ها را مهار یا فعالیت­شان را کاهش دهد (7و22). به همین دلیل در غلظت­های 40 و 60 میلی­گرم در لیتر CoCl2به دلیل سمی بودن این یون و عدم رشد گیاه سطح برگ­ها بسیار کاهش یافت.

کلروفیل در زندگی گیاهان عالی نقش بسیار مهمی دارد. از آن­جا که محتویات کلروفیلی گیاه، یکی از پارامتر­های شاخص عملکرد هورمون اتیلن است، بررسی تأثیر یون کبالت (به عنوان کاهنده تولید اتیلن) بر میزان کلروفیل، به صورت غیر مستقیم نشان دهنده­ی تاثیر اتیلن بر کلروفیل و فرآیند فتوسنتز است.

 به‏طور­کلی در این مطالعه، افزایش غلظت کبالت تا حدودی سبب افزایش کلروفیل، کارتنوئید در واحد سلول شد اما غلظت 20 میلی­گرم در لیتر کبالت بیشترین اختلاف و افزایش را نسبت به شاهد و سایر غلظت­ها نشان داد. بیوسنتز و تخریب کلروفیل فرآیند پیچیده­ای است که توسط فاکتورهای مختلفی تنظیم می­شود. این افزایش در میزان کلروفیل و کارتنوئید به‏طور غیرمستقیم اثر کبالت به‏عنوان کاهش دهنده بیوسنتز اتیلن را نشان می­دهد. کاهش کلروفیل تحت تاثیر هورمون اتیلن و اثرات منفی این هورمون بر کلروفیل در شرایط کشت در شیشه گزارش شده است و مشخص گردیده که میان اتیلن موجود در ظروف کشت بافت و سطح کلروفیل اندازه­گیری شده رابطه معکوس وجود دارد (18)، که این کاهش توسط کاربرد بازدارنده­های بیوسنتز یا فعالیت اتیلن مهار می­گردد. افزایش کلروفیل در غلظت­های به کار برده شده CoCl2 در این مطالعه به‏دلیل ممانعت از بیوسنتز اتیلن است. مشخص شده  که بیان ژن­های کد کننده­ آنزیم کلروفیلاز(Chlorophyllase) در میوه­های پرتقال تحت تیمار با اتیلن افزایش یافت، در نتیجه با افزایش میزان کلروفیل، که می­تواند ناشی از افزایش تقسیم سلولی سلول­های برگ، افزایش سطح پهنگ برگ و افزایش کلروفیل و کارتنوئید در واحد سلولی باشد و یا حفظ محتویات کلروفیلی (احتمالا از طریق ممانعت از تخریب کلروفیل در عدم حضور اتیلن)، می­تواند میزان تثبیت دی­اکسیدکربن و متعاقبا فتوسنتز را افزایش دهد و در نهایت از رشد بهتر و مطلوب­تری برخوردار شود (10). مشابه این اثر در مورد میزان کلروفیل سیب زمینی (10) و یا اثر بازدارندگی STS به‏عنوان بازدارنده عمل‏کرد اتیلن روی تخریب کلروفیل (7) اثر یون کبالت بر افزایش کلروفیل در گیاه سویا گزارش شده است.

در غلظت­های بالای کبالت 30 و40 و 60 میلی­گرم در لیتر به علت سمی بودن و عدم رشد گیاه تفاوت معنی­داری در میزان کلروفیل و کارتنوئید مشاهده نشد. جانشینی یون Mg2+در مولکول کلروفیل با فلزات سمی مشخصی مانند مس، روی، کادمیوم یا جیوه در طی تنش­های فلزات سنگین در گیاهان عالی نشان داده شده است که باعث تجزیه کلروفیل می­شوند (10و 18). نتایج نشان داده که یون­های فلز سنگین وابسته به غلظت بر روی انتقال الکترون در جایگاه­های چندگانه اثر می‏گذارد و انتقال انرژی را تغییر می­دهد. نتایج آزمایشات ما بر روی گیاه سیب زمینی در غلظت­های 40 و 60 میلی­گرم در لیتر سبب کاهش کلروفیل و سطح برگ گیاه شد زیرا فلزات سنگین از جمله کبالت، افزایش غلظت­شان سبب سمیت و کاهش رشد در گیاه می­شود. همچنین مشخص شده که افزایش غلظت کبالت در محدوده سمی سبب کاهش سطح برگ، و میزان کلروفیل شده است (23و 24)، که این بررسی‏ها تایید کننده­ نتایج حاصل از آزمایشات ما بود.

نتایج حاصل از RT-PCR در این مطالعه نشان داد که یون کبالت سبب کاهش بیان ژن  ACCاکسیداز در مسیر بیوسنتز اتیلن شده که از تبدیل ACC به اتیلن ممانعت کرده و در نهایت سبب کاهش میزان اتیلن تولید شده توسط گیاه سیب زمینی رقم وایت دزیره در شرایط کشت در شیشه شد. قبلا نیز گزارش شده سالیسیک اسیدSA  سبب کاهش بیان ژن ACC اکسیداز شده است (25) و همچنینAOA (Aminooxy acetic Acid) و 2,5– Norboradiene هم سبب کاهش بیان ژن ACC اکسیداز می­شود (26). اگرچه هیچ­گونه شباهتی بین  CoCl2با سالیسیلیک اسید، 2,5– Norboradiene و  Amino acetic acid وجود ندارد اما مطالعات نشان داده که CoCl2 با کاهش بیان ژن ACC اکسیداز مشابه ترکیبات ذکر شده عمل کرده و سبب کاهش میزان بیوسنتز mRNA مربوط به ژن ACC اکسیداز نسبت به گیاه شاهد شد. همچنین تیماردهی اوزون به مدت یک ساعت سبب افزایش بیان ژنACS  وACO1 (ACC اکسیداز و ACC سنتاز) در گوجه فرنگی شد. در گزارشات دیگری AVG (Amino ethoxyvinyl glycine) سبب کاهش میزان رونوشت­برداری ACS (Transcript) و ACO پس از 7 روز تیماردهی در گیاه تنباکو نسبت به شاهد شد (27). Rancelis و همکارانش (28) با استفاده از تکنیک RAPD-PCR اثر کبالت بر تغییر الگوی میتلاسیون و دِمیتلاسیون DNA گیاه Vicia faba را نشان دادند (28)، پس می­توان پیشنهاد نمود که شاید چنین مکانیسمی در کاهش بیان ژن ACC اکسیداز نیز اتفاق افتاده است. به‏طور کلی عمل‏کرد کبالت در کاهش بیان ژن ACC اکسیداز مشخص نیست و هیچ گزارش مبنی بر تاثیر کبالت بر کاهش بیان ژن ACC اکسیداز در دست نیست. احتمالا کبالت با جلوگیری از فعالیت فاکتورهای رونویسی(Transcription Factors) TF  یا کاهش سنتز TF و یا ممانعت از فعالیت RNA پلی­مراز از رونویسی ممانعت می­کند و یا با تغییر الگوی متیلاسیون DNA سبب کاهش میزان بیوسنتز ACC اکسیداز شده است. در نهایت این سوال که مکانیسم دقیق کاهش بیان ژن ACC اکسیداز چیست نیاز به بررسی­های بیشتری در آینده دارد.

 

 

نتیجه گیری

با توجه به نتایج به‏دست آمده می­توان گفت کبالت کلرید از طریق مکانیسم ناشناخته­ای سبب کاهش بیان ژن ACC اکسیداز در غلظت 20 میلی­گرم در لیتر شده و با کاهش تولید و بیوسنتز اتیلن ناهنجاری­های رشد مشاهده شده در گیاهان کنترل بسیار کاهش یافت. همچنین کبالت در این غلظت سبب افزایش سطح برگ، کلروفیل و کارتنوئید شد.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان مقاله از دانشگاه اصفهان به واسطه حمایت از این پژوهش قدردانی می­نمایند.

 

1. Sisler EC , Serek M. Inhibitors of ethylene responses in plants at the receptor level: Resent developments. Physiologia Plantarum. 1997; 100: 577-582.

2. Torrigiani P, Scaramagli S, Castiglione S, Altamura MM, et al. Downregulation of ethylene production and biosynthetic gene expression is associated to changes in putrescine metabolism in shoot-forming tobacco thin layers. Plant Science. 2003; 164: 1087-1094.

3. Apelbum A, Sisler EC, Feng X, Goren R. Assessment of the potency of 1-substituted cyclopropenes to counteract ethylene-induced processes in plant. Plant Growth Regulation. 2007; 55: 101-113.

4. Arigita L, Sanchez Tames R, Gonzalez A. 1-Methylcyclopropene and ethylene as regulators of in vitro organogenesis in kiwi explans. Plant Growth Regulation. 2003; 40(1): 59-64.

5. Ehsanpour AK, Hasanzadeh M. [The effect of Silver Thiosulphate (STS) on growth parameters of potato in in vitro culture]. Journal of Sciences. 2000; 13: 37-43. Persian

6. Torabi F, Majad A, Ehsanpour AA. Plant regeneration from cell suspension culture of potato (Solanum tuberosum L.). Pakistan journal of biological sciences: PJBS. 2008; 11(5): 778.

7. Ververidis P, John P. Complete recovery in vitro of ethylene-forming enzyme activity. Phytochemistry. 1991; 30: 725-727.

8. Shin D, Moon SJ, Han S, Kim BG, et al. Expression of StMYB1R-1, a novel potato single MYB-like domain transcription factor, increases drought tolerance. Plant Physiology. 2011; 155: 421-432.

9. Henstrand JM, Handa AK. Effect of ethylene action inhibitors upon wound-induced gene expression in tomato pericarp. Plant Physiology. 1989; 91(1): 157-162.

10. Ehsanpour AA, Jones MGK. Plant regeneration from mesophyll protoplasts of potato (Solanum  tuberosum L.) cultivar Delaware using silver thiosulfate(STS). Journal of Sciences Islamic Republic of Iran. 2001; 12(2): 103-110.

11. Kadner R, Druege U. Role of ethylene action in ethylene production and poststorage leaf senescence and survival of pelargonium cuttings. Plant Growth Regulation. 2004; 43(3): 187-196.

12. Luo H, Efimov K, Jiang H, Feldhoff A, et al. CO2 Stable and Cobalt Free Dual Phase Membrane for Oxygen Separation. Angewandte Chemie International Edition. 2011; 50: 759-763.

13. Grover S, Purves KW. Cobalt and plant development. Plant Physiology. 1976; 57(6): 886-889.

14. Yu YB, Yang FS. Auxin-induced ethylene prodaction and inhibition by aminoethoxyvinylglycine and cobalt ion. Plant Physiology. 1979; 64(4): 1074-1077.

15. Li B, Xin W, Sun S, Shen Q, et al. Physiological and molecular responses of nitrogen-starved rice plants to re-supply of different nitrogen sources. Plant and Soil. 2006; 287: 145-159.

16. Liu JH, Lee-Toman SH, Raid DM. Differential and woundinducible expression of 1-

 

aminocyclopropene-1-carboxylate oxidase genes in sunflower seedlings. Plant Molecular Biology. 1997; 34: 923-933.

17. Arnon DI. Copper enzymes in isolated chloroplasts. Polyphenoloxidase in Beta vulgaris. Plant Physiology. 1949; 24(1): 1-9.

18. Rostami F, Ehsanpour A. Application of Silver Thiosulphate (STS) on silver Accumulation and protein pattern of potato under in vitro culture. Malaysia Application of Biology. 2009; 38(2): 49-54.

19. Jayakumar K, Jaleel CA. Uptake and accumulation of cobalt in plants: a study based on exogenous cobalt in soybean. Botany Research International. 2009; 2(4): 310-314.

20. Dietz KJ, Krämer U, Baier M. Free radicals and reactive oxygen species as mediators of heavy metal toxicity. The Plant Jornal. 1999; 12: 341-349.

21. Hall J. Cellular mechanisms for heavy metal detoxification and tolerance. Journal of Experimental Botany. 2002; 53(366): 1-11.

22. Sweetlove L, Heazlewood J, Herald V, Holtzapffel R, et al. The impact of oxidative stress on Arabidopsis mitochondria. The Plant Journal. 2002; 32(6): 891-904.

23. Brooks SC, Herman JS, Hornberger G, Mills AL. Biodegradation of cobalt–citrate complexes: Implications for cobalt mobility in groundwater. Journal of contaminant hydrology. 1998; 32: 99-115.

24. Luo D, Zheng H, Chen Y, Wang G, et al. Transfer characteristics of cobalt from soil to crops in the suburban areas of Fujian Province, southeast China. Journal of environmental management. 2010; 91: 2248-2253.

25. Huang YF, Chen C, Kao C. Salicylic acid inhibits the biosynthesis of ethylene in detached rice leaves. Plant Growth Regulation. 1993; 12: 79-82.

26. Kim WT, Yang SF. Structure and expression of cDNAs encoding 1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase homologs isolated from excised mung bean hypocotyls. Acta Physiologiae Plantarum. 1994; 194: 223-229.

27. Mathooko MF, Tsunashima Y, Kubo Y, Inaba A. Expression of a 1-aminocyclopropane-1-carboxylate(ACC) oxidase gene in peach(Prunus persica L.) fruit in response to treatment with carbon dioxide and 1-methylcyclopropene: possible role of ethylene. African Jurnal of Biotechnology. 2004; 3: 497-502.

28. Rancelis V, Cesniene T, Kleizaite V, Zvingila D, et al. Influence of cobalt uptake by Vicia faba seeds on chlorophyll morphosis induction, SOD polymorphism, and DNA methylation. Environmental Toxicology. 2010; 27(1): 32-41.