بررسی تولید آرتیمزینین در گیاه، کشت کالوس و کشت سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی Artemisia aucheri Boiss

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

-

چکیده

هدف: آرتمیزینین مهمترین متابولیت جنس Artemisia  می باشد. به‏دلیل اهمیت آرتمیزینین در درمان مالاریا، تولید آرتمیزینین در درمنه کوهی، کشت کالوس و کشت سوسپانسیون سلولی گیاه بررسی شد. همچنین توانایی تبدیلات بیوشیمیایی در جهت تولید آرتمیزینین در کشت سوسپانسیون گیاه ارزیابی شد.
مواد و روش‏ها: با جمع آوری اندام هوایی گیاه و انتقال دانه رست‏ها به محیط کشت جامد موراشیگ و اسکوگ (MS) کالوس به‏دست آمد. کالوس های به محیط کشت مایع منتقل و سوسپانسیون سلولی حاصل شد. بررسی وجود آرتمیزینین در عصاره دی کلرومتانی اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه با روش TLC و GC انجام گرفت. کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون به‏عنوان پیش‏ساز آرتمیزینین به سوسپانسیون افزوده و تولید آرتمیزینین با GC بررسی شد.
نتایج‏: محیط حاوی )Kinetin5/0( D,-4-2( 5/0)، NAA( 1) و  محیط حاوی BA( 25/0) و NAA( 05/0) برای رشد کالوس مناسب بود. نور تاثیر مثبت بر رشد کالوس داشت.  بر اساس نتایج TLCو GC تولید آرتیمیزنین در گیاه اثبات نشد ولی کالوس و سوسپانسیون سلولی، گیاه آرتمیزینین تولید کردند اما افزودن کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون به سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی بر تولید بیشتر آرتمیزینین تاثیر نداشت. به‏نظر می‏رسد این ترکیبات پیش‏ساز مناسبی برای تولید آرتمیزینین در گیاه درمنه کوهی نیست.
نتیجه گیری: این مطالعه نشان داد که می‏توان با به‏کارگیری روش‏های نوین ترکیب ارزشمند آرتیمیزنین را در درمنه کوهی علی‏‏رغم عدم تولید آن در گیاه تهیه نمود.
 

کلیدواژه‌ها


مقدمه

امروز، در قرن بیست و یکم، مالاریا به‏عنوان یک بیماری قدیمی، همچنان سلامت مردم را در بسیاری از کشورهای جهان تهدید می‏کند. سالانه بیش از چند صد میلیون مورد ابتلا به مالاریا در جهان گزارش می‏شود که حدود یک میلیون نفر از آن‏ها جان خود را از دست می‏دهند (1).

آرتمیزینین و  مشتقات حاصل از  آن از  پرکاربردترین داروهای  ضد مالاریا  در  بازار  دارویی جهان محسوب می‏شوند که  اثر دهی سریع، ایمن و مناسب در برابرگونه‏های حساس و مقاوم به دارو دارند (2). آرتمیزینین، یک سزکوئی ترپن لاکتونی است که به‏طور طبیعی در گونه‏های مختلف جنس آرتمیزیا از جمله Artemisia annua L  یافت می شود (3). با این‏حال راندمان تولید این ترکیب به‏طور طبیعی پائین است (01/0 تا 5/0 درصد وزن خشک گیاه) و تولید این ماده در صنعت از لحاظ اقتصادی با نوع طبیعی آن رقابت ندارد (4). از این رو افزایش بازده تولید در گیاه و کشت سلولی حاصل از آن مورد توجه قرار گرفته است.

کشت بافت گیاهی که در  محیط‏های کشت مصنوعی و استریل شده صورت می‏گیرد سرشار از آنزیم‏های اختصاصی برای تولید متابولیت‏های گیاهی می‏باشد. همچنین امکان شناسایی مسیرهای بیوسنتز و ترکیبات  واسطه آن در  این محیط‏ها وجود دارد که زمینه  تولید بیشتر  متابولیت‏های گیاهی  را  فراهم می‏کند (5).

تولید آرتمیزینین، در کشت بافت گیاهی بارها مورد مطالعه قرار گرفته است و نتایج آن ارائه شده است. ایجاد شرایط مناسب در این کشت‏ها، زمینه تبدیل پیش‏سازهای طبیعی نظیر آرتمیزینیک اسید و  دی هیدروآرتمیزینیک اسید را فراهم کرده است. اثر عوامل متعدد، از قبیل تنظیم کننده‏های رشد، القاگرها و پیش سازها بر میزان آرتمیزینین تولیدی بررسی شده است. همچنین تلاش‏هایی در جهت بهتر کردن شرایط فیزیکی و شیمیایی نظیر نور، دما، pH ، غلظت نیترات و قند صورت گرفته است (6-12).

Artemisia aucheri Boiss (درمنه کوهی) گونه‏ای از جنس Artemisia است که به فراوانی در نقاط مختلف ایران پراکنده است (13). بر اساس مطالعات انجام گرفته، گیاه درمنه کوهی آرتمیزینین را تولید نمی‏کند اما ژن اصلی مسیر بیوسنتزآن درگیاه وجود دارد و احتمال فعال شدن آن در محیط کشت سلولی وجود دارد (14). این جنس بالغ بر450 گونه دارد که عدم تولید آرتمیزنین در اغلب گونه‏های گیاه نیز گزارش شده است (15 و 16). یکی از علل عدم تولید آرتمیزینین می‏تواند تولید نشدن ترکیبات واسطه در گیاه به‏علت عدم بیان آنزیم خاص درگیر در ایجاد حلقه سزکوئی ترپن و یا فعال نشدن آن باشد (17). کاهش تولید آرتمیزینین به‏علت عوامل فنوتیپی و ژنوتیپی حتی در خود گونه درمنه خزری گزارش شده است (18). با توجه به جایگاه درمانی آرتمیزینین در درمان مالاریا و فراوانی گیاه درمنه کوهی در ایران، در این مطالعه کشت کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه انجام شد. علاوه بر این تولید آرتمیزینین و توانایی تبدیلات بیوشیمیایی در آن مدنظر قرار گرفت.

 

مواد و روشها

تهیه نمونه گیاهی مورد تحقیق: گیاه درمنه کوهی (Artemisia aucheri Boiss) در تاریخ 17/3/1389 ازکیلومتر 60 جاده اصفهان- زفره در ارتفاع 1650 متر از سطح دریا توسط کارشناسان مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی و منابع طبیعی استان اصفهان تهیه شد. نمونه هرباریومی آن به شماره 1384 در هرباریوم گروه فارماکوگنوزی دانشکده داروسازی دانشگاه اصفهان نگه‏داری می شود.

کشت کالوس: بذر گیاه تحت شرایط آسپتیک در زیر کابین لامینار ایرفلو، ابتدا با اتانول 96 درجه به مدت 3 دقیقه و بعد با هیپوکلریت سدیم 1 درصد به مدت 9 دقیقه استریل شد. پس از 3 بار شستشو با آب مقطر استریل و به پتری دیش‏های استریل منتقل شد. پتری دیش‏های حاوی دانه‏های استریل در اتاق کشت در تاریکی و دمای 2±25 درجه سانتی‏گراد نگه داری شدند. برای تولید کالوس، محیط کشت موراشیگ و اسکوگ (MS) جامد با ترکیبی از اکسین و سیتوکینین به‏عنوان تنظیم کننده‏های رشد گیاهی به کار رفت. جدول 1 هفت تیمار مختلف به‏کار رفته در محیط‏های کشت را نشان می‏دهد که در 5 تکرار انجام گرفت. کالوس گیاه با انتقال دانه رست‏های رشد یافته به ظروف کشت جامد ایجاد شد. سپس نیمی از محیط‏های کشت در تاریکی 24 ساعت و بقیه در شرایط 16 ساعت نور  و 8 ساعت تاریکی در اتاق کشت نگه داری شد. واکشت کالوس با انتقال قطعه شاداب و تازه کالوس به محیط کشت تازه صورت گرفت (19). مطالعه آنالیز آرتیمیزنین برروی کالوس تیمار شماره 1 که بهترین رشد را داشت تا 7 نسل ادامه یافت و تولید آرتیمیزنین در سایر تیمارها مورد مطالعه قرار نگرفت.

 

جدول 1: تیمارهای مختلف تنظیم کننده های رشد مورد استفاده در کشت کالوس درمنه کوهی

شماره تیمار محیط کشت

1

2

3

4

5

6

7

2-4-D (mg/l)

5/0

0

0

0

0

1

0

a-NAA (mg/l)

1/0

5/0

05/0

05/0

0

0

0

Kinetin (mg/l)

5/0

5/0

0

0

0

2/0

0

BAP (mg/l)

0

0

5/0

25/0

5/0

0

0

2,4-D: 2,4-dichlorophenoxyacetic acid, NAA: Naphtaleneacetic acid,

BAP: Benzylaminopurine

 


کشت سوسپانسیون: کشت سوسپانسیون با انتقال قطعات شاداب کالوس تیمار شماره 1 به محیط کشت مایع مشابه محیط کشت کالوس ولی فاقد آگار انجام شد. این محیط‏ها در طول زمان کشت برروی تکان دهنده دوار100 دور در دقیقه، در اتاق کشت قرار داشت. واکشت سوسپانسیون با عبور سوسپانسیون حاصل از یک صافی استریل تحت شرایط استریل به محیط کشت تازه صورت گرفت.

بررسی حضور آرتمیزینین در کالوس و سوسپانسیون سلولی گیاه درمنه کوهی به روش TLC: برای انجام TLC از عصاره دی کلرومتانی اندام هوایی گیاه، کالوس‏های نسل هفتم و سوسپانسیون‏های نسل سوم به‏روش ماسراسیون با خیساندن پودر عصاره خشک کالوس و یا سلول‏های فیلتر شده سوسپانسیون که به نسبت 5 به 1 در حلال آلی به‏مدت 24 ساعت قرار گرفته بودند انجام شد. سلیکاژل 6OGF254 به‏عنوان فاز ثابت و سیستم حلال اتیل استات- پترولیوم اتر (6:4) به‏عنوان فــاز متحرک انتخــاب گردید (20). جهت آشکارســـازی مـــــواد مورد نظـــر، از معــرف وانیلین- اسید سولفوریک استفاده که برروی صفحه TLC اسپری شد(21). استاندارد آرتمیزینین به‏عنوان شاهد مورد استفاده قرار گرفت.

بررسی وجود آرتمیزینین در اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با دستگاه گاز کروماتوگرافی: گاز کروماتوگرافی با دستگاهPerkin-Elmer ، دارای دتکتور FID و ستون HP-5MS به طول 30 متر و قطر داخلی 3/0 میلی متر انجام شد. برنامه حرارتی ستون از دمای100 درجه سانتی‏گراد شروع و تا دمای 270 درجه سانتی‏گراد ادامه یافت و دما در هر دقیقه 20 درجه  افزایش یافت. دمای اتاقک تزریق و دمای ردیاب 270 درجه سانتی‏گراد بود. فراکسیون جدا شده از صفحه TLC به‏عنوان نمونه انتخاب و 2/0 میکرولیتر آن به دستگاه تزریق شد. زمان بین تزریق و ظهور پیک یعنی زمان بازداری (Rt) بررسی و با زمان بازداری نمونه استاندارد آرتمیزینین و با استفاده از بیزابولن به‏عنوان استاندارد داخلی مقایسه شد (22).

بررسی توانایی تبدیلات بیوشیمیایی سوسپانسیون گیاه درمنه کوهی: به‏منظور بهبود تولید آرتمیزینین، کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون که ساختار مشابه آرتمیزینین دارند به‏عنوان سوبسترای پیش‏ساز استفاده شدند. محلول استوک این مواد در اتانول 99 درصد آماده شد. کلسترول به میزان 100، بیزابولول 50 و آرتمیزیاکتون 120 به کار گرفته شد. با توجه به‏سرعت رشد سوسپانسیون، سوبسترا به سوسپانسیون‏های هفته سوم افزوده و به ازای هر سوبسترا سه ظرف سوسپانسیون در نظرگرفته شد. 6 روز بعد از افزودن سوبسترا، سوسپانسیون‏ها جمع آوری و خشک شدند و عصاره دی‏کلرومتانونی 25/0گرم آن بدست آمد. آنالیز تولید آرتمیزینین با تزریق 5/0 میکرولیتر از هر نمونه به دستگاه گازکروماتوگرافی صورت گرفت و سطح زیر پیک حاصل بررسی گردید. به‏منظور مقایسه تغییرات احتمالی با نمونه شاهد سلولی، به سه ظرف از سوسپانسیون هر کدام 5/0 میلی‏لیتر آب مقطر افزوده شد و 6 روز روی شیکر قرار گرفت. همچنین تست شاهد محیط کشت با افزودن هر یک از استانداردهای سوبسترا به طور مجزا به محیط‏های کشت فاقد سلول انجام شد (23).

 

نتایج

ایجاد کشت کالوس و کشت سوسپانسیون:

کشت کالوس در محیط‏های حاوی غلظت‏های مختلف تنظیم کننده‏های رشد نتایج متفاوتی داشت. نتایج به‏دست آمده در جدول 2 نمایش داده شده است. همچنین مشاهده شد که کالوس رشد یافته در شرایط 16 ساعت نور و 8 ساعت تاریکی سبز رنگ و شاداب بوده و رشد بهتری نسبت به کالوس نگه‏داری شده در تاریکی داشت. کالوس رشد یافته در شرایط 24 ساعت تاریکی، کرم رنگ بود. کشت سوسپانسیون یکنواخت و کرمی رنگ تهیه شد.


 

جدول 2: رشد و شادابی کالوس درمنه کوهی در تیمارهای مختلف تنظیم کننده‏های رشد

شماره تیمار محیط کشت

1

2

3

4

5

6

7

میزان رشد

++

+++

++++

++++

+

+

-

میزان شادابی

بسیار شاداب

نکروزه

شاداب

شاداب

کمی شاداب

نکروزه

-

+ رشد بسیار کند،         ++++ رشد تند، ++ رشد کند، - عدم رشد

 +++ رشد متوسط به طور تقریب هر مثبت بیانگر مساحتی معادل 2 سانتی‏متر مکعب است.


آنالیز عصاره اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با :TLC

همان‏طور که در شکل 1 نشان داده شده است در بررسی عصاره کالوس کشت شده در دو شرایط نوری متفاوت به روش TLC، 4 فراکسیون با Rf (2/0، 4/0، 52/0، 76/0) مشاهده شد‏. سوسپانسیون سلولی نیز 4 فراکسیون باR (23/0، 4/0، 52/0، 76/0) را نشان داد. استاندارد آرتمیزینین باندی با 52/0= Rf و رنگ بنفش ایجاد کرد که از لحاظ Rfو رنگ با یکی از فراکسیون‏های ایجاد شده از نمونه کالوس و سوسپانسیون مطابقت داشت ولی این باند در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت.

 

 

شکل 1: آنالیز TLC  سوسپانسیون(A) ، کالوس تاریکی(B) ، کالوس روشنایی(C) ،گیاه(D) ، استاندارد آرتمیزینین(E)

 


نتایج بررسی وجود آرتمیزینین در اندام هوایی گیاه، کالوس و سوسپانسیون سلولی با دستگاه گاز کروماتوگرافی:

همان‏طور که در شکل 2 نشان داده شده است با تزریق استاندارد آرتمیزینین به دستگاه گاز  کروماتوگرافی پیک با 6/5= Rt دقیقه در کروماتوگرام مربوطه حاصل شد. نمونه مربوط به کالوس و سوسپانسیون سلولی نیز هر کدام یک پیک به ترتیب با 6/5= Rt و 66/5= Rt دقیقه ایجاد کردند ولی این پیک در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت.

 


 

شکل 2: آنالیز GC  عصارها به ترتیب از راست به چپ: گیاه ، کالوس، سوسپانسیون، استاندارد آرتمیزینین

 

شکل 3 : آنالیزGC  عصارها حاصل از تبدیلات بیوشیمیایی به ترتیب از راست به چپ: آرتمیزیاکتون ، بیزابولول ، کلسترول ، شاهد (سوسپانسیون سلولی فاقد پیش ساز)


بررسی توانایی تبدیلات بیوشیمیایی:

همان‏طور که در شکل 3 نشان داده شده است با تزریق 5/0 میکرولیتر از عصاره نمونه شاهد سلولی به دستگاه پیک با     6/5= Rtو مساحت تقریبی 26/81 میلی‏متر مربع مشاهده شد که 53/0 درصد از مساحت کل پیک حاصل را شامل شد. نمونه حاوی کلسترول، آرتمیزیاکتون و بیزابولول هر کدام پیک مشابه به‏ترتیب به مساحت 30/79 میلی‏متر مربع (52/0 درصد مساحت کل پیک حاصل)، 14/21 میلی‏متر مربع (14/0 درصد مساحت کل پیک حاصل) و 7/75 میلی‏متر مربع (49/0 درصد مساحت کل پیک حاصل) ایجاد کردند. نمونه مربوط به بیزابولول پیک دیگری با 05/7= Rtدقیقه ایجاد کرد. با تزریق استاندارد بیزابولول پیک با 02/7= Rtدقیقه حاصل شد.

 

بحث

در بررسی کشت کالوس مشاهده شد کالوس‏های ایجاد شده در محیط‏های کشت متفاوت دارای خصوصیات ظاهری و رشد متفاوت هستند. بر اساس نتایج به‏دست آمده می‏توان به این نکته پی برد که نوع و نسبت هورمون‏های تنظیم کننده رشد در ایجاد کالوس و تمایز سلولی نقش بسزایی داشته است. نتایج مشابه نیز توسط Zia و همکارانش (24) در مورد گیاه Artemisia absinthium به‏دست آمده است. همچنین مشاهده شد کالوس کشت شده در شرایط نوری متفاوت، رنگ و سرعت رشد متفاوت داشته که حاکی از این است که نور به‏عنوان یک فاکتور فیزیکی در رشد کالوس و قدرت فتوسنتز آن اثر گذار بوده است.

در بررسی TLC حاصل از عصاره کالوس و سوسپانسیون درمنه کوهی، باندی با Rf و رنگ مشابه با استاندارد آرتمیزینین مشاهده شد و به‏نظر می‏رسد آرتمیزینین در کشت سلولی گیاه تولید شده است ولی این باند در عصاره اندام هوایی گیاه حضور نداشت. در مطالعات قبلی TLC  بارها برای شناسایی آرتمیزینین به‏کار گرفته شده است. Quispe-Condori و همکارانش (25) برای شناسایی آرتمیزینین در عصاره های مختلف درمنه خزری از متد  TLC استفاده کردند. Sarin و  Sing  (26) نیز در مطالعه خود بر روی کالوس Artemisia scoparia  با TLC به شناسایی آرتمیزینین پرداختند

همچنین مشاهده شد کالوس‏های کشت شده در شرایط نوری متفاوت باندهای مشابهی از لحاظ Rf و رنگ ایجاد کردند و به نظر می‏رسد نور نتوانسته است تاثیری بر نوع ترکیبات تولیدی در کالوس بگذارد، اما مقایسه TLC حاصل از کالوس با سوسپانسیون سلولی تفاوت‏هایی را نمایان کرد که بیانگر توان بیوشیمیایی متفاوت این محیط‏ها است.

با بررسی نتایج گازکروماتوگرافی، مشاهده شد که نمونه مربوط به کالوس و سوسپانسیون سلولی پیک با زمان بازداری ( Rt) مشابه استاندارد آرتمیزینین دارند و به‏نظر می‏رسد آرتمیزینین در این نمونه‏ها وجود دارد. Peng و همکارانش (27) نیز شناسایی و اندازه‏گیری آرتمیزینین و پیش‏سازهای آن را به‏طور مستقیم با دستگاه GC-FID انجام دادند و یک رابطه خطی بین غلظت‏های استاندارد آرتمیزینین و سطح طیف حاصل به‏دست آوردند.

علی رغم عدم تایید تولید آرتیمیزنین در گیاه درمنه کوهی بر اساس نتایج حاصل احتمال می‏رود مسیر تولید آرتمیزینین در کشت سلولی گیاه فعال شده و تنظیم کننده‏های رشد در فعال کردن این مسیر نقش داشته‏اند . در مطالعه‏‏ای نیز که بر گیاه Artemisia absinthium انجام شد افزودن NAA و BA به محیط MS باعث تولید آرتمیزینین و شناسایی آن در کالوس شد (28).

با توجه به عدم افزایش کمی آرتیمیزنین در تبدیلات بیوشیمیایی سوسپانسیون سلولی گیاه درمنه کوهی، به‏نظر می‏رسد کلسترول، بیزابولول و آرتمیزیاکتون پیش‏ساز مناسبی برای آرتمیزینین در کشت سلولی درمنه کوهی نیستند. در این مطالعه افزودن کلسترول نتوانست تولید آرتمیزینین را در کشت سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی تحت تاثیر قرار دهد در حالی‏که در مطالعه Baldi و Dixit (29) بر گیاه درمنه خزری افزودن کلسترول به سوسپانسیون سلولی بر رشد سلول‏ها و تولید آرتمیزینین اثرگذار بود. با مقایسه پیک حاصل از گازکروماتوگرافی نمونه حاوی بیزابولول و شاهد سلولی نیز تغییر قابل توجهی مشاهده نشد. بیزابولول یک سزکوئی ترپن الکلی است و با توجه به مسیرهای بیوشیمیایی گیاهی درمنه خزری انتظار می‏رفت بتواند به پیش‏سازهای اصلی آرتمیزینین تبدیل شود (30). کاهش تولید آرتیمیزنین با افزودن آرتمیزیاکتون به سوسپانسیون سلولی درمنه کوهی شاید به‏دلیل بلوک مسیر بیوسنتز آرتمیزینین شده باشد.

 

نتیجه گیری

درمجموع تولید آرتیمیزنین در کشت کالوس و سوسپانسون درمنه کوهی علی‏رغم عدم تولید آن در گیاه بیانگر توانمندی نهفته درمنه کوهی است که با فراهم نمودن شرایط مناسب امکان تولید آرتیمیزنین را که بیشتر در درمنه مازندرانی مطالعه شده است (31) فراهم نمود و با بهینه کردن شرایط کشت بافت و سلول از جمله افزودن پیش‏سازهای مناسب بتوان میزان تولید آرتمیزنین را افزایش داد.

 

تشکر و قدردانی

هزینه های این تحقیق توسط معاونت پژوهشی دانشگاه علوم پزشکی اصفهان تامین شده است که بدین‏وسیله قدردانی می‏شود. از مرکز تحقیقات جهاد کشاورزی استان اصفهان در تامین اندام هوایی درمنه کوهی نیز تشکر به‏عمل می‏آید.

1. Crawley J, MRCP, Nahlen B. Prevention and treatment of malaria in young African children. Semin Pediatr Infect Dis. 2004; 15(3): 169-180.

2. Ashley E, Mc Gready R, Proux S, Nosten F. Malaria, Travel Med Infect Dis. 2006; 4(3-4): 159-173.

3. Bhakuni RS, Jain DC, Sharma RP, Kumar S. Secondary metabolites of Artemisia annua and their biological activity. Curr Sci. 2001; 80(1): 35-4.

4. Evans WC. Trease and Evans Pharmacognosy, 14th Ed. London: WB Sunders Company Limited. 1996;  p. 428.

5. Asghari G. [Biotechnology of Medicinal Plant and Herbal Medicine Production], Isfahan: Jahad Danishgahi Publication. 1998; p. 217. persian

6. Zhao Y, Liu C. Biological Production of artemisinin for malaria therapy. Med Plant Biotechnol. 2007; 23(1): 529-540.

7. Abdin MZ, Israr M, Srivastava PS, Jain SK. In vitro production of artemisinin, a novel antimalarial compound from Artemisia annua. J  Medicinal & Aromatic Plant Sci. 2000; 22-23.

8. Chen PK, Lukonis C, Go L, Leather GR. Increasing artemisinin production through biotransformation of precursors. Proceedings of the Plant Growth Regulator Society of America. 1991; 2-8.

9. Geldfre E, Vergauwe A, Eeckhout E. State of the art of the production of the antimalarial compound artemisinin in plants. Plant Mo Biol. 1997; 33(2): 199-209.

10. Paniego N, Maligne AE, Giulietti AM. Artemisia annua (Quing-Hoa): in vitro culture and the production of artemisinin. Biotech Agricult  Forest. 1993; (24): 64-78.

11. Geoffrey BD, Lai-King S. In vivo transformations of dihydroartemisinic acid in Artemisia annua plants. Tetrahedron. 2004; 60(5): 1139-1159.

12. Chang YJ, Song SH, Park SH, Kim SU. Amorpha-4,11-diene synthase of Artemisia annua: cDNA isolation and bacterial expression of a terpene synthase involved in artemisinin biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 2000; 383(2): 178-84.

13. Ghahraman A. [Flora of Iran], Tehran. Institute of Forests and Rangelands Publication. 1996; 15:1762. persian.

14. Hosseini R, Yazdani N, Garoosi GA. The presence of amorpha-4, 11-diene synthase, a      key enzyme in artemisinin production in ten Artemisia species, Daru. 2011; 19(5): 332-338.

15. Van der Kooy F, Verpoorte R,  Marion Meyer JJ. Metabolomic quality control of claimed anti-malarial Artemisia afra herbal remedy and A. afra and A. annua plant extracts. South Afr J Botany. 2008; 74(2): 186-189.

16. Kundan SB , Anupam SH. Phytochemical and pharmacological potential of Artemisia absinthium Linn. and Artemisia asiatica Nakai , J Pharm Res. 2010, 3(2): 325-328.

17. Kim SH, Heo K, Chang YJ, Park SH, et al. Cyclization mechanism of amorpha-4,11-diene synthase, a key enzyme in artemisinin biosynthesis. J Nat Prod. 2006; 69(5): 758-762.

18. Delabays N, Simonnet X, Gaudin M. The genetics of artemisinin content in Artemisia annua L. and the breeding of high yielding cultivars. Curr Med Chem. 2001; 8(15): 1795-

1801.

19. Dehshahri SH, Afsharypuor S, Asghari G, Mohagheghzadeh A.  Determination of volatile glucosinolate degradation products in seed coat, stem and in vitro cultures of Moringa peregrina (Forssk.) Fiori. Ir J Pharmaceut Sci. 2012; 7(1): 51-56.

20. Xie D, Wang L, Ye  H, Li  G. Isolation and production of artemisinin and stigmasterol in hairy root culture of Artemisia annua. Plant cell Tissue Org Cult. 2000; 63: 161-166.

21. Wagner, H, Bladt, S. Plant drug analysis. Translated by scott A .2th Ed. Berline: Springer; 1996; 364.

22. Sipahimalani AT, Fulzele DP,  Heble MR.  Rapid method for the detection and determination of artemisinin by gas chromatography. J Chrom. 1991; 538: 452-455.

 

23. Roth RJ, Acton N. A simple conversion of artemisinic acid into artemisinin. J Nat Prod. 1989; 52: 1183- 1185.

24. Zia M, Rehman RU, Fayyaz M. Hormonal regulation for calogenesis and organogenesis of Artemisia absinthium L. Aft J Biotech. 2007; 6(16): 1874-1878.

25. Quispe- condori S, Sanchez D, Foglio MA, Rosa PT, et al. Global yield isotherms and kinetic of artemisinin extraction from Artemisia annua L. leaves using super critical carbon dioxide. J Super Crit Fluids. 2005; 36(1): 40-48.

26. Sing A, Sarin R. Artemisinin content in Artemisia Scoparia .Recent Res Sci Technol. 2010; 2(6): 47-50.

27. Peng CA, Ferriera JF, Wood AJ. Direct analysis of artemisinin from Artemisia annua  L using   high- performance liquid chromatography  with evaporative light Scattering  detector , and gas chromatography with flame ionization detector. J Chormatogr A. 2006; 1136: 254-258.

28. Zia M, Mannan A, Chaudhary MF. Effect of growth regulators and amino acids on artemisinin production in the callus of Artemisia absinthium. Pak J Bot. 2007; 39(2): 799-805.

29. Baldi A, Dixit VK. Yield enhancement strategies for artemisinin production by suspension cultures of Artemisia annua. Bioresour Technol. 2008; 99(11): 4609-4614.

30. D'Andrea S, Caramiello R, Ghignone S, Siniscalco C. Systematic studies on some species of the genus Artemisia: Biomolecular analysis. Plant Biosystems. 2003;137(2): 121-130.

31. Yazdani N, Hosseini R, Garousi GA. Does any Artemisia species other than A. annua have potential to produce artemisinin?, OAJMAP. 2010; 1(2): 40-43.