اثرآنتی‌اکسیدانتی عصاره دانه‌ی خرنوب بر فراسنجه‌های کیفی اسپرم قوچ فراهانی بعد از انجماد و یخ‏‏گشایی

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه اراک، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، اراک، ایران

2 دانشگاه محقق اردبیلی، دانشکده کشاورزی و منابع طبیعی، گروه علوم دامی، اردبیل ، ایران

چکیده

هدف: هدف از این پژوهش بررسی تاثیرعصاره­ی دانه­ی خرنوب به‏عنوان آنتی­اکسیدانت طبیعی بر کیفیت اسپرم قوچ نژاد فراهانی پس از یخ­‏گشایی بود.
مواد و روش‏ها: در این تحقیق از پنج راس قوچ نژاد فراهانی (وزن: 5±60 کیلوگرم)، دو بار در هفته توسط واژن مصنوعی اسپرم­گیری شد. به‏منظور از بین بردن اثرات فردی دام­ها انزال آن­ها به‏نسبت مساوی باهم مخلوط شدند. سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب (صفر، 05/0، 1/0، 15/0 و 2/0 میلی­لیتر) به رقیق کننده بر پایه زرده تخم­مرغ-تریس افزوده شد. نمونه­ها بعد از طی مراحل سرد سازی و پر شدن در پایوت‏ها، در بخار ازت منجمد شده و تا زمان ارزیابی در ازت مایع نگه‏داری شدند. پس از یخ‏گشایی و 5 دقیقه انکوباسیون در دمای 37 درجه سانتیگراد فراسنجه­های کیفی اسپرم نظیر جنبایی، جنبایی پیش‌رونده، زنده­مانی (تست ائوزین- نگروزین)، سلامت‌ غشا (تست ‌هاست) و همچنین ریخت­شناسی اسپرم­ها (تست هانکوک) مورد بررسی قرار گرفتند.
نتایج: نتایج نشان داد که سطح 05/0 میلی­لیتر ازعصاره­ی دانه­ی خرنوب به‏طورمعنی­داری سبب بهبودی فراسنجه­های اسپرم همچون تحرک، زنده­مانی، یک‏پارچگی غشای پلاسمایی و ریخت­شناسی درمقایسه با گروه شاهد شد (01/0P<).
نتیجه‏گیری: نتایج نشان داد که افزودن 05/0 میلی­لیتر از عصاره­ی دانه­ی خرنوب به رقیق­کننده بر پایه‌ی تریس- زرده­ی تخم­‌مرغ برای فریز و یخ‌گشایی اسپرم در قوچ نژاد فراهانی احتمالا می­تواند مفید باشد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 انجماد منی پستانداران تحولی اساسی در نگه‏داری منی و حفاظت از انجماد سلول اسپرم، راهی برای حفظ ژرم­ پلاسم بوده که می­تواند با حفظ DNA گونه­ها، در دامپروری، آبزی پروری و حفظ تنوع زیستی کاربرد داشته باشد (1). درطول فرآیند انجماد- یخ­گشایی منی، تنش‏های فیزیکی و شیمیایی در غشای اسپرم به‏وجود آمده و موجب کاهش کیفیت، زنده­مانی، تحرک و قدرت باروری اسپرم­ها می­شود، این آسیب­ها با‌‌ تولید بیش ازحد رادیکال­های آزاد به‏ویژه گونه­های اکسیژن فعال (ROS) و پراکسیداسیون فسفولیپیدهای غشای سلول اسپرم، همراه است (2). استرس اکسیداتیو ناشی از عدم تعادل بین تولید ROS و سیستم بیولوژیکی کنترل­کننده رادیکال­های آزاد است که در طول فرآیند انجماد، موجب تخریب دیواره غشا و کل ترکیبات ساختمانی اسپرم می­شود (2). سلول اسپرم دارای مکانیسم آنتی‏اکسیدانتی آنزیمی و غیرآنزیمی است اما در فرآیند رقیق­سازی نسبت آنتی­‌اکسیدانت­های داخلی کاهش یافته و برای فرآوری اسپرم نیاز به افزودن آنتی­‌اکسیدانت‏هایی با منشا خارجی می­باشد (3). آنتی­‌اکسیدانت­ها خاصیت آنتی­‌اکسیدانتی گیاهان به‏طورعمده به ترکیبات فنولیک، فلاوونوئیدها، اسیدهای فنولیکودی‌­ترپن­های فنولیک مربوط می­شود (4).

خرنوب درختی از خانواده حبوبات و با نام علمی Ceratonia siliqua L است. این گیاه درختچه یا درختی همیشه سبز، اغلب یک پایه با برگ­های شانه­ای منفرد و گل آذین خوشه­های انبوه پر­گل می­‌باشد (5). با مطالعه فعالیت آنتی­اکسیدانتی عصاره متانولی دانه­ی خرنوب متوجه شدند دانه­ی این گیاه منبع غنی از آنتی‏اکسیدانت‏های طبیعی است (6). مطالعات نشان داده­اند که دانه­ی خرنوب دارای ترکیباتی مانند توکوفرول، استرول­های گیاهی و آنتی­اکسیدانتی­های فراوان است و می­تواند با اثرات مخرب رادیکال­های آزاد تولید شد هم قابله نموده و استرس اکسیداتیو درون سلولی را به‏حداقل برساند (7). مطالعات برروی محتویات شیمیایی دانه­ی خرنوب نشان می‌­دهد که حاوی مقدار زیادی ازالیاف، ترکیبات پلی‌فنولیک، اسید آراشیدونیک، لیگنین، چربی، پروتئین، کربوهیدرات، کلسیم، پتاسیم و فسفر است (8). حضور ویتامین E در دانه خرنوب اثبات شده است (9). یکی از مهم­ترین خواص شیمیایی ویتامین E حساسیت بالای آن به اکسیدانت است و از آن به‏عنوان آنتی‌اکسیدانت در صنعت داروسازی استفاده می­شود (01). همچنین دانه­ی خرنوب به‏عنوان یک منبع بالقوه آنتی­اکسیدانت­های طبیعی در نظر گرفته می­شود (6).  فعالیت آنتی­‌اکسیدانتی خرنوب مربوط به ترکیبات فنلی است (11). مطالعات نشان داد که ترکیبات فنلی از پودر خرنوب شامل: پروتوکاتکویک، پیروگالول، کومارین، سینامیک، فرولیک، اسیدگالیک، وانیلیک، کاتکول،کلروژنیک، اسیدکافئیک و کاتچین است (21). جوشانده خرنوب افزایش‌­دهنده‌ تعداد و کیفیت اسپرم متحرک و علیه ناتوانی جنسی در مردان ذکر شده است (31). تحقیقات نشان می­‌دهد‌که از‌ عصاره‌­ی هیدروالکلی دانه­ی خرنوب به‏صورت خوراکی در موش استفاده شده است و اثر آن بر هورمون­های بیضه و اسپرماتوژنز مورد بررسی قرارگرفته که باعث افزایش غلظت تستوسترون شده است (41). تاکنون گزارشی در رابطه با تاثیر آنتی­اکسیدانتی عصاره دانه­ی خرنوب بر فراسنجه­‌های بعد از یخ­گشایی اسپرم صورت نگرفته است.

هدف از انجام این آزمایش بررسی تاثیر سطوح مختلف عصاره دانه­ی خرنوب به‏عنوان آنتی­‌اکسیدانت طبیعی ‌بر فراسنجه­های کیفیت اسپرم قوچ بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی است.

 

مواد و روش‌ها

­­روش پژوهش از نوع تجربی بود. این تحقیق در مزرعه­ی دانشگاه اراک با مشخصات جغرافیایی 341864760 (عرض جغرافیایی)، 496426590 (طول ‌جغرافیایی) و 168722 (ارتفاع‌ جغرافیایی) انجام گرفته، در این آزمایش از تعداد 5 راس قوچ نژاد فراهانی (با میانگین سنی 5/0±3 سال و وزن 5±60 کیلوگرم)، استفاده شد. قوچ­ها آموزش یک ماه جهت اسپرم­گیری با مهبل مصنوعی آموزش دیدند. بر اساس جدول کمیته ملی تحقیقات آمریکا (15) در دو وعده صبح و شب، جیره­ی غذایی به‏صورت دستی در اختیار دام­ها قرار گرفت.

جهت تحریک قوچ­های نر برای پرش و انزال مطلوب، از یک رأس میش فحل استفاده شد. انزال­هایی که معیارها و شرایط ذیل را داشتند، برای انجام آزمایش انتخاب شدند: حجم 2-5/0 میلی­لیتر، غلظت بیشتر از 109× 3 اسپرم در میلی­لیتر، تحرک بالای80 درصد و کمتر از 10 درصد اسپرم ناهنجار بلافاصله بعد از جمع­آوری و ارزیابی اولیه منی، انزال­های جمع­آوری شده همه با هم به‏دلیل جلوگیری از اثرات و پراکنش فردی قوچ­ها مخلوط شده و برای آزمایش­ها استفاده شد. بعد از تهیه­ی میوه‏های خرنوب نیام­ها را شکسته، دانه­ها را جدا و آسیاب کرده تا پودر نرمی حاصل شود یک کیلوگرم از پودر حاصله را به نسبت 50/50 با الکل اتانول 96 درصد و آب به‏مدت 72 ساعت خیسانده و آن را در دستگاه سانتریفیوژ با سرعت4500 دور در دقیقه به‏مدت 8 دقیقه قرار داده تا ذرات معلق در آن جدا شوند. بعد از سانتریفیوژ مایع به‏دست آمده در آون40 درجه سانتیگراد قرارداده شد تا آب و الکل آن تبخیر شد و یک شیره قهوه­ای غلیظ باقی بماند. در مرحله بعد، مقادیر مورد نظر از عصاره در آب مقطر حل شد تا غلظت­های مختلف به‏دست آید.

در این تحقیق از رقیق­کننده یک مرحله­ای منی قوچ که حاوی 634/3 گرم تریس (هیدروکسی متیل) آمینومتان، 5/0 گرم فروکتوز، 99/1 گرم اسید سیتریک، 15 میلی­لیتر زرده تخم مرغ، 5 میلی­لیتر گلیسرول، 100000 هزار واحد بین­المللی پنیسیلین، 001 میلی­گرم استرپتومایسین و آب مقطر برای رساندن حجم رقیق کننده به 001 میلی­لیتر و با pH=7 و اسمولاریته 320/0 میلی­اسمول، به‏عنوان رقیق کننده پایه منی استفاده شد (16).

تیمار‌ها شامل :شاهد: رقیق کننده­ی پایه تریس، تیمار1: رقیق کننده­ی تریس حاوی 05/0 میلی­لیتر عصاره دانه­ی خرنوب، تیمار2: رقیق کننده­ی تریس حاوی 1/0 میلی­لیتر عصاره دانه­ی خرنوب، تیمار3: رقیق کننده‏ی تریس حاوی 15/0 میلی­لیتر عصاره دانه­ی خرنوب، تیمار4: رقیق کننده­ی تریس حاوی 2/0 میلی‏لیتر عصاره دانه­ی خرنوب، که میزان عصاره­ها با سرنگ انسولین به رقیق کننده­ها اضافه شد.

برای انجماد، ابتدا نمونه­های آزمایشی در پایوت­های 5/0میلی­لیتری بسته­بندی شده و به‏مدت 2 ساعت در دمای 5 درجه­ی سانتی­گراد قرار گرفتند و پس از طی دوره­ی تعادل، پایوت­ها در فاصله­ی 5 سانتی‏متری به‏مدت 10 دقیقه در معرض بخار ازت مایع منجمد و سپس در ازت مایع غوطه­ور شده و برای نگه‏داری به تانک ازت، منتقل شدند (17).

برای ذوب منی، پس از خارج کردن پایوت­های حاوی منی از ازت، پایوت­ها، به‏مدت30 ثانیه در داخل آب‏گرم 37 درجه­ی سانتی­گراد قرارداده شد و سپس پایوت­ها به داخل لوله­های اپندورف تخلیه شدند. پایوت­ها بعد از یخ­گشایی با دستمال کاغذی خشک و سپس انتهایی را که با پلی­وینیل ­الکل مسدود بود، با قیچی بریده و منی بر اساس تیمار­های مشخص شده درون میکروتیوپ­های 5/1 میلی­لیتری خالی شدند. جهت تطابق­پذیری و بازگشت آب درون سلولی به‏مدت 15-10 دقیقه در حمام آب گرم با دمای 37 درجه سانتیگراد ماندند و برای ارزیابی نمونه­ها 5 میکرولیتر از آن­ها برداشته و بقیه درون انکوباتور37 درجه سلسیوس قرار داده شدند تا فراسنجه­های تحرک پیش­رونده، زنده­مانی، سلامت غشا پلاسمایی و سلامت آکروزوم اسپرم ارزیابی قرار بگیرند.

برای بررسی جنبایی اسپرم 3 پایوت از هر گروه تیماری ذوب شده و به داخل لوله‏های اپندورف انتقال داده شدند، سپس با استفاده از سمپلر و با برداشتن 10 میکرولیتر از منی روی لام و گذاشتن یک لامل تمیز روی آن، لام موردنظر با استفاده از سیستم آنالیز اسپرم کامپیوتری یا  CASA(Computer-Aided Sperm Analysis) بررسی شد. پس از بررسی نمونههای اسپرم به‏وسیله­ی نرم­افزار CASA در این آزمایش فراسنجه‏های ارزیابی تحرک مانند درصد کل اسپرم­های متحرک  و درصد اسپرم‏های پیش‏رونده محاسبه شد (81).

برای ارزیابی یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم از تست محلول هایپو­اسمتیک یا  HOST(hypo-osmotic swelling test) (فروکتوز 9 گرم، سدیم سیترات 49 گرم، PH 2/7 در 100 میلی­لیتر آب دو بار تقطیر) استفاده شد (19 و 20). برای این منظور 10 میکرولیتر از منی به 100 میکرولیتر از محیط هایپواسموتیک اضافه شد. سپس 30 دقیقه در دمای 37 درجه­ی سلسیوس انکوبه شد. پس از انکوباسیون نمونه با ملایمت مخلوط شده و یک قطره از نمونه­ی انکوبه شده را روی لامی که قبلا در دمای 37 درجه سانتیگراد گرم شده قرار داده و سپس آن را با لامل پوشانده، ارزیابی و شمارش اسپرم با استفاده از میکروسکوپ نوری فازکنتراست و با بزرگنمایی004 صورت گرفت. در هر لام حداقل 002 اسپرم شمارش و درصد اسپرم­های با دم گره خورده (غشای سالم) نسبت به گره نخورده (غشای آسیب دیده) محاسبه شد.

برای ارزیابی اسپرم با ریخت­شناسی غیرطبیعی حداقل 3 قطره از هر نمونه به میکروتیوب­های حاوی 1 میلیلیتر محلول‏ هانکوک که شامل فرمالین 73 درصد (5/26 میلی­لیتر)، محلول سالین (051 میلی­لیتر)، محلول بافر فسفات (051 میلی­لیتر) و آب دوبار تقطیر (005 میلی­لیتر) می‏باشد، افزوده شد و سپس یک قطره از این محلول روی لام قرار گرفت و توسط یک لامل پوشانده شد و با شمارش حداقل002 اسپرماتوزوا زیر میکروسکوپ فازکنتراست با بزرگنمایی 004، درصد اسپرم­های با ریختشناسی غیرطبیعی (آکروزوم غیرطبیعی، سر جدا شده، نقص­های دم و میانه اسپرم) به کل اسپرم شمارش شده، محاسبه شد (21).  برای ارزیابی زنده­مانی از رنگ­آمیزی ائوزین- نیگروزین استفاده شد. 02 میکرولیتر از رنگ آماده شده ائوزین- نیگروزین برداشته و روی نمونه ریخته و با سرسمپلر به‏آرامی نمونه را هم­زده تا اسپرم با رنگ مخلوط شود. پس از 03 ثانیه 02 میکرولیتر از نمونه را برداشته و بر گوشه­ی لام دیگری گذاشته و با یک لام دیگر بر روی لام به‏آرامی گسترش تهیه شد. پس از خشک شدن لام را زیر میکروسکوپ با بزرگنمایی 004 قرار داده و برای شمارش اسپرم­ها از بخش­های مختلف آن عکس گرفته شد. از هر نمونه 002 اسپرم شمارش شد و درصد اسپرم­های رنگی (مرده) و رنگ نشده (زنده) محاسبه شد (22).

در تجزیه و تحلیل این آزمایش از نرم افزار SAS استفاده شد و از طرح کاملا تصادفی با تکرار متعادل (پنج تیمار و پنج تکرار) برای محاسبه­ی اثر تیمارها روی واحدهای آزمایشی استفاده شد.

 

نتایج

نتایج آنالیز آماری تحقیق مربوط به تحرک پیشرونده اسپرم همان­گونه که در جدول1 نشان داده شده است سطح 05/0 میلیلیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 61 درصد تحرک پیشرونده باعث ایجاد اختلاف معنی‏داری در میزان تحرک پیشرونده اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی با سایر سطوح و گروه شاهد شد (10/0<P). سطح 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 8/54 درصد تحرک پیشرونده دارای اختلاف معنی­داری با سطوح 51/0 و 2/0 میلی­لیتر و گروه شاهد بود (10/0<P). لازم به‏ذکر است که اختلاف معنی­داری بین سطوح 51/0 و 2/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب و گروه شاهد در تحرک پیشرونده اسپرم مشاهده نشد.

 

جدول 1: تاثیر سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب بر تحرک پیشرونده اسپرم (درصد)

P-value

SEM

تیمار4 (2/0)

تیمار3 (15/0)

تیمار2 (1/0)

تیمار1 (05/0)

شاهد

01/0>

71/1

c49

c51

b8/54

a61

c49

تفاوت در حروف لاتین در جدول نشان از اختلاف معنی­داری می­باشد

همان­گونه که در جدول 2 نشان داده شده است سطح 05/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 2/67 درصد تحرک کل باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان تحرک کل اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-یخ‏گشایی با سایر سطوح و گروه شاهد شد (01/0P<). سطح 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 6/62 درصد تحرک کل دارای اختلاف معنی­داری با سطوح 15/0 و 2/0 میلی­لیتر و گروه شاهد بود (01/0P<). لازم به‏ذکر است که اختلاف معنی­داری بین سطوح 15/0 و 2/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب و گروه شاهد در تحرک کل اسپرم مشاهده نشد.

 

جدول 2: تاثیر سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب بر تحرک کل اسپرم (درصد)

P-value

SEM

تیمار4 (2/0)

تیمار3 (15/0)

تیمار2 (1/0)

تیمار1 (05/0)

شاهد

01/0>

34/1

c5/57

c3/58

b6/62

a2/67

c57

تفاوت در حروف لاتین در جدول نشان از اختلاف معنی­داری می­باشد

 

نتایج مربوط به زنده­مانی اسپرم (جدول 3) نشان داد که سطح 05/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان زنده­مانی اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی شد (01/0P<). سطح 05/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 6/60 درصد زنده­مانی دارای اختلاف معنی­داری با سایر سطوح و گروه شاهد بود (01/0P<). و اختلاف معنی‏داری بین سطوح 1/0 و 15/0 و 2/0 میلی‏لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب و گروه شاهد مشاهده نشد.

 

جدول 3: تأثیر سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب بر زنده­مانی اسپرم (درصد)

P-value

SEM

تیمار4 (2/0)

تیمار3 (15/0)

تیمار2 (1/0)

تیمار1 (05/0)

شاهد

01/0>

55/3

b6/54

b9/54

b8/55

a6/60

b8/52

تفاوت در حروف لاتین در جدول نشان از اختلاف معنی­داری می­باشد

 

نتایج یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم (جدول 4) نشان داد که سطح 05/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 5/67 درصد یک‏پارچگی غشای پلاسمایی باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی با سایر سطوح و گروه شاهد شد (01/0P<). سطح 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 4/62 درصد یک‏پارچگی غشای پلاسمایی دارای اختلاف معنی­داری با سطوح 15/0 و 2/0 میلی­لیتر و گروه شاهد بود (01/0P<). و اختلاف معنی­داری بین سطوح 15/0 و 2/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب در میزان یک‏پارچگی غشای پلاسمایی مشاهده نشد، اما بین این سطوح و گروه شاهد در میزان یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم­ها اختلاف معنی­داری مشاهده شد (01/0P<).

 

جدول 4: تاثیر سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب بر یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم (درصد)

P-value

SEM

تیمار4 (2/0)

تیمار3 (15/0)

تیمار2 (1/0)

تیمار1 (05/0)

شاهد

01/0>

81/2

c3/55

c6/58

b4/62

a5/67

d8/44

تفاوت در حروف لاتین در جدول نشان از اختلاف معنی­داری می­باشد

نتایج مربوط به ریخت شناسی اسپرم (جدول 5) نشان داد که سطح 05/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 9/19 درصد باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی نسبت به سایر سطوح و گروه شاهد شد (01/0P<). سطح 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 2/23 درصد باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی نسبت به سایر سطوح و گروه شاهد شد (01/0P<). سطح 15/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 25 درصد باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی نسبت به سطح 2/0 و گروه شاهد شد (01/0P<). سطح 2/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب با میزان 5/27 درصد باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی نسبت به گروه شاهد شد (01/0P<).

 

جدول 5: تاثیر سطوح مختلف عصاره­ی دانه­ی خرنوب برناهنجاری­های ریخت شناسی اسپرم (درصد)

P-value

SEM

تیمار4 (2/0)

تیمار3 (15/0)

تیمار2 (1/0)

تیمار1 (05/0)

شاهد

01/0>

23/1

b5/27

c25

d2/23

e9/19

a4/29

تفاوت در حروف لاتین در جدول نشان از اختلاف معنی­داری می­باشد

 

بحث

امروزه، حفظ انجمادی منی کاربردهای بیوتکنولوژیکی بسیاری دارد، ازآن‏جمله که می­تواند برای درمان مشکلات کم­باروری انسان، بیماری­های تهدیدکننده حیات،حفظ منی و DNA گونه­های در خطر انقراض و حفظ تنوع زیستی مورد استفاده قرار گیرد. مطالعه­ی مشابهی در زمینه­ی تاثیر عصاره­ی دانه­ی خرنوب بر عملکرد اسپرم قوچ وجود ندارد که ما بتوانیم با نتایج این آزمایش مقایسه کنیم ولی در مورد اثر آنتی‏اکسیدانتی گیاهان دیگر بر اسپرم تحقیقاتی صورت گرفته است. عصاره­ی بسیاری از گیاهان حاوی ترکیبات بیواکتیو از جمله فنولیک­ها و فلاونوئیدها هستند که خاصیت آنتی­اکسیدانتی موثری را نشان داده­اند و از آسیب رادیکال­های آزاد ممانعت می­کنند. اخیرا مشخص شد که افزودن عصاره‏ی آبی گیاه رزماری تاثیر بالقوه­ای روی فراسنجه­های تحرک و درصد زنده­مانی اسپرم خوک داشته و غلظت مالون‏دی‏آلدئید تولیدی که از عوامل اکسیداسیونی مخرب به‏شمار می­رود، را به‏طور معنی­داری کاهش داد (23) که با نتایج مطالعه حاضر مشابهت داشته است احتمالا در پژوهش حاضر نیز عصاره­ی دانه­ی خرنوب با خاصیت آنتی­اکسیدانتی خود توانسته است بر اکسیدان­های حاضر در محیط انجماد-یخ­گشایی غلبه نماید و تعادل به‏سمت افرایش توان آنتی­اکسیدانتی و کاهش اکسیداسیون اسپرم شود. استفاده از عصاره­ی آبی رادیو لاساکرا (Rhodiola sacra) را به منی خوک توانست فراسنجه­های کیفی منی را بعد از فرآیند انجماد در وضعیت بهتری نگه‏داشته و یک فعالیت قوی پاکسازی رادیکال آنیون سوپراکسید را از خود نشان دهد (4). که با نتایج پژوهش حاضر شباهت دارد شاید فلاونووئیدهای موجود در عصاره خرنوب در حذف عوامل اکسیداسیون کننده نقش موثری دارد. اثرآنتی‏اکسیدانتی آب انار بر فراسنجه­های اسپرم و پتانسیل باروری موش­ها بررسی شده و نشان داد که مصرف خوراکی آب انار در بهبود فراسنجه­های اسپرم موثر بوده و مصرف آب انار باعث کاهش معنی­داری درصد اسپرم­های غیرپیشرونده و غیرطبیعی شد (24). نتایج نشان داد که عصاره­ی جوانه­ی گل میخک دارای قدرت آنتی­اکسیدانتی است و اثر مطلوبی بر اسپرم قوچ در مرحله­ی سردسازی و پس از انجماد داشت (25). و همچنین عصاره­ی چای سبز می­تواند کیفیت اسپرم قوچ را پس از انجماد بهبود بخشد (26)، که با نتایج این مطالعه مشابه بود که احتمالا می­تواند به‏دلیل داشتن مواد بیواکتیو مشابه این گیاهان باشد. افزودن عصاره­ی مرزنجوش به رقیق­کننده منی باعث بهبود اکثر فراسنجه­های تحرکی اسپرم قوچ قزل بعد از یخ­گشایی شد (27). نتایج ارزیابی نشان داد که افزودن سطح 2 و 4 میلی­لیتر در دسی­لیتر عصاره­ی مریم گلی سهندی باعث بهبود معنی­دارکلیه صفات تحرک و افزودن 4 میلی­لیتر در دسی­لیتر عصاره این گیاه باعث بهبود معنی‏دار صفات زنده­مانی و یک‏پارچگی غشایی اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-یخ‏گشایی نسبت به گروه شاهد و سایر گروه­های تیماری شد (27). نتایج مطالعات بالا تقریبا با نتایج مطالعه­ی حاضر شباهت داشت که احتمالا به‏دلیل ترکیبات فعال و فلاونوئیدها خاصیت آنتی­اکسیدانتی موثری را نشان داده­اند و از آسیب رادیکال­های آزاد ممانعت و باعث بهبود کیفیت اسپرم بعد از فرآیند انجماد-یخ­گشایی شده­اند. بامطالعه فعالیت آنتیاکسیدانتی عصاره متانولی دانه خرنوب متوجه شدند دانه­ی این گیاه منبع غنی از آنتی­اکسیدانت‏های طبیعی است (6). عصاره رازیانه با خاصیت آنتی‌اکسیدانتی خود سبب بهبود فراسنجه­های حرکتی اسپرم قوچ شد که با تحقیق حاضر شباهت دارد (82)

لسیتین سویا به‏عنوان یک منبع گیاهی موجب بهبود کیفیت مایع منی شد (29). مطالعات نشان داده‏اند که دانه­ی خرنوب دارای ترکیباتی مانند توکوفرول، استرول­های گیاهی و آنتی­اکسیدانتی­های فراوان است و می‏تواند با اثرات مخرب رادیکال­های آزاد تولید شده مقابله نموده و استرس‏اکسیداتیو درون سلولی را به‏حداقل برساند (7). حضور ویتامین E در دانه­ی خرنوب اثبات شده است (9). یکی از مهم‏ترین خواص شیمیایی ویتامین E حساسیت بالای آن به اکسیدانت است و از آن به عنوان آنتی­‌اکسیدانت در صنعت داروسازی استفاده می‌شود (10). ویتامین E به‏عنوان مهم­ترین آنتی­اکسیدانت غشایی در داخل بدن مطرح می­باشد و ضمن تقویت سیستم ایمنی بدن، ازبیماری­های عروق کرونری بدن جلوگیری می­کند. ازمهم‏ترین اثرات این ویتامین می­توان در محافظت غشای سلول­ها درمقابل آسیب­های ناشی از رادیکال­های آزاد و جلوگیری از پروسه­های التهابی به‏وسیله تنظیم سیگنال­های سلولی جهت کنترل و تحریک سیستم ایمنی نام برد (30). ویتامین E مهم­ترین ماده­ی ضداکسایشی زنجیره­شکن محلول در چربی در بدن است که در قالب مجموعه­ای از ملکول­ها در بخش آبگریز غشاهای زیستی فعالیت آنتی­اکسیدانتی دارد و می­تواند رادیکال‏های پراکسیل‏اسیدهای چرب را به هیدروپراکسیدهای کم‏خطرتری تبدیل کند و واکنش­های زنجیره‏ای پراکسیداسیون را کاهش دهد (31). ویتامین E به‏­ویژه باعث محافظت فسفولیپیدهای غشاهای زیستی و لیپوپروتئین­های پلاسما می­شود (32). ویتامین E یک آنتی­اکسیدانت قوی است (33)،که نقش حمایتی آن در کیفیت و کمیت اسپرم، لقاح و باروری در انسان­ها گزارش شده است (34). و به‏مقدار زیاد در سلول­های سرتولی، اسپرماتوسیت در مرحله (پاکیتن) و به‏مقدار کمتر در اسپرماتیدهای گرد وجود دارد (35). ویتامین E با خاصیت ضدآلکیله کنندگی خود، از آسیب اسیدهای چرب غیراشباع بافت­ها دربرابر رادیکال­های آزاد و پراکسیداسیون ممانعت کرده و باعث پایداری غشا سلول­ها می­شود (36). آلفاتوکوفرول فراوان­ترین و فعال‏ترین عضو خانواده ویتامین E و یک آنتی­اکسیدانت غیرآنزیمی قوی شکننده زنجیر بوده که از پیشروی واکنش­های رادیکال­های آزاد اکسیژن جلوگیری می­کند (37). نتایج نشان دادند که آلفاتوکوفرول فراسنجه‏های کیفی اسپرم گراز نظیر تحرک آن‏را به‏طور معنی­داری افزایش می­دهد و از واکنش­های اکسیداتیو ناشی از حفاظت انجمادی اسپرم جلوگیری می­کند (38). نتایج دیگر نیز نشان داد که آلفاتوکوفرول باعث تحرک و افزایش زنده­مانی اسپرم می­شود، همچنین اثرات این ماده نسبت به غلظت آن متفاوت است به‏طوری‏که غلظت بالای آلفاتوکوفرول اثرات اکسیداتیو ولی غلظت­های پایین آن اثرات آنتی­اکسیداتیو دارد (39). اهمیت ویتامین E مربوط به توانایی آن در حمایت از ارگانیسم­ها در برابر حمله رادیکال­های آزاد می‏باشد. واثرات حمایتی ویتامین E و گیاه زنجبیل بر سمیت القا شده توسط سیکلوفسفامید در دستگاه تولید­مثل موش­های نر، پیش ازشروع دوره شیمی درمانی را گزارش کردند (40). تحقیقات نشان داده­اند که افزودن ویتامین E به رقیق کننده اسپرم منجر به بهبود خصوصیات ریخت شناسی منی و نهایت افزایش باروری طیور می­شد (41 و 42). حفاظت انجمادی اسپرم در مدل­های حیوانی و اسپرم انسانی مطالعاتی انجام گرفته است که بیان‏گر اثر وابسته به دوز ویتامین E در بهبود تحرک و حیات اسپرم از طریق مهار لیپیدپراکسیداسیون غشای پلاسمایی اسپرم می­باشد (30). تجویز خوراکی ویتامینE درترکیب با دیگر آنتی­اکسیدانت‏ها نیز توانسته است میزان آسیب را در بیماران نابارور کاهش و باعث افزایش تحرک و بهبود ریخت شناسی اسپرم افراد آستنوتراتوزواسپرمی ‏شود (43). استفاده از ویتامین E در قوچ موجب بهبود خصوصیات اسپرم ازجمله تحرک و زنده­مانی شد (44). استفاده از ویتامین E باعث افزایش معنی‏دار تحرک و زنده­مانی اسپرم قوچ آتابای در رقیق‏کننده‏های شیر و تریس در شرایط نگهداری به‏صورت مایع در دمای پنج درجه سانتی­گراد شد (45). همچنین دانه­ی خرنوب به‏عنوان یک منبع بالقوه آنتی­‌اکسیدانت­های طبیعی در نظر گرفته می­شود (6). فعالیت آنتی­‌اکسیدانت خرنوب مربوط به ترکیبات فنلی است(11). مطالعات نشان داد که ترکیبات فنلی از پودر خرنوب شامل 11 ترکیبات: پروتوکاتکویک، پیروگالول، کومارین، سینامیک، فرولیک، اسیدگالیک، وانیلیک،کاتکول،کلروژنیک، اسیدکافئیک و کاتچین (12). جوشانده خرنوب افزایش‌­دهنده‌ تعداد و کیفیت اسپرم متحرک و علیه ناتوانی جنسی در مردان ذکر شده است (13). تحقیقات نشان می­‌دهد‌ که از‌ عصاره‌­ی هیدروالکلی دانه­ی خرنوب به‏صورت خوراکی در موش استفاده شده است و اثر آن بر هورمون­های بیضه و اسپرماتوژنز مورد بررسی قرارگرفته که باعث افزایش غلظت تستوسترون شده است (14). در این مطالعه افزودن عصاره دانه­ی خرنوب به رقیق­کننده، موجب بهبود فراسنجه­‌های تحرک، زنده­مانی، یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم و کاهش ناهنجاری­های ریخت شناسی اسپرم در مقایسه با گروه شاهد شده و توانست اسپرم­ها را در برابرآسیب­های اکسیداتیو محافظت کند که احتمالا یکی از دلایل این بهبود می­تواند مهار تولید بیش ازحد رادیکال­های آزاد به‏خصوص ROS توسط عصاره­ی این گیاه باشد. یک ارتباط قوی بین تولید ROS و کاهش تحرک اسپرم وجود دارد به‏طوری­که مشخص شده است هیدروژن پراکسید می­تواند در سراسر غشای اسپرم پخش شده و فعالیت برخی آنزیم­های حیاتی مانند آنزیم گلوگز-6 فسفات دهیدروژناز را مهار کند. این آنزیم با کنترل غلظت گلوگز از طریق منحرف کردن مسیر هگزوز مونو‏فسفات و کنترل فعالیت نقش اساسی در تولید ATP و تحرک اسپرم دارد (46). نتایج تحرک کل و پیشرونده­ی اسپرم تحقیق حاضر در سطوح 05/0 و 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان تحرک کل اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد ذوب شدند. افزودن عصاره­ی دانه­ی خرنوب به رقیق کننده، توانست با محافظت ساختمان غشاء اسپرم­ها زنده­مانی و یک‏پارچگی غشای پلاسمایی آن­ها را نسبت به گروه شاهد بهبود ببخشد، نتایج نشان داد که سطوح 50/0 و 1/0 میلی­لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان یک‏پارچگی غشای پلاسمایی و سطح 05/0 میلی لیتر عصارهی دانه‏ی خرنوب باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در میزان زنده­مانی اسپرم­ها بعد از فرآیند انجماد-ذوب شدند. یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم یک شرط لازم برای حفظ عملکردهای اسپرماتوزوا در طول ذخیره­سازی در مجرای تناسلی ماده و نفوذ از لایه پری ویتیلین تخمک است. گسیختگی یک‏پارچگی غشای پلاسمایی اسپرم ناشی از ژولیدگی و به‏هم ریختگی آرایش لیپیدها در داخل غشا در طول حفظ انجماد منی ممکن است آسیب­های سلولی بیشتری را القا کرده و در نتیجه منجر به مرگ سلول اسپرم شود (74). علاوه بر این، اسپرم قوچ نسبت به تغییرات دمایی حساس بوده و به‏راحتی در طی حفظ انجماد منی آسیب می­‌بیند. غشای پلاسمایی اغلب به‏عنوان بخش اولیه که در آن آسیب در سلول­ها آغاز می­شود، در نظر گرفته شده است. مطالعات پیشین حاکی از آن است که ترکیبات فنولیک (مخصوصا فلاونوئیدها) قادرند با پوشش دادن لیپیدها روند پراکسیداسیون لیپیدی را تغییر داده و متوقف کرده و باکاهش سیالیت غشاهای سلولی، جلوگیری از تولید بیش از حد گونه­های اکسیژن فعال و محدود کردن پراکسیداسیون فسفولیپیدها و اسیدهای چرب غیراشباع، از غشاهای سلولی محافظت کنند (84). بررسی نتایج درصد کل اسپرم ناهنجار ریخت شناسی) که این امر به ژنتیک حیوان مرتبط است و بیشتر ناهنجاری­های اسپرم در مرحله اسپرماتوژنسیز رخ می­دهد. شاید نوع روش انجماد به دلیل ایجاد شوک سرمایی نیز منجر به بعضی ناهنجاریها در اسپرم شود. نتایج این آزمایش نشان داد که سطح 05/0 میلی‏لیتر عصاره­ی دانه­ی خرنوب باعث ایجاد اختلاف معنی­داری در کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی بعد از فرآیند انجماد-ذوب شد. اثرات مثبت عصارهی دانهی خرنوب نه‏تنها در خصوصیات تحرک اسپرم بلکه در زنده­مانی، یک‏پارچگی غشا و کاهش میزان اسپرم­های با ریخت شناسی غیرطبیعی قابل مشاهده بود که می­توان دلیل آن­را داشتن ترکیب­های فنولیک متعدد در گیاه دانست، که اسپرم­ها را از آسیبهای ناشی از تنش­ اکسیداتیو محفوظ می­دارند. در این مطالعه افزودن سطوح بالاتری ازعصاره، اثرات مفید کمتری روی هرکدام از فراسنجه­ها داشته که می­تواند ناشی از تغییرات اسمزی، Hp و بهم خوردن تعادل ترکیبات رقیق‏کننده در سطوح بالاتر عصاره باشد. همچنین افزودن سطوح بالای عصاره، با مهار بیش ازحد فعالیت آنزیم­های دخیل در اکسیداسیون و احیا و به‏همزدن تعادل بین ظرفیت آنتی‏اکسیدانتی و تولید رادیکال­های آزاد در محیط اسپرم­ها را به‏همزده و باعث کاهش عملکردهای اسپرم میشوند (94).

 

نتیجه­گیری

نتایج پژوهش حاضر نشان داد که افزودن 05/0 میلی­لیتر از عصاره­ی دانه­ی خرنوب به رقیق­کننده بر پایه‌ی تریس-زرده­ی تخم­‌مرغ برای فریز و یخ‌گشایی اسپرم در قوچ نژاد فراهانی احتمالا می­تواند مفید باشد و در غلظت­های مختلف و شرایط متفاوت برای تحقیق در آینده توصیه می­شود.

1. Barbas JP, Mascarenhas RD. Cryopreservation of domestic animal sperm cells. Cell Tissue Bank. 2009; 10(1):42-69.
2. Bilodeau JF, Chatterjee S, Sirard MA, Gagnon C. Levels of antioxidant defenses are decreased inbovine spermatozoa after a cycle of freezing and thawing. Mol Reprod Dev. 2000; 55(3):282–288.
3. Bansal AK, Bilaspuri GS. Impacts of oxidative stress and antioxidants on semen functions. Vet med int. 2011; 686137: 1-7.
4. Zhao HW,   Li Qw, Ning GZ, Han ZS, et al. Rhodiola sacra aqueous extract (RSAE) improves biochemical and sperm characteristics in cryopreserved boar semen Theriogenology. 2008; 71(5):849-57.
5. Mozaffarian V. A Dictionary of Iranian Plant Names. Farhang Moaser Publication. Tehran. 1996.
6. Gohar A, Gedara SR, Baraka HN. New acylated flavonol glycoside from Ceratonia siliqua L. seed. J Med Plan Res. 2009; 3(5): 424-8.
7. Mohamed D, Helal A, Hamed I, Hosein H, et al. Ceratonia siliqua pods as a cheap source of functional food components. Dtsch Lebensmitt Rundsch. 2008; 104(1): 25-29.
8. Ortiz LT, Rodriguez ML, Alzueta C, Rebole A, et al. Effect of carob seed (Ceratonia siliqua L) in broiler chick diet on nutrient digestibility and intestinal viscosity. EAAP publication no.110, Toledo, Spain, Wageningen academic publishers. 2004; 239-242.
9. Duke J. Phytochemical and ethnobotanical databases Ceratonia siliqua, Green farmacy garden 8210 Murpht road fulton, MD 20759. Agricultural research service, Beltsville area: http://www.Aragrin. Gov/duke/Ceratonia siliqua information from NPGS/GRIN. 2009.
10. Yang HS, Han DK, Kim JR, Sim JC. Effects of alpha-tocopherol on cadmium-induced toxicity in rat testis and spermatogenesis. J Korean Med Sci. 2006; 21(3): 445-51.
11. Owen RW, Haubner R, Hull WE, Erben G, et al. Isolation and structure elucidation of the major individual polyphenols in carob fibre. Food Chem Toxicol. 2003; 41(12): 1727-38.
12. Smith HAE. Biochemical studies on some flavonoides, essential oils and saponins extracted from medical plants. PhD, Thesis. Faculty of Agriculture-Cairo University. 2007.
13. Vafaee Mamghani N. Health Guide to Plants, 2th Ed. Tabriz: Amidi Publications; 2014.
14. Mokhtari M, Sharifi E, Azadian SH. The effects of hydro alcoholic extract ofCeratonia siliqua Lseeds on pituitary–testis hormones and spermatogenesis in rat. Adv Environ Biol. 2012; 6(10): 2778-2783.
15. NRC. Nutrient Requirements of Sheep. National Research Council, Academy Press, USA. 1985.
16. Mamooi M. Artificial insemination of sheep and goats. Ahvaz Univ. Press. 2000.
17. Naijian HR, Kohram H, Zare Shahneh A, Sharafi M. Effects of various concentrations of BSA on microscopic and oxidative parameters of Mahabadi goat semen following the freeze–thaw process. Small Rumin Res. 2013; 113(2): 371-375.
18. Bucak MN, Sarıözkan S, Tuncer PB, Sakinand F, et al. The effect of antioxidants on post-thawed Angora goat (Capra hircusancryrensis) sperm parameters, lipid peroxidation and antioxidant activities. Small Rumin Res. 2010; 89: 24-30.
19. Jeyendran RS, Van der Ven HH, Zaneveld LJ. The hypoosmotic swelling test: an update. Arch Androl. 1992; 29(2): 105- 116.
20. Garcia-Artiga C. Test de endosmosis en ovino. In: 7th international meeting on animal reproduction. Murcia. Spain. 1994; PP: 77-81.
21. Schafer S, Holzmann A. The use oftransmigration and spermac stain to evaluateepididymal cat spermatozoa. Anim Reprod Sci. 2000; 59(3-4): 201-211.
22. Evans G, Maxwell WMC, Salamons S. Artificial insemination of sheep and goats. Butterworths. 1987; No.Ed. 2 pp.xi + 194 pp.
23. Lotfipour S, Arnold MM, Hogenkamp DJ, Gee KW, et al.The monoamine oxidase (MAO) inhibitor tranylcypromine enhances nicotine self-administration in rats through a mechanism independent of MAO inhibition. Neuropharmacology. 2011; 61(1-2):95-104.
24. Amini Rad O, Khalili MA, Soltani Gord Faramarzi HR. Influence of pomegranate juice on sperm parameters and fertility in mice Hormozgan Med J. 2009;13(3):182-188.
25. Riasi A, Baghshahi H, Mahdavi AH, Shirazi A. Antioxidant effects of clove bud (Syzygium aromaticum) extract used with different extenders on ram spermatozoa during cryopreservation. Cryobiology. 2014; 69(3): 482–487.
26. Daghighkia H, Shahbaz zadeh R, Ashrafi I. Antioxidant effect of Macrantha Satureja extraction on microscopic and biochemical parameters of bull sperm after freeze -thawing process. Anim Sci J. 2016; 108(28); 101-113
27. Farhadi R, Daghigh Kia H, Ashrafi I. The Effect of Salvia Sahendica Ethanolic Extract as Natural Antioxidant on Quality Parameters of Cryopreserved Holstein Bull Sperm. Rap. 2016; 6 (12):79-86.
28. Vahedi V, Hedayat Evrigh N. Improvement in frozen-thawed ram sperm quality parameters by adding Mentha piperita L. extract in extender. J ANIM Environ. 2019; 11(1): 83-90.
29. Rostami S, Beigi Nassiri MT, Nazari M, Tabatabaei Vakili. The effect of different levels of soybean lecithin on semen quality and sex ratio of Holstien bull sperm by Real-time qPCR technique. Cell Tissue. 2019; 10(3): 133-142.
30. Breque C, Surai P, Brillard JP. Roles of antioxidants on prolonged storage avian spermatozoa in vivo and in vitro. Mol Reprod Dev. 2003; 66(3): 314–323.
31. Traber MG, Atkinson J. Vitamin E antioxidant andnothing more. Free Radic Biol Med. 2007; 43(1): 4-15.
32. Mahan LK, Escott-Stump S, Raymond JL, KrauseMV. Krause's food & the nutrition care process.13th ed. St. Louis, Mo. Elsevier/Saunders. 2012.
33. Gurel A, Coskun O, Armutcu F, Kanter M, et al. Vitamin E against oxidative damage causedby formaldehyde in frontal cortex and hippocampus:biochemical and histological studies. J Chem Neuroanat. 2005; 29(3): 173-8.
34. Nouri M, Ghasemzadeh A, Farzadi L, Shahnazi V,et al. Vitamins C, E and lipid peroxidationlevels in sperm and seminal plasma ofasthenoteratozoospermic and normozoospermicmen. International J Reprod BioMed. 2008; 6(1): 1-5.
35. Yoganathan T, Eskild W, Hansson V. Investigationof detoxification capacity of rat testicular germcells and sertoli cells. Free Radic Biol Med. 1989; 7(4): 355-9.
36. Ricciarelli R, Zingg JM, Azzi A. Vitamin E: protectiverole of a Janus molecule. FASEB J. 2001; 15(13): 2314-25.
37. Mardones P, Strobel P, Miranda S, Leighton F, et al.Tocopherol metabolism is abnormal in scavenger receptor class B type I (SR-BI)-deficient mice. J Nutr. 2002; 132(3): 443-9.
38. Breinger E, Beorlegui N, Flaherty C, Beconi M. Alpha-tocopherol improvesbiochemical and dynamic parameters incryopreserved boar semen. Theriogenology. 2005; 63(8): 2126-2135.
39. Brezezinska E, Slebodzinski A, PietrasB, Wieczork G. Antioxidant effect ofvitamin E and glutatione on lipidperoxidation in boar seminal plasma. Biol. Trace Elem. Res. 1995; 47(1-3): 69-74.
40. Sabik LME, Abd El-Rahman SS. Alpha-tocopheroland ginger are protective on Cyclophosphamideinducedgonadal toxicity in adult male albino rats.Bas Appl Pathol. 2009; 2(1): 21-9.
41. Amini MR, Kohram H, Shahaneh AZ, Zhandi M, et al. The effects of different levels of vitamin E and vitamin C in modified Beltsville extender on rooster post-thawed sperm quality. Cell Tissue Bank. 2015; 16(4):587-92.
42. Blesbois E, Grasseau I, Blum JC. Effects of Vitamin E on fowl semen storage at 4°C. Theriogenology. 1193; 39(3): 771-779.
43. Ahmadi S, Bashiri R, Ghadiri-Anari A, Nadjarzadeh A. Antioxidant supplements and semen parameters: An evidence based review. Int J Reprod BioMed. 2016; 14(12):729.
44. Sarlos P, Molnar A, Kokai M, Gabor G, et al. Comparative evaluation of the effectof antioxidants in the conservation of ram semen. Acta Vet Hungarica. 2002; 50(2): 235-245.
45. Parizadian Kavan B, Jafari Ahangari Y, Zerehdaran S. The effects of various levels ofvitamins E and C in milk and tris extenders on characteristics of atabay ram semen in liquidcondition. J. Agric Sci Natur Res. 2008; 15(5): 123-131.
46. Aitken RJ, Fisher HM, Fulton N, Gomez E, et al Reactive oxygen species generation by human spermatozoa is induced by exogenous NADPH and inhibited by the flavoprotein inhibitors diphenylene iodonium and quinacrine. Mol Reprod Dev: Gamete Res. 1997; 47(4):468-82.
47. Holt W, North R. Effects of temperature and restoration of osmotic equilibrium during thawing on the induction of plasma membrane damage in cryopreserved ram spermatozoa. Biol Reprod. 1994; 51(3): 414-424.
48. Blokhina O, Virolainen E, Fagerstedt KV. Antioxidants, oxidative damage and oxygen deprivationstress: A review. Ann Bot. 2003; 91(2): 179-194.
49. Roca J, Gil MA, Hernandez M, Parrilla I, et al. Survival and fertility of boarspermatozoa after freeze–thawing in extender supplemented with butylated hydroxytoluene. J. Androl. 2004; 25(3): 397–405.