بررسی اثر عصاره الکلی گیاه سیاه‏دانه (Nigella sativa L) بر القای مرگ برنامه‏ریزی شده در سلول‌های سرطانی رده HL-60

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

دانشگاه ملایر، دانشکده علوم پایه، گروه زیست شناسی، ملایر، ایران

چکیده

هدف: هدف از این مطالعه بررسی اثر آپوپتوتیک عصاره الکلی سیاه‏دانه بر روی سلول‌های سرطانی HL-60 بود..
مواد و روش‏ها: دراین مطالعه تجربی غلظت‏های350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلی‏لیتر عصاره الکلی سیاه‏دانه در محیط کشت، روی سلول‌های سرطانی HL-60 به‏مدت 24 ساعت اثر داده شد. برای بررسی درصد سلول‌های زنده از آزمون MTT استفاده شد. همچنین برای تعیین این‏که آیا عصاره الکلی سیاه دانه  تکثیر سلول‏های HL-60 را از طریق تنظیم پیشرفت چرخه سلولی و آپوپتوزیس مهار می‌کند، ابتدا با استفاده از رنگ‏آمیزی PI فلوسایتومتری انجام شد، سپس رنگ‏آمیزی AO/EB سلول‏های HL-60 برای تشخیص الگوهای آپوپتوزیس و نکروزیس انجام شد.
نتایج: آزمون MTT نشان داد که در مقایسه با گروه کنترل، عصاره الکلی سیاه دانه در غلظت 650 میکروگرم/میلی‏لیتر باعث مرگ50 درصد سلول‌های HL-60 شد و در غلظت‌های بالاتر وابسته به غلظت باعث مرگ بیشتر سلول‌ها شد، همچنین افزایش معنی‏داری در سلول‌های فاز G0/G1 از 2/15 درصد در گروه کنترل به 65/51 درصد در گروه تیمار شده با غلظت 650 میکروگرم/میلی‏لیتر باعث مشاهده شد. به‏علاوه مشخص شد که غلظت 650 میکروگرم/میلی‏لیترباعث القا آپوپتوزیس در سلول‏های HL-60 شد در حالی که در غلظت‌های بالاتر باعث نکروزیس سلول‌های HL-60 نسبت به گروه کنترل شدند.
نتیجه‏گیری: با توجه به نتایج به‏دست آمده می‏توان نتیجه گرفت که داروی تاموکسیفن از طریق افزایش بیان ژن CTNNBIP1 بر روی مسیر سیگنالی Wnt و پروتئین بتا کاتنین اثر مهاری دارد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

 لوسمی حاد پرومیلوسیتییکی از زیر گروه‌های لوسمی حاد میلوییدی است که طبق آمار سایت سازمان بهداشت جهانی در سال 2018 درصد افراد مبتلا به این بیماری در مردها 1/6 درصد و در خانم‌ها 3/ 4در همه سنین جمعیت جهان است

©International Agency for Research on Cancer 2018)). دراین بیماری ابتدا اختلال در سلول‌های پیش‏ساز خونی به‏وجود آمده و باعث مشکلات فراوانی در عمل‏کرد سایر اعضای بدن نیز می‌شد و در نهایت عوارض بسیار وخیمی در بیمار ایجاد می‌شود (1، ۲). درسال‌های اخیر پروتکل‌های درمانی مطرح شده و در مراکز تحقیقاتی مورد بررسی و تجزیه و تحلیل قرارگرفته است. یکی از پروتکل‌های درمانی که تا به امروز مورد استفاده قرارگرفته است شیمی‏ درمانی می‌باشد. استفاده از داروهای سیتوتوکسیک جهت از بین بردن سلول‌های بلاست بدخیم در طیف وسیعی استفاده می‌شود. اما مهمترین نقص این روش استفاده از داروهای شیمی درمانی است که دارای اثرات جانبی زیادی هستند. عوامل سیتوتوکسیک کیفیت زندگی بیماران سرطانی را تحت تاثیر قرار می‌دهد بنابراین بهبود کیفیت زندگی بیماران سرطانی بستگی به داروهای شیمی درمانی با کارایی بالا و سمیت پایین روی سلول‌های سالم دارد (۳). در سال‌های اخیر استفاده از عصاره گیاهان به‏عنوان مواد طبیعی برای از بین بردن سلول‌های سرطانی و جلوگیری از عود سرطان بسیار مورد توجه پژوهشگران قرار گرفته است. ازجمله این گیاهان، گیاه سیاه‏دانه است که تاریخچه غنی طبی و مذهبی دارد (۴، 5). این گیاه بومی اروپای جنوبی، آفریقای شمالی و آسیا است. گیاه سیاه‏دانه با نام علمی Nigella sativa L. از خانواده Ranunculaceae است با گل‏های سفید یا آبی کمرنگ تا آبی پررنگ دارای دانه‏های سفید شیری رنگ که در تماس با هوا سیاه رنگ می‏شوند (۵، ۶). اثرات فارماکولوژیک سیاه‏دانه شامل اثرات ضدالتهابی وآنتی‏اکسیدانتی (۷، ۸)کاهش قند (9، 10)، چربی (1۱) و فشارخون بالا (1۲)، محافظ بافت‏های کبد و کلیه (16- 13) و قلب و عروق (1۷) و همچنین اثرات ضدمیکروبی (1۸) و ضدانگلی (1۹) ازاین گیاه گزارش شده است. همچنین مطالعات گسترده‌ای در زمینه‌ی خواص ضد‏سرطانی سیاه‏دانه و ترکیبات کینونی آن مثل تیموکینون بر روی سرطان‌های مختلف از جمله کولون (20)، سینه (21 و 22)، سارکوما (23)، معده (24، 25)، خون (2۶، 27)، ریه (28) و رحم (29) صورت گرفته است. در مورد مقایسه این‏که ترکیب اصلی عصاره سیاه‏دانه (تیموکینون) روی کدام یک از انواع سرطان‌ها فعال‏تر بوده است تا به‏حال مقایسه کاملی انجام نگرفته است و بیشتر در مورد مسیرهای سیگنالینگی که باعث از بین بردن سلول‌های سرطانی می‌شود بحث شده است. اما در سال 1992، Salomi و همکارانش نشان دادند که در شرایط آزمایشگاهی غلظت‌های 5/1، 3 و 5/1 میکروگرم از عصاره سیاه‏دانه باعث کشته شدن 50 درصد از سلول‌های سرطانی Ehrlich ascites carcinoma (EAC)، (DLA) Dalton's lymphonia ascites و Sarcoma-180(S-180) به‏ترتیب شد در حالی‏که روی سلول‌های K-562 اثر بسیار کمی داشت. همچنین مطالعاتin vivo  آن‏ها نشان داد که خوراندن 2 میلی‏گرم از عصاره سیاه‏دانه به‏مدت 10 روز در موش‌های (EAC)، رشد این تومور را مهار کرد (30). تاکنون در مورد اثرات آپوپتوتیک و سایتوتوکسیک عصاره الکلی سیاه‏دانه بر سلول‏های سرطانی HL-60 گزارشی منتشر نشده است، لذا در این مطالعه اثر عصاره الکلی سیاه‏دانه بر رشد سلول‏های سرطانی HL-60  مورد بررسی قرار گرفت.

 

مواد و روش‌ها

­­کشت سلول و آماده سازی غلظت های مختلف مواد:برای انجام آزمایش رده سلولی   HL-60را از موسسه پاستور تهیه و در محیط کشت  RPMI1640همراه با FBS ۱۰ درصد و ۱۰۰واحد/میلی‏لیتر پنی‏سیلین و ۱۰۰ میلی‏گرم/میلی‏لیتر استرپتومایسین در فشار5 درصد CO2 و دمای 37 درجه کشت داده شد. دراین مطالعه تجربی عصاره‏گیری با استفاده از روش شناخته شده سوکسله انجام شده برای این منظور 100 گرم از پودر سیاه‏دانه با 490 میلیلیتر الکل 96 درصد با دستگاه سوکسله عصاره‏گیری شد. عصاره از فیلتر سرنگی 2/0 میکرومتری عبور داده تا استریل شود. برای تعیین وزن خشک عصاره استریل، 10 میلی‏لیتر از آن در پلیت با وزن معلوم ریخته و روی بن‏ماری 70 درجه‏ سانتی‏گراد الکل آن تبخیر شد و سپس با ترازوی دیجیتال بادقت 0001/0گرم توزین شد. بااستفاده، ازمحیط کشت استریل از عصاره سیاه‏دانه غلظت‏های 350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلیلیتر تهیه شد.

بررسی درصد سلولهای زنده: برای بررسی درصد سلول‏های زنده از آزمون MTT استفاده شد. به­طورخلاصه، روش MTT به‏این صورت انجام گرفت: ابتدا، تعداد مناسب 105× 5 سلول در هر میلی­لیتر و غلظت مواد مورد نظر در خانه­های یک پلیت 24 خانه تنظیم شد و برای هر غلظت از ماده مورد نظر سه خانه درنظر گرفته شد. بعد از 24 ساعت به هر خانه از پلیت­های 24 خانه 200 میکرولیتر محلول  MTTبا غلظت 5 میلی­گرم در میلی­لیتر (Sigma)افزوده شد و سپس 4 ساعت در دمای 37درجه سانتی­گراد انکوبه شد. بعد از این مرحله، پلیت­ها برای 5 دقیقه با دور rpm 800 سانتریفوژ شدند. سپس، محیط رویی با احتیاط خارج شد و بعد به هر خانه 200 میکرولیتر DMSO (Merck) اضافه شد پس از گذشت 30 دقیقه، محتوای خانه­ها چندین­بار مخلوط شد تا رسوب داخل سلول­ها بیرون بریزد. سرانجام میزان جذب نوری (OD) در طول موج 570 نانومتر با استفاده از دستگاه الایزا ریدر (BioTek,Germany) ثبت شد. سپس، درصد سلول­های زنده در هر چاهک از تقسیم OD آزمون بر OD کنترل ضرب ­درصد به­دست آمد.

تجزیه و تحلیل چرخه سلولی: سلول‌های HL-60 با غلظت‌های مختلف350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلی لیتر عصاره الکلی سیاه دانه برای 24 ساعت تحت تیمار قرار گرفتند. پس از 24 ساعت، سلول‌ها در اتانول 70 درصد در دمای 4 درجه سانتی‏گراد در طول یک شب تا صبح ثابت شدند. سلول‏های ثابت با ۵۰ میکرولیتر PI (۱۰میلیگرم/میلیلیتر) به‏مدت 20 دقیقه روی یخ در تاریکی رنگ‏آمیزی شدند. در نهایت، فلورسانس ساطع شده توسط مجموعه PI-DNA در488 نانومتر مورد آزمایش قرار گرفت. درصد سلول‏ها در مراحل مختلف چرخه سلول، یعنی، G0، G1، S، و G2/M، با استفاده فلوسایتومتری و توسط نرم‏افزار Cell Quest مورد تجزیه و تحلیل قرار گرفت.

رنگ‏آمیزی AO/EB: رنگ‏آمیزی AO/EB سلول‏های HL-60 برای تشخیص الگوهای آپوپتوزیس و نکروزیس انجام شد، همان‏طور که قبلا گزارش شده است (۳1) به‏طور خلاصه، سلول‏هایHL-6 به‏مدت 24 ساعت تحت تاثیر عصاره سیاه‏دانه با غلظت‏های 350، 650، 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر قرار گرفتند و سپس سه بار با بافر فسفات (PBS) شسته شدند. سلول‌ها با 100 میکروگرم در میلیلیترAO/EB به‏مدت 5 دقیقه رنگ‏آمیزی شدند. حداقل 200 سلول در زیر میکروسکوپ فلورسانس مشاهده شد. سلول‏ها به‏شرح زیر طبقه‏بندی شدند: زنده، آپوپتوزیس یا نکروزیس. درصد سلول‏های آپوپتوتیک با استفاده از فرمول: درصد سلول‏های آپوپتوزیس (%) = (تعداد سلول آپوپتوزیس/کل سلول مورد بررسی) 100 درصد محاسبه شد.

تحلیل آماری

جهت تجزیه و تحلیل آماری داده‏ها از نرم­افزار INSTAT-3 و آزمون تحلیل واریانس یک­طرفه استفاده شده و نمودارها ازطریق برنامه EXCEL رسم شدند. 05/0>p  معنی‏دار بودن داده‏ها تلقی شد و هر آزمایش دست­کم سه مرتبه تکرار شد. داده­ها نشان‏دهنده means ± SD از سه آزمایش جداگانه است.

 

نتایج

اثرضدتکثیری عصاره الکلی سیاه دانه بر سلول­هایHL-60

آزمون MTT نشان داد که در مقایسه با گروه کنترل، عصاره الکلی سیاه‏دانه در غلظت  IC50650 میکروگرم/میلی لیتر باعث مرگ 50 درصد سلول‏هایHL-60  شد در حالی‏که در این غلظت رو سلول‏های سالم تاثیری نداشت. در غلظت‌های بالاتر وابسته به غلظت باعث مرگ بیشتر سلول‌ها شد، در حالی‏که در غلظت 350 میکروگرم/میلیلیتر نسبت به گروه کنترل تاثیر معنی‏داری روی تکثیر سلول‌های HL-60 نداشت (شکل 1).

 

 

شکل1:سلول‏های HL-60 با غلظت‌های مختلف 350، 650، 950و1250 میکروگرم/ میلی‏لیتر تحت تیمار قرار گرفتند و درصد زنده بودن سلول‌ها بعد از 24 ساعت با روش MTT بررسی شد. این آزمایش بیش از 3 بار تکرار شد. ∗p< 0.001 در مقایسه با نمونه کنترل

 

 اثر عصاره الکلی سیاه دانه بر سیکل سلول‌های HL-60

برای تعیین این‏که آیا عصاره الکلی سیاه‏دانه تکثیر سلول‏های HL-60 را از طریق تنظیم پیشرفت چرخه سلولی و آپوپتوزیس مهار می‌کند، ابتدا با استفاده از رنگ‏آمیزی PI فلوسایتومتری انجام شد. ما افزایش معنی‏داری در سلول‌های G0/G1 از ۲/۱۵ درصد در گروه کنترل به ۶۵/۵۱ درصد گروه تیمار شده با غلظت 650 میکروگرم/میلی لیترمشاهده کردیم. با این حال، در غلظت‌های 950 و 1250 میکروگرم/میلیلیترنسبت سلول‌ها در فازG0/G1 افزایش معنی‏داری نسبت به نمونه کنترل نداشت (شکل 2، 3). این اثرات نشان می‌دهد که عصاره الکلی سیاه دانه قادر به ایجاد توقف سیکل سلولی در فازG0/G1 است.

 

 

شکل۲:سلول‏های HL-60 با استفاده از غلظت‌های مختلف 350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلی‏لیتر به‏مدت 24 ساعت تحت تیمار  قرار گرفتند و نسبت سلول‏های فازG0/G1 براساس فلوسایتومتری محاسبه شد. ∗p< 0.001 در مقایسه با نمونه کنترل

 

 

شکل 3: نمودار‌ مربوط به فلوسایتومتری با استفاده از رنگ  PI جهت بررسی چرخه سلولی، A: میزان سلول‌های متوقف شده در فاز G0/G1 را نشان می‌دهد، :B سلول‌های متوقف شده در فاز  Sو C: سلول‌های متوقف شده در فاز  G2/Mرا نشان می‌دهد. تصویر  Iسلول‌ها HL-60 را بدون تاثیر دارو، تصویر  II سلول‌های HL-60 تیمار شده با غلظت‌650، میکروگرم/میلی لیتر بهمدت 24 ساعت

 

اثر عصاره الکلی سیاه دانه بر القا آپوپتوزیس در سلول‌های HL-60

رنگ‏آمیزی AO/EB نشان داد که سلول‏های زنده سبز به‏طور یکنواخت با مورفولوژی طبیعی در سلول‏های کنترل HL-60 مشاهده می‏شوند، در حالی‏که سلول‏های آپوپتوزیس نارنجی با کروماتین تکه تکه شده و اجسام آپوپتیک در سلول‏های HL-60 تحت درمان با 650 میکروگرم/میلی‏لیترعصاره الکلی سیاه‏دانه مشاهده شدند و در مقایسه با گروه کنترل، درصد سلول‏های آپوپتوتیک به‏طور معنی‏داری افزایش یافته است. با این حال، غلظت‌های 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر، بیشتر باعث نکروزیس سلول‌ها نسبت به آپوپتوزیس آن‏ها شدند این اثرات نشان می‌دهد که عصاره الکلی سیاه‏دانه در غلظت 650 میکروگرم/میلی لیترمی‏تواند باعث القا آپوپتوزیس در سلول‌های HL-60 شود (شکل 4، 5).

 

 

شکل 4: سلول‏های HL-60 با استفاده از غلظت‌های مختلف 350، 650، 950و 1250 میکروگرم/میلی‏لیتر به‏مدت 24 ساعت تحت تیمار  قرار گرفتند و درصد سلول‏های آپوپتوزیس براساس رنگ‏آمیزی AO/EB برآورد شد. ∗p< 0. 001 در مقایسه با نمونه کنترل

 

شکل 5: سلول‏های HL-60 با استفاده غلظت 650میکروگرم/میلی لیتر به‏مدت 24 ساعت تحت تیمار  قرار گرفتند و رنگ‏آمیزی AO/EB سلول‏های HL-60 کنترل و تحت تیمار انجام شد (بزرگنمایی۴۰۰). الف: سلول‌های کنترل ، ب: سلول‌های تیمار شده با عصاره الکلی سیاه دانه – فلش نشان دهنده سلول‏های آپوپتوزیک است.

 

بحث

در این پژوهش مشخص شد که غلظت 650 میکروگرم/میلی‏لیتر عصاره الکلی سیاه‏دانه باعث القا آپوپتوزیس در سلول‏هایHL-60  شد در حالی که در غلظت‌های بالاتر یعنی 950 و 1250 میکروگرم/میلی لیتر باعث نکروزیس سلول‏هایHL-60  نسبت به گروه کنترل شدند. برای توجیه اثرات ضدسرطانی عصاره سیاه‏دانه ترکیبات موجود در آن استخراج شدند و مشخص شده که ترکیب اصلی که خاصیت ضدسرطانی دارد تیموکینون می‌باشد (32). تا به امروز برای اثرات ضد سرطانی تیموکینون مکانیسمهای مختلفی پیشنهاد شده است. Badary و همکاران (33) و همچنین Burits و همکاران (34) نشان دادند که فعالیت آنتی‏اکسیدانتی عصاره الکلی سیاه دانه مانع تکثیر سلول‌های سرطانی می‌شد. Gali-Muhtasib و همکاران (35) برروی سلول‏های کلورکتال نشان دادند که تیموکینون استخراج شده از سیاه دانه از طریق مکانیسم وابسته بهP53  باعث القا آپوپتوزیس در این سلول‌ها شد (35). Mahdy و همکاران (36) نشان دادند که تیموکینون با غلظت ۱۰۰میکرومولار از طریق فعال سازیcaspase-8  و رخدادهای میتوکندریایی در سلول‏های HL-60 باعث القا آپوپتوزیس می‌شوند. محمود الحسین و همکاران (37) نشان دادند، تیموکینون تا غلظت 100 میکرومولار برروی سلول‌های لوکمی از طریق ژن‌های P53 و P73 باعث القا آپوپتوزیس می‌شوند (37). که نتایج پژوهش ما نیز هم راستا با این تحقیقات و نشان دهنده القا آپوپتوزیس در سلول‏های HL-60 بود. Kooti و همکاران (38) خصوصیات فیتوشیمی، داروسازی و کاربردهای درمانی سیاه‏دانه (Nigella sativa) به‏ویژه خاصیت ضد‏سرطانی آن را از طریق القا آپوپتوزیس نشان دادند. Majdalawieh و همکاران (39)گزارش کردند در دو دهه گذشته عصاره سیاه‏دانه می‌تواند، به‏تنهایی یا همراه با داروهای شیمی درمانی، به‏عنوان عوامل موثر برای کنترل شروع تومور، رشد و متاستاز باشد و از این‏رو، می‌تواند در درمان گسترده‌ای از انواع سرطان‌ها موثر باشد. همچنین ایشان و همکاران (40) نشان دادند که تیموکینون از طریق مسیرهای سیگنالینگp53, NF-κB, PPARγ, STAT3, MAPK and PI3K/AK عملکرد ضدسرطانی دارد. به‏نظر می‏رسد که در میان این مکانیسم‏ها، القای مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی از مهم‏ترین مکانیسم‏های موثر در فعالیت ضدسرطانی عصاره الکلی سیاه‏دانه می‏باشد که یافته‏های ما نیز آ‏ن ‏را تایید می‏کند. از طرف‏دیگر مطالعات گسترده‌ای درباره این‏که سیاه‏دانه به‏عنوان یک افزایش دهنده فعالیت داروهای شیمی درمانی به‏کار رود نیز صورت گرفته است. Effenberger و همکاران (41) نشان دادند که ترپن همراه با سیاه‏دانه اثر بیشتری در خاصیت ضدتکثیری سلول‌های سرطانی HL-60 از طریق القا آپوپتوزیس و همچنین فعالیت آنتی‏اکسیدانتی دارد. همچنین در مطالعه ای دیگر  هم نشان دادند که عصاره سیاه‏دانه اثر ضدسرطانی غلظت‌های پایین دوکسوروبیسین را افزایش می‌دهد (42). در این پژوهش ما غلظت IC50 عصاره الکلی سیاه‏دانه را روی سلول‌های سرطانی به‏دست آورده تا در پژوهش‌های بعدی اثر هم‏افزایی آن را بر روی دارو‌های ضد‏سرطانی بررسی کنیم. البته مطالعات بیشتر در مورد عصاره سیاه‏دانه بر اساس آزمایشات بالینی برای کشف فواید آن در مدیریت سرطان بسیار لازم است.

 

نتیجه­گیری

یافته‌های ما برای اولین بار نشان داد که عصاره الکلی سیاه‏دانه در غلظت 650 میکروگرم/میلی لیتر باعث توقف سیکل سلولی شد و در غلظت‌های بالاتر باعث ایجاد نکروزیس در این سلول‌ها شد.

1. Johnstone RW, Ruefli AA, Lowe SW. Apoptosis: a link between cancer genetics and chemotherapy. Cell. 2002; 108(2): 153-64.

2. Kitada S, Pedersen IM, Schimmer AD, Reed JC. Dysregulation of apoptosis genes in hematopoietic malignancies. Oncogene 2002; 21(21): 3459‑74.

3. Ethier MC, Blanco E, Lehrnbecher T, Sung L. Lack of clarity in the definition of treatment-related mortality: pediatric acute leukemia and adult acute promyelocytic leukemia as examples.  Blood. 2011; 118(19): 5080–5083

4. Swamy SM, Tan BK. Cytotoxic and immunopotentiating effects of ethanolic extract of Nigella sativa L. seeds. J Ethnopharmacol. 2000; 70(1): 1-7.

5. Ijaz HTulain URQureshi JDanish Z, et al. Review:  Nigella sativa (Prophetic Medicine): A Review. Pak J Pharm Sci. 2017; 30(1): 229-234.

6. Zheng J, Zhou Y, Li Y, Xu DP, et al. Spices for Prevention and Treatment of Cancers. Nutrients. 2016;12: 8(8).

7. Amizadeh S, Rashtchizadeh N, Khabbazi A, Ghorbanihaghjo A, et al. Effect of Nigella sativa oil extracts on inflammatory and oxidative stress markers in Behcet's disease: A randomized, double-blind, placebo-controlled clinical trial.  Avicenna J Phytomed. 2020; 10(2): 181-189.

8. Bordoni LFedeli DFiorini DGabbianelli R. Extra Virgin Olive Oil and Nigella sativa Oil Produced in Central Italy: A Comparison of the Nutrigenomic Effects of Two Mediterranean Oils in a Low-Grade Inflammation Model. Antioxidants (Basel). 2019; 9(1): 20.

9. Kaleem M, Kirmani D, Asif M, Ahmed Q,  et al.  Biochemical effects of Nigella sativa L seeds in diabetic rats. Indian J. Exp. Biol.  2006; 44(9): 745 - 8.

10. Mohebbati RAbbasnezhad A. Effects of Nigella sativa on endothelial dysfunction in diabetes mellitus: A review. J Ethnopharmacol.  2020; 252: 112585.

11. Dahri AH, Chandiol AM, Rahoo AA, Memon R. AEffect of Nigella sativa (kalonji) on serum cholesterol of albino rats. J. Ayub. Med. Coll.  Abbottabad. 2005; 17 (2): 72-4.

12. Dehkordi FR, Kamkhah A F. Antihypertensive effect of Nigella sativa seed extract in patients with mild hypertension. Fundam. Clin. Pharmacol. 2008; 22 (4): 447 - 52.

13. Tekbas AHuebner JSettmacher UDahmen U. Plants and Surgery: The Protective Effects of Thymoquinone on Hepatic Injury-A Systematic Review of In Vivo Studies. Int J Mol Sci.  2018; 19(4):1085.

14. Eğilmez OKKökten NKalcıoğlu MTEkici AID, et al. Investigation of the Protective Effect of Nigella Sativa Oil in Cisplatin Induced Oral Mucositis: An Experimental Study. Turk Arch Otorhinolaryngol. 2020; 58(1): 10-15.

15. Razmpoosh  ESafi SAbdollahi NNadjarzadeh A, et al. The effect of Nigella sativa on the measures of liver and kidney parameters: A systematic review and meta-analysis of randomized-controlled trials. Pharmacol Res. 2020; 20(156): 104767.

16. Wang FLei XZhao YYu Q, et al. Protective role of thymoquinone in sepsis-induced liver injury in BALB/c mice. ExpTher Med.  2019; 18(3): 1985-1992.

17. El-Bahai MN, Al-Hariri MT, Yar T, Bamosa AO. Cardiac inotropic and hypertrophic effects of Nigella sativa supplementation in rats. Int J Cardiol. 2009;131 (3): 115 - 7.

18. Nawarathne NWWijesekera KWijayaratne WMDGBNapagoda M. Development of Novel Topical Cosmeceutical Formulations from Nigella sativa L with Antimicrobial Activity against Acne-Causing Microorganisms. Scientific World Journal. 2019 ; 2019: 1-7.

19. Hamada FMA, Abdel-Aziz HA, Badr  F, Moustafa  A, et al. The mutagenic effect of praziquantel in S. mansoni infected mice. Arab J Lab. 1992; 18: 301–11.

20. Salim EI, Fukushima S. Chemopreventive potential of volatile oil from black cumin (Nigella sativa L. ) seeds against rat colon carcinogenesis. Nutr Cancer. 2003; 45(2): 195-202.

21. Farah IO, Begum RA. Effect of Nigella sativa L. and oxidative stress on the survival pattern of MCF-7 breast cancer cells. Biomed SciInstrum. 2003; 39: 359-64.

22. Al-Mutairi ARahman ARao MS. Low Doses of Thymoquinone and Ferulic Acid in Combination Effectively Inhibit Proliferation of Cultured MDA-MB 231 Breast Adenocarcinoma Cells. Nutr Cancer.  2020; 28: 1-8.

23. Award EM. In vitro decreases of the fibrinolytic potential of cultured human fibrin sarcoma cell line, HT1080, by Nigella sativa oil. Phytomedicine. 2005; 12(2): 100-7.

24. El-Dakhakhny M, Barakat M, El-Halim MA, Aly SM. Effects of Nigella sativa oil on gastric secretion and ethanol induced ulcer in rats. J Ethnopharmacol. 2000 ; 72(1-2): 299-304.

25. Kanter MCoskun OUysal H. The antioxidative and antihistaminic effect of Nigella sativa and its major constituent, thymoquinone on ethanol-induced gastric mucosal damage. Arch Toxicol.  2006; 80(4): 217-24.

26. AitMbarek L, Ait Mouse H, Elabbadi N, Bensalah M, et al. Antitumor properties of blackseed (Nigella  sativa  L. ) extracts. Braz J Med Biol Res. 2007; 40(6): 839- 47

27. El-Mahdy M A, Zhu Q, Wang QE, Wani G, et al. Thymoquinone induces apoptosis through activation of caspase-8 and mitochondrial events in p53-null myeloblastic leukemia HL-60 cells. Int J Cancer. 2005; 117(3): 409–417.

28. Pathiranage VCThabrew ISamarakoon SRTennekoon KH, et al. Evaluation of anticancer effects of a pharmaceutically viable extract of a traditional polyherbal mixture against non-small-cell lung cancer cells. J Integr Med. 2020;

29. Ichwan SJAl-Ani IMBilal HGSuriyah WH, et al. Apoptotic activities of thymoquinone, an active ingredient of black seed (Nigella sativa), in cervical cancer cell lines. Chin J Physiol. 2014; 57(5): 249-55.

30. Salomi NJ, Nair SC, Javawardhanan KK, Varghese CD, et al. Antitumour principles from Nigella sativa seeds. Cancer Lett. 1992; 63(1): 41-6.

31. Surh YJ, Hurh YJ, Kang JY, Lee E, et al. Resveratrol, an antioxidant present in red wine, induces apoptosis in human promyelocytic leukemia (HL-60) cells. Cancer Letters. 1999; 140(1-2): 1-10.

32. Almatroodi SAAlmatroudi AAlsahli MAKhan AAet al. Thymoquinone, an Active Compound of Nigella Sativa: Role in Prevention and Treatment of Cancer. Curr Pharm Biotechnol.  2020 [Epub ahead of print]

33. Badary OA, Taha RA, Gamal el-Din AM, Abdel-Wahab MH. Thymoquinone is a potent super oxide anion scavenger. Drug ChemToxical. 2003; 26(2): 87-98. 

34. Burits M, Bucar F. Antioxidant activity of Nigella sativa. Pharm Bull. 2000; 14(5): 323-8.

35. Gali-Muhtasib H, Diab-Assaf M, Boltze C, Al-Hmaira J, et al. Thymoquinone extracted from black seed triggers apoptotic cell death in human colorectal cancer cells via a p53-dependent mechanism. Int J Oncol. 2004; 25(4): 857-66.

36. El-Mahdy MA, Zhu Q, Wang QE, Wani G, et al. Thymoquinone induces apoptosis through activationof caspase-8 and mitochondrial events in p53-null myeloblasticleukemia HL-60 cells. Int J Cancer. 2005; 117(3): 409-17.

37. AlHossein M, Abusnina A, Achour M, Sharif T, et al. Induction of apoptosisby thymoquinone in lymphoblastic leukemia Jurkat cells is mediated by a p73-dependentpathway which targets the epigenetic integrator UHRF1. Biochemical Pharmacol. 2010;79(9): 1251-60.

38. Kooti W, Hasanzadeh-Noohi Z, Sharafi-Ahvazi N, Asadi-Samani M, et al. Phytochemistry, pharmacology, and therapeutic uses of black seed (Nigella sativa). Chin J Nat Med. 2016;14(10): 732-745.

39. Majdalawieh AFFayyad MW. Recent advances on the anti-cancer properties of Nigella sativa, a widely used food additive. J Ayurveda Integr Med.  2016;7(3): 173-180.

40. Majdalawieh AF, Fayyad MW, Nasrallah GK. Anti-cancer properties and mechanisms of action of thymoquinone, the major active ingredient of Nigella sativa. Crit Rev Food SciNutr. 2017; 57(18): 3911-3928.

41. Effenberger K, Breyer S, Schobert R. Terpene conjugates of the Nigella sativa seed-oil constituent thymoquinone with enhanced efficacy in cancer cells. ChemBiodivers, 2010; 7(1): 129-39.

42. Effenberger-Neidnicht K, Schobert R. Combinatorial effects of thymoquinone on the anti-cancer activity of doxorubicin. Cancer ChemotherPharmacol. 2011; 67(4): 867-74.