بررسی اثرات ضد سرطانی نانوذرات ساماریوم سنتز شده به‮ کمک عصاره گیاه زنجبیل روی سلول‏های سرطانی کولورکتال HCT116‬‬‬‬

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 دانشگاه خوارزمی، دانشکده علوم زیستی، گروه علوم سلولی و مولکولی، تهران، ایران

2 پژوهشگاه ماده و انرژی، گروه فناوری نانو و مواد پیشرفته، کرج، ایران

چکیده

هدف: با توجه به پیشرفت و شیوع سرطان، تلاش بر این است که ترکیب‏های جدید در جهت سرکوب تومور و همراه با سمیت کمتر باشند. طی دهه‏های گذشته به‏منظور توسعه سیستم انتقال دارو برای غلبه برمحدودیت‏های داروهای رایج مورد استفاده در درمان بیماری‏ها، نانو تکنولوژی بسیار مورد توجه قرار گرفته است.
مواد و روش‏ها: لذا در این مطالعه برای اولین بار نانوذرات ساماریوم با استفاده از روش شیمی سبز و به کمک عصاره زنجبیل سنتز شدند. سپس خصوصیات فیزیکوشیمیایی نانوذرات سنتزی با استفاده از تکنیک پراکنش نور دینامیکی (DLS)، طیف سنجی مادون قرمز (FT-IR) و میکروسکوپ الکترونی روبشی  FE-SEM بررسی شد. در نهایت خواص ضدسرطانی و سمیت سلولی نانوذرات ساماریم در مقابل سلول‏های سرطانی کولون رده سلولی HCT116 پس از  24 و 48 ساعت تیمار توسط آزمون رنگ سنجی تترازولیوم (MTT Assay) بررسی شد.
نتایج: نتایج مطالعات پراکنش دینامکی نور و همچنین مطالعات مورفولوژیکی به کمک میکروسکوپ الکترونی روبشی بیان‏گر سنتز ناانوذرات کروی و همگن با ابعاد حدود 70 نانومتر می‏باشد. آزمون بقای سلولی میزان Cc50 (غلظتی از ترکیب که 50 درصد مرگ را در سلول‏های سرطانی القا می‏کند) نانوذرات ساماریوم بر روی رده سلولی HCT116 در مدت زمان 24 و 48 ساعت به‏ترتیب  90 (1/23 میکروگرم بر میلی‏لیتر) و 81 میکرومولار  (7/20 میکروگرم بر میلی‏لیتر) نشان داده است.
نتیجه‏گیری: با توجه به یافته‏های به‏دست آمده، به‏نظر می‏رسد نانوذرات ساماریوم سنتز شده به کمک عصاره گیاه زنجبیل می‏توانند به‏عنوان دارویی جدید در درمان سرطان کلورکتال در آینده‏ای نزدیک استفاده شوند.

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

نانوتکنولوژی به‏دلیل پتانسیل بالقوه و اثر اقتصادی بسیار عالی آن، یکی از برترین رشته‏های پژوهشی- تحقیقی رایج در اکثر کشورهاست. معمولا نانومواد به‏عنوان موادی با ویژگی های ساختاری ویژه و ابعادی در مقیاس 100 نانومتر یا کمتر معرفی می‏شوند. نانوذرات می‏توانند با استفاده از روش‏های مختلف مانند روش‏های فیزیکی، شیمیایی، بیولوژیکی و تکنیک‏های هیبریدی سنتز شوند. در روش‏های فیزیکی و شیمیایی از تابش‏های (پرتوهایی) با انرژی بالا، کاهش دهنده‏های بسیار متمرکز و همچنین عوامل پایدارکننده‏ای که برای سلامت انسان خطرناک هستند استفاده می شود. از اینرو سنتز زیستی نانوذرات، یک روش کاهش زیستی تک مرحله‏ایست که از انرژی بسیار کم برای ساختن نانوذرات زیست سازگار و ایمن استفاده می‏کند. از عصاره‏های گیاهی به‏منظور کاهش زیستی یون‏های فلزی برای تشکیل نانوذرات استفاده می‏شود. مطالعات قبلی نشان داده‏اند که متابولیت‏های گیاهی مانند قندها، ترپنوئیدها، پلی فنول‏ها، آلکالوئیدها، فنولیک اسیدها و پروتئین‏ها نقش مهمی را در کاهش یون‏های فلزی و تبدیل آن‏ها به نانوذرات ایفا می‏کنند. همچنین این مواد موجب پایداری نانوذرات پس از تشکیل می‏شوند (1-7).

سرطان تکثیر غیر کنترل شده سلول‏هاست که آپوپتوزیس (مرگ برنامه‏ریزی شده سلولی) در آن‏ها مهار شده است. بنابراین به‏دلیل پیچیدگی در سطوح ژنتیکی و فنوتیپی نیازمند روند درمانی بسیار پیچیده است (8). سرطان کلورکتال یکی از علل عمده مرگ و میر در جهان است و دومین عامل اصلی بروز سرطان در زنان و سومین عامل سرطان در مردان می‏باشد. بیماری‏زایی سرطان کلورکتال بسیار پیچیده است و تحت تاثیر عوامل متفاوت قرار دارد که برخی از آن‏ها مربوط به رژیم غذایی و شیوه زندگی است، در حالی‏که برخی دیگر ناشی از عوامل ژنتیکی است. بیماری‏زایی سرطان کلورکتال با توجه به تغییرات ژنتیکی و اپی ژنتیکی مرتبط به آن می‏تواند متفاوت باشد. چنین تغییرات ژنتیکی و اپی‏ژنتیکی، مستقیما مسئول رویداد خاصی است که به‏دنبال آن از طریق آغاز تغییرات نئوپلاستیک (تومورزایی) اپیتلیوم (بافت پوششی) سالم و در نهایت پیشرفت به‏سمت مراحل بدخیم بیماری، موجب بروز سرطان کلورکتال خواهد شد. به‏طور معمول در اکثر موارد تشکیل سرطان کلورکتال از یک پولیپ  یا کریپت نابجا آغاز می گردد که سپس به یک آدنوم اولیه ( تومورهای خوش خیم با اندازه‏ای کوچک‏تر از 1 سانتی‏متر) تبدیل می شود. این آدنوم‏ها به آدنوم‏های پیشرفته (با اندازه‏ای بیشتر از 1سانتی‏متر) تبدیل شده و نهایتا به سرطان کلورکتال تبدیل خواهند شد (9-13). روش‏های متفاوتی برای درمان سرطان وجود دارد که هر کدام از آن‏ها دارای محدودیت‏ها و اثرات جانبی قابل توجهی می‏باشند. داروهای شیمی درمانی مرسوم از طریق از بین بردن سریع سلول‏های توموری درحال تقسیم عمل می‏کنند، اما این داروها بر سلول‏های سالم و طبیعی بدن که سرعت تقسیم بالایی دارند مانند سلول‏های مغز استخوان، ماکروفاژها، سلول‏های پوششی مجاری گوارشی و سلول‏های فولیکول مو اثر گذاشته و موجب اختلال در عملکرد طبیعی آن‏ها می‏شوند. مشکل اصلی داروهای شیمی درمانی رایج، این است که آن‏ها قادر به تشخیص و انتخاب سلول‏های سرطانی از سلول‏های طبیعی نمی‏باشند. در نتیجه موجب عوارض جانبی بسیاری از قبیل کاهش تولید گلبول‏های سفید خونی (سرکوب سیستم ایمنی)، موکوزیت (التهاب بافت پوششی مجاری گوارشی)، آلوپسی (ریزش مو)، کم‏خونی، تغییر در اشتها، خونریزی، اختلالات چشمی، تغییرات سیستم عصبی، درد، تغییر در مسائل جنسی، مشکلات پوستی و ناخن، اختلات ادراری، خستگی، عفونت، اختلال در اندام‏ها و همچنین کم‏خونی (ترومبوسیتوپنی) می‏شوند. همچنین به‏دلیل وجود عوارض جانبی، دوز مصرف دارو کاهش یافته و حتی ممکن است موجب تاخیر درمان یا توقف در درمان شود. علاوه بر این داروهای شیمی درمانی اغلب قادر به نفوذ و دسترسی به هسته تومورهای جامد نبوده که به معنی ناتوانی در کشتن سلول‏های سرطانی است (13-15).

وجود P-glycoprotein که جز پروتئین‏های مقاومت چندگانه دارویی محسوب می‏شوند و در سطح سلول‏های سرطانی افزایش بیان می‏یابند، موجب جلوگیری از نفوذ و تجمع داروهای شیمی درمانی درون سلول سرطانی شده و به‏عنوان یک پمپ خروج دارو عمل می‏کنند که نتیجه آن ایجاد مقاومت به داروهای ضد سرطانی در سلول‏های توموری می‏باشد. با توجه به مشکلات فوق، نانوتکنولوژی انقلابی عظیم در انتخاب هدفمند سلول‏ها و بافت‏های سرطانی ایجاد نموده است. نانوذرات از طریق تغییرات مختلف مانند تغییر در اندازه، شکل، ویژگی‏های فیزیکی و شیمیایی به‏منظور برنامه ریزی برای هدف قرار دادن سلول‏های مورد نظر طراحی می‏شوند. آن‏ها می‏توانند سلول‏های سرطانی را از طریق هدف‏گیری فعال و یا غیر فعال انتخاب نمایند (8، 14، 15). نانوذرات مشتق شده از زنجبیل به‏عنوان مکانیسم‏های انتقال طبیعی و جدید دارویی، به‏منظور پیش‏گیری و همچنین درمان بیماری‏های التهابی روده‏ای، پیشرفت‏های چشم‏گیری در پزشکی داشته‏اند (16). جینجرول (gingerole)، 6-پارادول (6-paradole) و همچنین ترکیباتی مانند جینجرون (zingerone)  فعالیت‏های جلوگیری کننده از سرطان در کارسینوژنز (سرطان‏زایی) مدل‏های آزمایشگاهی نشان داده‏اند. پتانسیل ضد سرطانی زنجبیل و ترکیبات زیست فعال آن تاکنون در چندین نوع از سرطان‏های مختلف در سطح رده‏های سلولی سرطانی و همچنین مدل‏های حیوانی مورد بررسی قرارگرفته است (17، 18).  ساماریوم  (Sm)یکی از مهم‏ترین عناصر نماینده از خانواده لانتانیدها است و کاربردهای زیستی، تشخیصی و درمانی ساماریوم و همچنین نانوذرات ساماریوم در بسیاری از تحقیقات به اثبات رسیده است (19-22). در این مقاله تلاش شده است  تا یک روش درمانی کم‏خطرتر ، طبیعی و کارآمد از طریق  سنتز نانوذرات ساماریوم با استفاده از عصاره گیاه زنجبیل و با روش شیمی سبز برای از بین بردن سلول‏های سرطانی کلورکتال پیشنهاد شود. لذا در این پژوهش ابتدا عصاره آبی گیاه زنجبیل تهیه شده و سپس نانوذرات ساماریوم با کمک عصاره گیاه زنجبیل و با روش شیمی سبز سنتز شدند. در مرحله بعد، خواص فیزیکوشیمیایی نانوذرات سنتز شده با کمک تکنیک‏های مختلف پراکنش دینامیک نور، طیف سنجی فروسرخ و میکروسکوپ الکترونی روبشی بررسی گردید. در نهایت میزان سمیت سلولی نانوذرات ساماریوم در مقابل رده سلولی سرطان کولورکتال HCT116 در مقایسه با عصاره زنجبیل و نمک کلرید ساماریوم مطالعه و مقایسه شدند.

 

مواد و روش‌ها

این مطالعه تجربی در سال 1397 در آزمایشگاه ماکرومولکول‏های حیاتی در دانشگاه خوارزمی انجام گرفته است.

سنتز نانوذرات ساماریوم: به‏منظور تهیه نانوذرات ساماریوم با استفاده از روش شیمی سبز، ابتدا عصاره‏گیری از گیاه زنجبیل انجام شد. ریشه (ریزوم‏های) گیاه زنجبیل از بازار خریداری، سپس به‏منظور از بین رفتن خاک و آلودگی ها، کاملا با آب شستشو داده شد، آنگاه پوست آن‏ها درآورده شده و به قطعات بسیار کوچک تقسیم شده‏اند. تکه‏های بریده شده خشک و به‏صورت پودر درآورده شدند. سپس پودر زنجبیل با آب دیونیزه ترکیب و به‏مدت 30 دقیقه در دستگاه شیکرانکوباتور قرار داده و انکوبه شد. پس از اتمام زمان انکوباسیون، محلول حاوی زنجبیل  توسط کاغذ واتمن صاف شده و بدین ترتیب عصاره خالص گیاه زنجبیل به‏دست آمد. برای سنتز نانوذرات ساماریوم، محلول ساماریوم کلراید، با عصاره گیاه زنجبیل مخلوط شده و در دستگاه شیکر انکوباتور با دور rpm 200 به‏مدت 12 ساعت قرار داده شد. با انجام واکنش‏های اکسیداسیون-احیا در مدت زمان مشخص شده، احیا یون‏های ساماریوم به نانوذرات ساماریوم صورت می‏پذیرد که توسط تغییرات تدریجی در رنگ محلول از زرد کم‏رنگ به زرد پررنگ مشاهده می‏شود. تغییر رنگ ایجاد شده مبنی بر تشکیل نانوذرات ساماریوم می باشد. محلول به‏دست آمده پس از خروج از انکوباتور، به‏مدت 30 دقیقه در دور  rpm6000 سانتریفیوژ شد. در نهایت رسوب به‏دست آمده در 5 سی سی آب مقطر حل و مطالعات تعیین ویژگی‏های فیزیکوشیمیایی و مورفولوژی بر روی آن انجام شده است.

تعیین اندازه و مورفولوژی نانوذرات ساماریوم

الف- مطالعات پراکنش دینامیکی نور:از رایج‏ترین و سریع‏ترین روش‏ها برای اندازه‏گیری اندازه نانوذرات، طیف‏سنجی فوتون-همبستگی یا پراکنش دینامیکی نور (DLS) می‏باشد. در این تکنیک نمونه تحت تاثیر یک پرتو نور لیزر قرار گرفته و نوسانات نور پراکنده شده با یک زاویه پراکندگی شناخته شده )ɵ(، توسط یک آشکار ساز فوتونی سریع شناسایی می‏شود (23).

ب- مطالعات طیف سنجی مادون قرمزFT-IR) ): طیف سنجی FT-IR به‏منظور شناسایی گروه‏های عملکردی موجود در نانوذرات انجام می‏شود. زیرا هر نانوذره حاوی گروه‏های عملکردی منحصر به فردی می‏باشد. با استفاده از طیف سنجی FT-IR، طیف تابشی فروسرخ، جذب، انتقال فوتون و پراکنش رامان در یک ترکیب جامد، مایع یا گاز را می‏توان ارزیابی نمود. طیف ارائه شده تصویری از پیک‏های جذبی حاوی نانوذرات را نشان می‏دهد که به فرکانس نوسان‏های میان باندهای اتمی در نانوذرات ارتباط دارد. در این بررسی طیف FT-IR از محلول ساماریوم کلراید، عصاره گیاه زنجبیل و محلول نانوذرات سنتز شده به‏دست آمده است (24).

ج- مطالعات میکروسکوپ الکترونی روبشی:برای تعیین مورفولوژی نانوذرات سنتز شده از میکروسکوپ الکترونی FE-SEM استفاده گردیده است.

کشت سلول های HCT116: سلول‏های سرطان کلورکتال رده HCT116 سلول‏های چسبنده‏ای هستند که در محیط کشت مایع به‏صورت چسبیده به کف رشد می‏نمایند. پس از تهیه این سلول‏ها از انیستیتو پاستور تهران،  این سلول‏ها در محیط کشت RPMI-1640 حاوی 10 درصد سرم جنین گاوی (FBS)، آنتی بیوتیک پنی‏سیلینunit/ml  100و استرپتومایسین 100میکروگرم بر میلی‏لیتر (1درصد حجمی)، درون انکوباتور با دمای 37 درجه سانتی‏گراد و پنج درصد CO2 اشباع از رطوبت در فلاسک های cm2 25 کشت داده شدند (25). محیط کشت سلولی هر یک الی دو روز تعویض شد و هنگامی که سلول‏ها 80 درصد سطح فلاسک را پر نمودند، پاساژ داده شدند. آزمون رنگ سنجی تترازولیم جهت ارزیابی بقای سلولی استفاده شد. آزمایش MTT یک روش رنگ سنجی است که بر اساس احیا شدن و شکستن کریستال‏های زرد رنگ تترازولیم به‏وسیله آنزیم سوکسینات دهیدروژناز و تشکیل کریستال‏های آبی رنگ نامحلول انجام می‏شود. طی زمان انکوباسیون، MTT توسط سیستم سوکسینات دهیدروژناز که یکی از آنزیم‏های حیاتی چرخه تنفس میتوکندری است، احیا می‏شود. احیا و شکسته شدن این حلقه موجب تولید کریستال‏های آبی رنگ فورمازان می‏شود که در زیر میکروسکوپ به‏راحتی قابل تشخیص است. میزان رنگ تولید شده با تعداد سلول‏هایی که از نظر متابولیک فعال هستند (سلول های زنده) رابطه مستقیم دارند (26). به‏منظور بررسی اثر سمیت نانوذرات ساماریوم بر میزان تکثیر و بقای سلولی تعداد 104×5 سلول در پلیت‏های 96 خانه کشت داده شدند. پس از آن سلول‏ها با غلظت‏های متفاوتی از نانوذرات ساماریوم به‏مدت 24 و 48 ساعت و همچنین عصاره خالص گیاه زنجبیل به‏مدت 24 ساعت تیمار شدند. پودر زرد رنگ MTT را در 1 میلی‏لیتر بافر PBS (به دور از نور) حل شد، سپس به‏منظور استریل شدن و حذف ذرات نامحلول احتمالی که در برخی از نمونه‏های MTT وجود دارد، از داخل فیلتر 2/0 میکرو‏مولار رد شده و مورد استفاده قرارگرفت. پس از پایان زمان انکوباسیون تعیین شده، محیط رویی از چاهک‏های پلیت خارج شده و به هر کدام از چاهک‏ها محلول MTT اضافه شد. آنگاه به‏مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتی‏گراد درون انکوباتور انکوبه شده تا بلورهای فورمازان تشکیل شوند. برای بررسی سنجش نوری فورمازون لازم است بلورهای نامحلول فورمازون به‏صورت محلول درآیند. برای این منظور پس از اتمام مدت زمان 4 ساعت، به هر یک از چاهک ها دی‏متیل سولفوکسید (DMSO)  اضافه می‏شود. در نهایت دانسیته نوری محلول درون هر چاهک با استفاده از دستگاه الیزا ریدر در طول موج 570 نانومتر سنجیده شد.  در این شرایط میزان جذب یا دانسیته نوری (OD) تابعی از MTT تبدیل شده به فورمازون است. در پایان میزان بقا سلولی با استفاده از فرمول زیر محاسبه می‏شود:

                                                                                  100×میانگین جذب نوری نمونه تیمار  = درصد بقا

                                                                                        میانگین جذب نوری نمونه کنترل

داده‏ها با آزمون آماری آنوای یک طرفـه و نـرم افـزارInStat-3  تحلیل شـدند. و هر آزمایش حداقل 3 مرتبه تکرار شد.

 

نتایج

تعیین اندازه نانوذرات

تکنیک DLS به طور گسترده برای تعیین اندازه نانوذرات در سوسپانسیون های کلوئیدی، در مقیاس نانو و زیر میکرون استفاده می شود. اساس این تکنیک بر مبنای حرکت براونی و روابط استوک-انیشتین است (23).

اندازه گیری ابعاد نانوذرات ساماریوم توسط روش پراکندگی دینامیکی نور (DLS) انجام شد. طبق نتایج بدست آمده اندازه نانوذرات ساماریوم سنتز شده به طور متوسط 2/69 نانومتر می باشدکه نشان دهنده اندازه مناسب آن ها به منظور استفاده در سیستم انتقال دارو می باشد. همچنین معیار پلی دیسپریسیتی (pI) نانوذرات نیز نشان دهنده توزیع یکنواخت و همگن نانوذرات است (شکل 1).

 

 

 

 

 

 

 

شکل 1:بررسی اندازه نانوذرات ساماریوم توسط روش پراکندگی دینامیکی نور

                                                                                         

تعیین گروه‏های عاملی جدید تشکیل شده در نانوذرات

بر اساس آنالیز انجام گرفته نتایج طیف سنجی فروسرخ (شکل 2) نشان می‏دهند که تعدادی از پیک‏های جذبی مشاهده شده در ترکیب ساماریوم در بازه‏های cm-1 63/484 تا cm-1 45/3350 می‏باشد که مربوط به گروه‏های آلکنی، آمین‏های آلیفاتیک(C-N)، آمین‏های نوع اول(N-H)، گروه‏های نیتریلی  و گروه‏های هیدروکسی آزاد (O-H) و آمیدها هستند. همچنین طیف جذبی مشاهده شده در عصاره گیاهزنجبیل در بازه cm-1 530 تا cm1 06/3392 قرار دارد که مربوط به گروه‏های عاملی آلکیل هالیدی (C-Cl , C-Br)، آمین‏های آلیفاتیک (C-N)، آمین‏های آروماتیک (C-N)، آلکان‏ها (C-H)، گروه‏های آروماتیکی C-C، گروه‏های آمینی نوع اول (N-H)، آلکین‏ها، آلکان‏ها، فنول‏ها و الکل‏ها می‏باشد. طیف جذبی در نانوذرات ساماریوم شامل بازه جذبی از cm-1 22/542 تا cm-1 76/3414 به‏دست آمده است که بیان‏گر گروه‏های آلکیل هالیدی(C-Br) ، آلکین‏ها، گروه‏های آروماتیکی C-H ، آمین‏های آلیفاتیک (C-N)، گروه‏های آلدهیدی، آلکان‏ها ، گروه‏های آمیدی، آمین‏های نوع اول و دوم می‏باشد.

با مقایسه طیف جذبی به‏دست آمده از محلول ساماریوم و نانو ذرات ساماریوم، طیف جذبی در بازه cm-1 76/3414 مربوط به گروه‏های آمیدی و آمین‏های نوع اول و دوم، طیف جذبی در بازه 17/2927 مربوط به آلکان‏ها، طیف جذبی در بازه 74/1260 تا 29/1534 مربوط به گروه‏های الکلی، اسیدهای کربوکسیلیک، گروه‏های استری و اتری و ترکیبات نیتروژنی(N-0)، طیف جذبی در بازه cm-1 06/1073 مربوط به آمین‏های آلیفاتیک و وجود گروه‏های آلیکل هالیدی در بازه cm-108/839 نشان‏دهنده‏های تشکیل گروه‏های عاملی فعال جدید در نانوذرات ساماریوم می‏باشد که در محلول ساماریوم کلراید وجود ندارد و بیان‏گر پوشش این نانوذرات توسط عصاره گیاه زنجبیل و پایدار شدن آن‏ها می‏باشد.

 

 

 

 

 

 

                           

 

شکل 2: طیف جذبی FT-IR از عصاره گیاه زنجبیل، نانوذرات ساماریوم و محلول ساماریوم کلراید

 

تعیین مورفولوژی نانوذرات

تصاویر میکروسکوپ الکترونی روبشی مربوط به نانوذرات ساماریوم سنتز شده به کمک عصاره گیاه زنجبیل در (شکل 3) نشان داده شده است. با توجه به شکل نانوذرات با ساختارهای تقریبا همگن و از نظر شکل دارای ذرات کروی شکل (کلوئیدال) می‏باشند و اندازه نانوذرات تقریبا 60 نانومتر می‏باشد که در تایید نتایج حاصل از DLS می‏باشد.

           

 

 

 

 

 

شکل 3: نتایج حاصل از میکروسکوپ الکترونیFE-SEM

مطالعات سمیت سلولی نانوذرات سنتزی

نانوذرات ساماریوم سنتز شده با روش شیمی سبز و به کمک عصاره زنجبیل با استفاده از روش رنگ سنجی MTT در یک الگوی وابسته به زمان و دوز موجب القای مرگ برروی رده سلولی HCT116 شده‏اند. درصد بقای سلولی سلول‏های تحت تیمار با نانوذرات ساماریوم در غلظت‏های 0، 7/2، 75/6، 5/13، 27، 54 و 108میکرومولار پس از مدت زمان 24  ساعت انکوباسیون نسبت به گروه کنترل به‏ترتیب برابر با 100، 69/83، 49/83، 02/79، 73، 02/59 و 47 درصد و پس از 48 ساعت انکوباسیون به ترتیب 93/75، 35/70، 51/69، 27/63، 81/60 و 10/41 درصد محاسبه شده است. غلظتی از نانوذرات ساماریوم که منجر به القای 50 درصد مرگ سلولی پس از طی 24 و 48 ساعت انکوباسیون شده است به‏ترتیب برابر 90 و 81 میکرومولار (که به‏ترتیب معادل 1/23 و 7/20 میکروگرم بر میلی لیتر  است) می‏باشد (نمودار 1).

همچنین درصد بقای سلولی سلولهای سرطانی HCT116 پس از تیمار با عصاره گیاه زنجبیل در غلظت‏های 0، 45/0، 12/1، 25/2، 5/4 و 9 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر پس از 24 ساعت انکوباسیون نسبت به گروه کنترل به‏ترتیب برابر100، 66/92، 42/87، 22/83، 80، 89/49 و 09/28 محاسبه شده است. غلظتی از عصاره که موجب القای 50 درصد مرگ سلولی پس از مدت زمان 24 ساعت  انکوباسیون شده است برابر 9 میلی‏گرم بر میلی‏لیتر می‏باشد (نمودار 2).

 

 

نمودار1: اثر غلظت های مختلف نانوذرات ساماریوم بر درصد بقا و رشد سلول های  HCT116پس از 24 (مربع توپر) و 48 (دایره توپر) ساعت تیمار بر اساس رنگ سنجی MTT

 

 

 

 

 

 

 

 

 

نمودار 2: مقایسه اثر غلظت‏های مختلف از عصاره گیاه زنجبیل بر درصد بقا و رشد سلول‏های HCT116 پس از 24 ساعت تیمار بر اساس رنگ سنجی MTT

 

بحث

فناوری نانو در حال حاضر به‏دلیل پتانسیل و تاثیر اقتصادی بی‏نظیر خود یکی از برترین رشته‏های تحقیقی در بسیاری از کشورهاست (1). به‏منظور غلبه بر محدودیت‏های سیستم‏های انتقال دارویی مرسوم در درمان بیماری‏ها، نانوذرات به‏سرعت تولید و توسعه یافتند و به‏عنوان یک روش درمانی مجزا برای معالجه سرطان معرفی شده‏اند. روش شیمی درمانی معمول دارای برخی عوارض جانبی جدی از جمله آسیب به سیستم ایمنی بدن و سایر ارگان می‏باشد. در نتیجه به‏دلیل هدف قرار دادن غیراختصاصی ، عدم حلالیت و عدم توانایی داروها در ورود به هسته تومورها، منجر به اختلال در درمان از طریق کاهش دوز دارو و یا میزان بقای پایین دارو می‏شود. بنابراین، فناوری نانو امکان دسترسی مستقیم به سلول‏های سرطانی را به‏صورت انتخابی و همچنین با افزایش متمرکز نمودن داروها در مکان خاص و افزایش جذب سلولی داروها فراهم کرده است (8). استفاده از ترکیبات فعال زیستی مشتق شده از گیاهان در رشته پزشکی به‏منظور درمان بیماری‏ها به‏ویژه سرطان و نیز تمرکز دانشمندان در درمان سرطان، تحقیقات را به‏سمت فناوری نانو که ترکیبی از نانو داروها و سرطان است سوق داده است. انواع متفاوتی از ترکیبات فعال شیمیایی در گیاهان وجود دارد که دارای خاصیت‏های ضد سرطانی بسیار موثری می‏باشند که می‏توان به مهار تکثیر سلولی، آنژیوژنز، تخریب روند التهابی و القای آپوپتوزیس در سلول‏های سرطانی را نام برد (27). سنتز نانوذرات با استفاده از مواد مبتنی بر گیاهان (سنتز سبز)، به‏دلیل آسان و مقرون به‏صرفه بودن سنتز، تولید محصولات غیرسمی، پایدار و سازگار با محیط زیست، می­تواند مناسب‏ترین روش برای سنتز در نظر گرفته شود. در این روش متابولیت‏های گیاهی مانند پلی فنول‏ها، فلاوونوئیدها، آلکالوئیدها و ترپنوئیدها نفش اصلی در سنتز نانوذرات برعهده دارند و پایدارکننده و احیا کننده نانوذرات سنتز شده می‏باشند (28،29) در این پژوهش از عصاره گیاه زنجبیل برای سنتز نانوذرات ساماریوم استفاده شده است. از خواص درمانی زنجبیل می‏توان به‏کاربرد آن در درمان بیماری‏هایی مانند آرتریت روماتوئید، آرتروز، دردهای عضلانی، تب، بیماری‏های ویروسی و عفونی، گلودرد، حالت تهوع، یبوست، سو هاضمه و بیماری‏های التهابی روده‏ای اشاره نمود. همچنین  فعالیت‏های آنتی اکسیدانتی، خواص ضدسرطانی، اثرات ضددیابتی و چربی و اثرات سودمند آن بر روی مجاری و دستگاه گوارشی و همچنین نقش موثر آن در جلوگیری و درمان سرطان دستگاه گوارش به‏خوبی اثبات شده است. مواد تشکیل دهنده فعال موجود در زنجبیل شامل 70-60 درصد کربوهیدرات، 8-3 درصد فیبرهای خام، 9 درصد پروتئین، 8 درصد خاکستر، 6-3 درصد اسیدهای چرب و 3-2 درصد روغن‏های غیر فرار می‏باشد. ترکیبات فنولی زنجبیل مانند gingerolها به‏ویژه ترکیب 6-gingerol در بسیاری از مدل‏های کارسینوژنز آزمایشگاهی فعالیت‏های جلوگیری کننده از سرطان را نشان داده‏اند (30). در این مسیر تعیین ویژگی‏های نانوذرات سنتز شده در محلول قبل از ارزیابی سمیت در شرایط in vitro از اولویت بالایی برخوردار است. به‏منظور تعیین دقیق ویژگی‏های نانوذرات سنتز شده از روش‏های آنالیزی مختلفی استفاده شده است. به‏منظور تعیین اندازه نانوذرات ساماریوم و توزیع زیستی آن‏ها از تکنیک پراکنش دینامیکی نور یا طیف‏سنجی همبستگی ­_فوتون (DLS) استفاده گردید. از این تکنیک به‏طور معمول برای آنالیز اندازه و توزیع اندازه نانوذرات، کلوئیدها، پلیمرها و پروتئین‏ها بر اساس رابطه استوک- نیشتین استفاده می‏شود. نتایج حاصل از آنالیز نانوذرات ساماریوم توسط تکنیک DLS نشان داده است که اندازه نانوذرات سنتز شده حدود 69 نانومتر می‏باشد. ویژگی‏های مورفولوژیکی نانوذرات ساماریوم سنتز شده با عصاره گیاه زنجبیل با میکروسکوپ الکترونی FE-SEM  بررسی شد، که بیان‏گر مورفولوژی همگن وکروی نانوذرات می‏باشد که برای مطالعات سلولی مناسب هستند. به‏منظور شناسایی بیومولکول‏هایی که مسئول احیا، تثبیت و یا عوامل سرپوش‏گذار بر سطح نانوذرات می‏باشند از آنالیز طیف سنجی FT-IR  استفاده گردید. در واقع این آنالیز برای شناسایی گروه‏های عملکردی جدید تشکیل شده در نانوذرات ساماریوم استفاده شده است. بررسی‏های حاصل از مطالعات FT-IR  نشان داد که  نوارهای ارتعاشی (C-Cl , C-Br) ، (C-N) ، (C-N) ، (C-H) ، C-C ، (N-H)، مربوط به گروه‏های عاملی آلکیل هالیدی، آمین‏های آلیفاتیک، آمین‏های آروماتیک، آلکان‏ها، گروه‏های آمینی نوع اول، آلکین‏ها، آلکان‏ها، فنول‏ها و الکل‏ها در عصاره گیاه زنجبیل می‏باشد. همچنین طیف جذبی حاصل از FT-IR برای محلول ساماریوم کلراید حضور گروه‏های آلکنی، آمین‏های آلیفاتیک (C-N) ، آمین‏های نوع اول (N-H)، گروه‏های نیتریلی و گروه‏های هیدروکسی آزاد (O-H) و آمیدها  را در این محلول نشان داده است که این گروه‏های عاملی مسئول تثبیت نانوذرات ساماریوم می‏باشند. پس از سنتز نانوذرات ساماریوم، پیک جذبی حاصل از FT-IR برای نانوذرات ساماریوم نشان داد که گروه‏های عاملی آمیدی و آمین‏های نوع اول و دوم، آلکان‏ها، گروه‏های الکلی، اسیدهای کربوکسیلیک، گروه‏های استری و اتری و ترکیبات نیتروژنی (N-0) ، آمین‏های آلیفاتیک و گروه‏های آلکیل هالیدی در نانوذرات تشکیل شده‏اند. با توجه به نتایج حاصل از طیف FT-IR می‏توان به تفاوت ایجاد شده در پیک به‏دست آمده از نانو ذرات ساماریوم سنتز شده با پیک حاصل از عصاره گیاه زنجبیل و همچنین پیک مربوط به محلول ساماریوم کلراید پی‏برد که بیان‏گر سرپوش‏گذاری و پایداری نانوذرات ساماریوم سنتز شده با عصاره گیاه زنجبیل توسط گروه‏های فعال عملکردی می‏باشد. نتایج حاصل از طیف سنجی FT-IR در این پژوهش و پژوهش‏های انجام شده دیگر در زمینه سنتز نانوذرات ساماریوم با استفاده از روش شیمی سبز و همچنین روش‏های دیگر سنتز، مطابقت دارد. در پژوهشی که Sone و همکارانش بر روی نانوذرات ساماریوم اکساید که به‏روش شیمی سبز سنتز شدند انجام داده‏اند، برای تعیین گروه‏های عاملی جدید تشکیل شده در نانوذرات ساماریوم نیز، از تکنیک FT-IR استفاده نمودند (31).

نتایج فعالیت مهاری رشد در دو زمان انکوباسیون 24 و 48 ساعت برای نانوذرات ساماریوم نشان داده است که رشد سلول‏ها در هر دو زمان انکوباسیون برای نانوذرات ساماریوم با افزایش غلظت دارو به‏شدت کاهش یافته است به‏طوری‏که یک کاهش وابسته به دوز و زمان را بر روی میزان بقای سلول‏ها نشان داده‏اند. همچنین نتایج مقدار Cc50 نشان داد نانو ذرات ساماریوم سنتز شده به‏کمک عصاره گیاه زنجبیل، در دوزهای بسیار پایین‏تری نسبت به محلول ساماریوم کلراید قدرت کشندگی دارد. مقادیر Cc50 برای نانوداروی  ساماریوم پس از 24 ساعت تیمار 81  و پس از 48 ساعت تیمار 90 میکرومولار محاسبه شده است. در حالی‏که برای محلول ساماریوم کلراید با وجود اینکه پس از 24 ساعت تیمار کاهش رشد سلول‏ها مشاهده می‏شود، اما مقادیر Cc50 قابل مشاهده نمی‏باشد. به‏عبارت‏دیگر محلول ساماریوم کلراید کمتر از 40 درصد توان کشندگی سلول‏های سرطانی را دارد و غلظتی از این ترکیب که موجب القای 50 درصد مرگ و میر در سلول‏های سرطانی نماید، برای ترکیب ساماریوم کلراید به‏حد نصاب نرسیده است. نتایج فعالیت مهاری رشد برای عصاره گیاه زنجبیل پس از 24 ساعت نیز نشان دهنده کاهش شدید رشد سلول‏های سرطانی است. همچنین مقدار Cc50 برای عصاره زنجبیل حدود 9 میلی‏گرم بر لیتر می‏باشد. بنابراین می‏توان استدلال نمود عامل مهمی که موجب افزایش نفوذ و ورود و اثرپذیری بیشتر نانوذرات ساماریوم بر روی سلول‏های سرطانی شده است، وجود پوشش گیاهی زنجبیل و اندازه دارو در سطح نانو می‏باشد. در راستای نتایج به‏دست آمده از مطالعه حاضر نانوذرات سنتز شده با عصاره گیاه زنجبیل دیگری نیز توسط محققین بررسی شده است که این ترکیبات دارای فعالیت‏های ضد توموری بوده‏اند (30-32). به‏عنوان مثال در مطالعه‏ای که Zhang و همکارانش بر روی نانولیپیدهای مشتق شده از زنجبیل لود شده با داروی دوکسوروبیسین با اندازه 100 نانومتر در درمان سرطان کولون انجام داده‏اند، نشان داده‏اند که نانوحامل‏های مشتق از زنجبیل به‏طور قابل توجهی توسط سلول‏های سرطانی کولون جذب می‏شوند. همچنین زیست سازگاری بسیار عالی را نشان داده‏اند (28). علاوه بر این، نانوذرات به‏طور بسیار موفقیت آمیزی رشد سلول‏های سرطانی کولون رده سلولی Colon-26 را در مدل‏های زنوگرافت توموری مهار می‏کنند (32). همچنین Ascar و همکارانش در بررسی اثرات سمیت سلولی و آنتی اکسیدانتی نانوذرات طلای سنتز شده با گیاه زنجبیل با اندازه 5/29 نانومتر بر روی سلول‏های سرطانی تیروئید رده سلولی FTC-133 نشان داده‏اند که این نانوذرات به‏طور بسیار قابل ملاحظه‏ای موجب کاهش زنده ماندن سلول‏ها به‏صورت وابسته به دوز در مدت زمان 48 ساعت می‏شود.  بررسی درصد بقای سلولی سلول‏های FTC-133 به‏روش رنگ سنجیMTT نشان داده است که این نانوذرات کروی در غلظت 400 میکروگرم بر میلی‏لیتر موجب القای 75 درصد مرگ سلولی در این رده سلولی شده‏اند (29).

 

نتیجه­گیری

به‏طور خلاصه نتایج ما نشان داده است، با توجه به این‏که برای سنتز نانوذرات ساماریوم از روش شیمی سبز استفاده شده است، نانوذرات سنتز شده زیست سازگار با محیط زیست بوده و دارای عوارض و خطرات بسیارکمتری نسیت به روش‏های فیزیکی و شیمیایی سنتز نانوذرات برخوردار می‏باشند، بنابراین قادر خواهند بود انتقال دارو را از نانوذات ساخته شده به‏روش‏های فیزیکی و شیمیایی به‏سمت نانوذرات مشتق شده از ترکیبات زیست فعال گیاهی تغییر دهند. مطالعات سلولی و نتایج حاصل از بررسی سمیت سلولی نانوذرات ساماریوم نشان داده است که نانوذرات ساماریوم قابلیت القای مرگ سلولی در سلول‏های سرطانی کلورکتال رده سلولی HCT116 در یک الگوی وابسته به دوز و زمان هستند. علاوه برآن به‏دلیل استفاده از عصاره گیاه زنجبیل برای سنتز نانوذرات ساماریوم به‏عنوان عامل پوشش دهنده، پایدارکننده و کاهنده نانوذرات، خاصیت ضدسرطانی نانوذرات نسبت به محلول ساماریوم بسیار بیشتر است. این مطالعه می‏تواند چشم اندازهای فعلی در مورد سیستم‏های انتقال نانودارویی را گسترش داده و همچنین می‏تواند به‏عنوان پایه و اساس یک رویکرد انتقال دارو با سمیت کمتر مطرح باشد.

 

تشکر و قدردانی

نتایج مطالعه اخیر که مستخرج از پایان نامه کارشناسی ارشد خانم زهرا قدرتی بوده است. بدین‏وسیله نهایت تشکر و قدردانی خود را از حمایت‏های معاونت محترم پژوهشی دانشگاه خوارزمی اعلام می‏داریم.

1. Kabir E, Kumar V, Kim KH, Yip AC, et al. Environmental impacts of nanomaterials. J Environ Manage. 2018; 225: 261-71.

2. Jain A, Ranjan S, Dasgupta N, Ramalingam C. Nanomaterials in food and agriculture: an overview on their safety concerns and regulatory issues. Crit Rev Food Sci. 2018; 58(2): 297-317.

3. Delma BT, Vijila B, Jaya M. Green Synthesis of Copper and Lead Nanoparticles using Zingiberofficinale stem extract. IJSRP. 2016; 6(11): 134-7.

4. Saratale RG, Saratale GD, Shin HS, Jacob JM, et al. New insights on the green synthesis of metallic nanoparticles using plant and waste biomaterials: current knowledge, their agricultural and environmental applications. Environ Sci Pollut Res. 2018; 25(11): 10164-83.

5. Salisbury RL, Agans R, Huddleston ME, Snyder A, et al. Toxicological Mechanisms of Engineered Nanomaterials: Role of Material Properties in Inducing Different Biological Responses. InHandbook of Developmental Neurotoxicology. Academic Press. 2018; 237-249.

6. Pietroiusti A, Stockmann‐Juvala H, Lucaroni F, Savolainen K. Nanomaterial exposure, toxicity, and impact on human health. Wiley Interdiscip Rev Nanomed Nanobiotechnol. 2018; 10(5): e1513.

7. Parveen K, Banse V, Ledwani L. Green synthesis of nanoparticles: Their advantages and disadvantages. AIP Conf Proc. 2016; 1724 (1): 020048.

8. Sutradhar KB, Amin ML. Nanotechnology in cancer drug delivery and selective targeting. ISRN Nanotechnology. 2014; 2014: 1-12.

9. Donovan MG, Selmin OI, Doetschman TC, Romagnolo DF. Mediterranean diet: prevention of colorectal cancer. Front Nutr. 2017; 4: 59.

10. Mundade R, Imperiale TF, Prabhu L, Loehrer PJ, et al. Genetic pathways, prevention, and treatment of sporadic colorectal cancer. Oncoscience. 2014; 1(6): 400.

11. Kuipers EJ, Grady WM, Lieberman D, Seufferlein T. COLORECTAL CANCER. Nat Rev Dis Primers. 2015;1:15065.

12. Mármol I, Sánchez-de-Diego C, Pradilla Dieste A, Cerrada E, et al. Colorectal carcinoma: a general overview and future perspectives in colorectal cancer. Int J Mol Sci. 2017; 18(1):197.

13. Obuch JC, Ahnen DJ. Colorectal cancer: genetics is changing everything. Gastroenterol Clin. 2016; 45(3): 459-476.

14. Markman JL, Rekechenetskiy A, Holler E, Ljubimova JY. Nanomedicine therapeutic approaches to overcome cancer drug resistance. Adv Drug Deliv Rev. 2013; 65(13-14):1866-79.

15. Peer D, Karp JM, Hong S, Farokhzad OC, et al. Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy. Nat nanotechnol. 2007; 2(12): 751.

16. Srinivasan K. Ginger rhizomes (Zingiber officinale): A spice with multiple health beneficial potentials. PharmaNutrition. 2017; 5(1): 18-28.

17. Prasad S, Tyagi AK. Ginger and its constituents: role in prevention and treatment of gastrointestinal cancer. Gastroenterology research and practice. 2015; 2015: 142979.

18. Wang CZ, Qi LW, Yuan CS. Cancer chemoprevention effects of ginger and its active constituents: Potential for new drug discovery. Am J Chin Med. 2015; 43(07): 1351-63.

19. Ciobanu CS, Iconaru SL, Popa CL, Motelica-Heino M, et al. Evaluation of samarium doped hydroxyapatite, ceramics for medical application: Antimicrobial activity. J Nanomateri. 2015; 2015: 14.

20. Zhang Y, Wang X, Su Y, Chen D, et al. A doxorubicin delivery system: samarium/mesoporous bioactive glass/alginate composite microspheres. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 2016; 67: 205-13.

21. Kostova I, Valcheva‐Traykova M. New samarium (III) complex of 5‐aminoorotic acid with antioxidant activity. ‎Appl Organomet Chem. 2015; (12): 815-24.

22. Mollarazi E, Jalilian AR, Johari‐daha F, Atyabi F. Development of 153 Sm‐folate‐polyethyleneimine conjugated chitosan nanoparticles for targeted therapy. J Labelled Compd Rad. 2015; 58(8): 327-35.

23. Pal SL, Jana U, Manna PK, Mohanta GP, et al. Nanoparticle: An overview of preparation and characterization. J appl pharm sci. 2011; 1(6): 228-34.

24. Patra JK, Baek KH. Green nanobiotechnology: factors affecting synthesis and characterization techniques. J Nanomater. 2014; 2014: 1-12.

25. Meng C, Teng Y, Jiang X. Raddeanin A Induces Apoptosis and Cycle Arrest in Human HCT116 Cells through PI3K/AKT Pathway Regulation In Vitro and In Vivo. Evid-Based Complementary Altern Med. 2019; 2019:1-12.

26. Van Meerloo J, Kaspers GJ, Cloos J. Cell sensitivity assays: the MTT assay. Methods Mol Biol. 2011; 731: 237-245.

27. Tharwat MM, Attia MS, Alghamdi MS, Mahros AM. Ultra-Sensitive Nano Optical Sensor Samarium-Doxycycline Doped in Sol Gel Matrix for Assessment of Glucose Oxidase Activity in Diabetics Disease. J fluoresc. 2017; 27(5): 1885-1895.

28. Zhang M, Xiao B, Wang H, Han MK, et al. Edible ginger-derived nano-lipids loaded with doxorubicin as a novel drug-delivery approach for colon cancer therapy. Mol Ther. 2016; 24(10):1783-96.

29. Ascar IF, Al-A'Araji SB, Alshanon AF. Cytotoxicity and Antioxidant Effect of Ginger Gold Nanoparticles on Thyroid Carcinoma Cells. J Pharm Sci and Res. 2019; 11(3):1044-51.

30. Tharwat MM, Attia MS, Alghamdi MS, Mahros AM. Ultra-Sensitive Nano Optical Sensor Samarium-Doxycycline Doped in Sol Gel Matrix for Assessment of Glucose Oxidase Activity in Diabetics Disease. J fluoresc. 2017; 27(5):1885-95.

31. Ascencio JA, Rincon AC, Canizal G. Synthesis and theoretical analysis of samarium nanoparticles: perspectives in nuclear medicine. J Phys Chem B. 2005; 109(18):8806-12.

32. Hariharan MS, Sivaraj R, Ponsubha S, Jagadeesh R, Enoch IV. 5-Fluorouracil-loaded β-cyclodextrin-carrying polymeric poly (methylmethacrylate)-coated samarium ferrite nanoparticles and their anticancer activity. J Mat Sci. 2019; 54(6): 4942-51.