تولید آزمایشگاهی فرم فعال ایمونوتوکسین هدف‌گذاری شده برعلیه گیرنده فاکتور محرک رشد کلونی گرانولوسیت

نوع مقاله: علمی - پژوهشی

نویسندگان

1 - دانشگاه صنعتی مالک اشتر ، تهران ، ایران.

2 - دانشگاه صنعتی مالک اشتر ، تهران ، ایران

چکیده

هدف: هدف از مطالعه‌ی حاضر، تولید پروتئین نوترکیب هیبریدی DT389GCSF به فرم فعال محلول در باکتری E. coli Bl-21(DE3) ، تخلیص و ارزیابی سمیت سلولی آن می‌باشد.
مواد و روش‏ها: پروتئین DT389GCSF، با دنباله‌ی 6 هیستیدین در باکتری E. coli BL-21(DE3)  در دمای 28 درجه سانتیگراد به ‏فرم محلول بیان شد. سپس از طریق ستون کروماتوگرافی تمایلی نیکل سفاروز تخلیص شد. در نهایت عملکرد پروتئین نوترکیب خالص شده با استفاده از آزمون  TTM  بر روی سلول سرطانی 06-LH مورد ارزیابی قرار گرفت.
نتایج: میزان بیان و خلوص پروتئین DT389GCSF با استفاده از نرم‌افزار Image J، به‏ترتیب در حدود 12 و 80 درصد تخمین زده شد. میزان IC50 پس از 48 ساعت قرارگیری پروتئین DT389GCSF در معرض رده‌ی سلولی، در حدود 000019/0±00017/0 مولار بود.
نتیجه‏گیری: با کاهش دما و استفاده از مکانیسم درون سلولی، می‌توان بازتاخوردگی پروتئین هیبریدی DT389GCSF را به‏ شکل مناسب و به ‏فرم فعال مشاهده نمود. در نتیجه در مراحل تولید آزمایشگاهی ایمونوتوکسین‏های مربوطه می‏توان با استفاده از این روش، از مراحل تولید به ‏صورت اینکلوژن‌بادی صرف‏نظر کرد.
 

تازه های تحقیق

-

کلیدواژه‌ها


مقدمه

سرطان، یک عامل مهم و اساسی مرگ و میر در جهان است. با توجه به مشکلات استفاده از روش‌های مرسوم شیمی‌درمانی و پرتودرمانی از جمله مقاومت سلول‌های سرطانی به برخی داروهای شیمی‌درمانی و دارا بودن عوارض جانبی و سمیت این داروها بر روی بافت‌های سالم، ارائه‌‌ی راهکارهای جدید برای درمان اختصاصی و موثرتر سرطان ضروری به‏نظر می‌رسد (1-3). امروزه استفاده از پروتئین‌های نوترکیب که بتواند بافت‌ها و سلول‌های اختصاصی را ردیابی، شناسایی و نابود کند، مورد توجه محققین می‌باشد. نتیجه تحقیقات صورت گرفته، دستیابی به نوعی پروتئین هیبریدی هوشمند به ‏نام ایمونوتوکسین است. دنیلوکین دیفتیتوکس یا اونتاک (DT389IL2)، اولین ایمونوتوکسین نوترکیب است که در سال 1999، توانست از سازمان غذا و داروی آمریکا تاییدیه دریافت کند. این ایمونوتوکسین با ایده‏برداری از توکسین دیفتری طراحی شده است. که در آن بخش اتصالی توکسین دیفتری حذف و جایگزین آن اینترلوکین 2 انسانی شده است (4-6). در ساختار  ایمونوتوکسین DT389GCSF توکسین دیفتری (DT) ناقص (بدون بخش اتصالی) به فاکتور محرک رشد  کلونی گرانولوسیت یا G-CSF  به‏ روش مهندسی ژنتیک متصل شده است. توکسین دیفتری طبیعی، یک پروتئین تک زنجیره‌ای با 535 ریشه‌ی آمینواسیدی می‌باشد که به‌وسیله گونه‌های مولد سم کورینه باکتریوم دیفتریا تولید می‌شود و از نظر ساختاری از سه دمین تشکیل شده است: دمینA  (آمینو اسیدهای 193-1) با عملکرد آنزیمی آدنوزین دی‌فسفات‌ ریبوزیل ترانسفرازی، دمین T (آمینواسیدهای 378-205) با عملکرد تشکیل کانال و کمک به فرآیند انتقال دمین آنزیمی به سیتوزول و دمین B (آمینواسیدهای 535-386) با عملکرد اتصال به گیرنده می‏باشد (7-12). در طراحی DT389GCSF، دمین B سم دیفتری در بخش انتهای کربوکسیل که محل اتصال توکسین دیفتری به گیرنده سلول است، با G-CSF جایگزین و برای سلولهای سرطان خون، هدف‏گذاری شده است. FSCG983TD   با   475 ریشه‌ی آمینواسیدی، از قطعه‌ی توکسین دیفتری  با 983 ریشه‌ی آمینواسیدی و توالی فاکتور محرک رشد گرانولوسیتی انسانی با 471 ریشه‌ی آمینواسیدی تشکیل یافته است که از طریق رابط پپتیدی 7 آمینواسیدی teMreS4ylGreS به‏هم متصل شده‌اند و به‏منظور سهولت در تخلیص، در انتهای ′5 به ′3 آن توالی 6 هیستیدین طراحی شده است (شکل 1).

 

 

شکل 1: تصویر شماتیک از دمین‏های توکسین دیفتری و ایمونوتوکسین DT389GCSF

 

پروتئین هیبریدی DT389GCSF از جایگاه گیرنده‌ی سیتوکین G-CSF، که عمدتا توسط اندوتلیال و فیبروبلاست‏ها تولید می‌شود و تکثیر و تمایز سلول های خونی را تحریک می‌کند، به سلول‌های سرطانی اتصال می‌یابد (13-15). گیرنده‌ی GCSF به‏همراه اینترلوکین-3 (IL-3)  و فاکتور محرک رشد کلنی ماکروفاژ (GM-CSF) بر روی سطح سلول‌های سرطانی میلوئیدی حاد یا AML (Acute Meyloid Lukemia) به میزان زیادی تولید می‌شوند و در نتیجه این گیرنده‌ها می‌توانند هدفی برای توکسین‌ درمانی سرطان AML باشند (16, 17).

یکی از گلوگاه‏های اصلی در تولید پروتئین‌های نوترکیب با منشا پروکاریوتی، مسئله‌ بازیابی فرم فعال و بازتاخورده‌ آن‏ها در شرایط اینکلوژن‌بادی است. چرا که در سیتوپلاسم باکتری‌ها، پروتئین‌ها به‏دلیل بیان بالا و نیز عدم وجود شرایط لازم برای تاخوردن صحیح به‏صورت اینکلوژن‌بادی در می‌آیند. درنتیجه برای به‌دست آوردن فرم فعال پروتئین، نیاز است که با انتخاب روشی مناسب بازتاخورده شوند. یکی از ساده‌ترین روش‌ها برای به‏حداقل رساندن شکل‌گیری اینکلوژن‌بادی‌ها کاهش دما است. عموما بیان در دمای پایین منجر به افزایش حلالیت و تاخوردن صحیح می‌شود. این امر ناشی از این مسئله است که برهمکنش‌های هیدروفوبیک که تعیین‏کننده اینکلوژن‌بادی‌ها هستند وابسته به دما می‌باشند. از سویی احتمالا کاهش دما سرعت رونویسی، ترجمه و بازتاخوردن را پایین می‌آورد و بنابراین اجازه شکل‌گیری ساختار صحیح را می‌دهد. همچنین در دمای پایین افزایش بیان و فعالیت شماری از چاپرون‌ها درE. coli گزارش شده است. همچنین گزارشات نشان می‌دهد که پروتئازهای شوک حرارتی که طی افزایش بیان القا می‌شوند در شرایط دمایی پایین فعالیت کمتری پیدا می‌کنند.  بنابراین این مسئله منجر به کاهش قابل توجه تخریب پروتئین نوترکیب می‏شود (5, 18). براین اساس در مطالعه‌ حاضر، به‏منظور حذف مرحله‌ی بازتاخوردگی پروتئین هیبریدی نوترکیب DT389GCSF، در باکتری E. coli BL-21(DE3) به‏فرم محلول بیان و سپس از طریق ستون تمایلی نیکل سفاروز تخلیص گردید و عملکرد آن با استفاده از سنجش سمیت DT389GCSF بر روی رده‌ی سلولی لوکمیای انسانی HL-60، مورد مطالعه قرار گرفت.

 

مواد و روش‌ها

مواد شیمیایی و زیستی مورد استفاده: مواد شیمیایی مورد استفاده شامل پودر آماده محیط کشت LB از شرکتApplichem ، ایمیدازول، بیس‌اکریل‌آمید، مرکاپتواتانول، بروموفنل‌بلو، کوماسی‌بلو R250، اسیداستیک‌گلاسیال و متانول از شرکت Merck تهیه گردید. تریس‌باز، ایزوپروپیل-بتا-دی-1-تیوگالاکتوپیرانوزید (IPTG)، آمونیوم‌پرسولفات (APS) و پلی‌اکریل‌آمید از شرکت سیناژن تهیه شد. آمونیوم‌کلرید، سدیم‌دودسیل‌سولفات (SDS)، از شرکت  Aldrich-Sigma خریداری شد. فنیل‌متان‌سولفونیل‌فلوراید (PMSF) از شرکت Fluka و رزینChelating Sepharose Fast Flow  از شرکت GE Healthcare Life Sciences و محیط کشت RPMI 1640 و سرم جنین‌گاوی (FBS) و پنی‌سیلین از شرکت Gibco تهیه شد.

باکتری E. coli BL-21(DE3) حاوی پلاسمید pET-  DT389GCSF  که در تحقیقات قبلی بدست آمده بود، مورد استفاده قرار گرفت (8, 11). رده‌ی سلولی لوکمیای انسانی HL-60 (PCC No.C217 ) از انیستیتو پاستور ایران خریداری شد.

بیان و تخلیص پروتئین DT389GCSF: به‏میزان 50 میکرولیتر از بانک مربوط به باکتریE. coli (BL21) ، حاوی وکتور pET-DT389GCSF در 20 میلی‌لیتر محیط LB-Broth حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین با غلظت نهایی 100 میکروگرم در میلی‏لیتر، در شرایط استریل کشت داده شد. پس از تلقیح، درون شیکر انکوباتور 200 دور در دقیقه و دمای 37 درجه ‏سانتی‏گراد به‏مدت یک شب گرماگذاری­ شد. به‏منظور تازه­سازی کشت، محیط کشت حاوی باکتری رشد یافته به 200 میلی‌لیتر محیط کشت LB-Broth، حاوی آنتی­بیوتیک آمپی­سیلین ، اضافه و تا رسیدن به جذب 7/0 در طول موج 600 نانومتر، درون شیکر انکوباتور 200 دور در دقیقه و دمای 37 درجه ‏سانتی‏گراد، گرماگذاری شد. پس از رشد باکتری و رسیدن به جذب نوری مورد نظر، جهت القا به‏میزان 200 میکرولیتر IPTG، 1 مولار با غلظت نهایی 1 میلی­مولار به محیط کشت اضافه و در شیکر انکوباتور با دمای 28، 200 درجه‏سانتی‏گراد دور در دقیقه، گرماگذاری گردید. پس از گذشت 4 ساعت از القا، محیط­ کشت، طی سانتریفوژ (8000 دور در دقیقه) به‏مدت 5 دقیقه از کشت سلولی رسوب­گیری گردید. برای ارزیابی میزان بیان به‏وسیله روش SDS-PAGE، نمونه‌های قبل از القا و پس از القا برداشت شد. پس از انجام  SDS-PAGE، درصد بیان پروتئین توسط نرم‌افزار Image J، مورد بررسی قرار گرفت. این نرم افزار نوعی نرم افزار قدرتمند برای آنالیز تصاویر ژل الکتروفورز از منظر نحوه توزیع باندهای موجود در ژل می‏باشد. میزان بیان پروتئین در آن براساس دانسیته باند ظاهر شده و مقایسه آن با سایر باندها، تخمین زده می‏شود. خالص‏سازی پروتئین به‏جهت داشتن دنباله‌ی هیستیدینی با ستون کروماتوگرافی تمایلی Ni-NTA، انجام گرفت. به‏منظور شکست سلولی به‏روش سونیکاسیون، رسوب سلولی در یخ قرار داده شده و به‏ازای هرگرم رسوب، 10 میلی لیتر بافر تعادل حاوی ( ایمیدازول50 میلی مولار، تریس 20 میلی مولار، کلرید سدیم 5/0 مولار، PMSF 1 میلی مولار در pH 7.8) اضافه و به‏منظور مخلوط شدن کامل و ایجاد سوسپانسیون، از دستگاه هموژنایزر استفاده شد. سلول­ها در دستگاه سونیکاتور به‏مدت 10 دقیقه، در 10 سیکل، با توان200 وات شکسته شدند. سوسپانسیون مذکور، به‏مدت 25 دقیقه، در دمای 4 درجه ‏سانتی‏گراد و با 13000 دور در دقیقه، سانتریفیوژ و پس از آن، محیط رویی که حاوی پروتئین محلول بود از رسوب، جداسازی شد. برای آماده‏سازی ستون‌های کروماتوگرافی، ابتدا رزین Chelating Sepharose Fast Flow با سولفات نیکل 2/0 مولار شارژ شد. پس از مرحله‌ی عبور پروتئین از ستون، پروتئین اتصال یافته‌ محلول به رزین، با ایجاد شیب غلظت 50 تا 700 میلی‌مولار ایمیدازول از آن جداسازی گردید. در این مرحله نمونه‏های حاوی پروتئین در حجم‏های 1500 میکرولیتر جمع‌آوری شدند. پس از تخلیص اولیه، به‏منظور فرمولاسیون ایمونوتوکسین مربوطه، تعویض بافر با PBS با استفاده از سنتریکون انجام و ایمیدازول از محلول پروتئینی حذف گردید. به‏منظور بررسی میزان بیان  و خلوص پروتئین­ نوترکیب DT389GCSF، از ژل 10 درصد SDS-PAGE استفاده شد و رنگ آمیزی با کوماسی بلو  R-250صورت گرفت.

سنجش سمیت سلولی DT389GCSF: سنجش سمیت سلولی DT389GCSF، از طریق قدرت کشندگی پروتئین در معرض سلول‌های لوکمیای انسانی HL-60 با آزمون MTT مورد ارزیابی قرار گرفت. تست MTT، یک روش رنگ‌سنجی برای سنجش میزان سمیت داروها می‌باشد که اساس آن تشکیل رنگ فورمازان به‏دلیل احیای ترکیبMTT  (دی‌متیل‌تیازول– ۲ و ۵ دی‌فنیل‌تترازولیوم بروماید) و یا دیگر نمک‌های تترازولیوم است. با گسستگی حلقه‌ تترازولیوم از طریق آنزیم‌های میتوکندریایی در سلول‌های زنده، بلورهای فورمازان غیرمحلول تشکیل می‌شود که بنفش رنگ می‌باشند. ایجاد این بلورها حاکی از فعال بودن آنزیم‌های زنجیره تنفسی و معیاری برای زنده بودن سلول‌ها است. با اندازه گیری میزان جذب توسط طیف سنجی در طول موج‌های معین، می‌توان درصد سلول‌های زنده  مانده را مشخص کرد. کشت سلول‌های HL-60 که از نوع محلول (غیرچسبنده) هستند در محیط کشت RPMI 1640  حاوی 10 درصد FBS و 1 درصد پنی‌سیلین-استرپتومایسین انجام گرفت. حجم 180 میکرولیتر از سوسپانسیون سلولی حاوی cell/ml103 به ‏هر چاهک پلیت 96 خانه اضافه شد. 20 میکرولیتر از مقادیر مختلفDT389GCSF  ( 600 و 450 و 300 و 60 و 0) میکروگرم به هر چاهک اضافه و در دمای  37 درجه سانتیگراد، 2OC 5 درصد به‏مدت 48 ساعت گرماگذاری شد. پس از 48 ساعت، 02 میکرولیتر محلول TTM  (با غلظت 5 میلی‌گرم در میلی‌لیتر SBP) به هر چاهک اضافه گردید و به‏مدت 4 ساعت در دمای 73 درجه سانتی‏گراد گرماگذاری شد. سلول‌های زنده به‏واسطه‌ی داشتن آنزیم ردوکتاز میتوکندری فعال، با تترازولیوم معرف TTM واکنش داده و ایجاد کریستال‌های فورمازان کردند. پس از آن پلیت 69 خانه، به‏مدت 5 دقیقه با 0002 دور در دقیقه برای ته‌نشینی کریستال‌های فورمازان سانتریفوژ شد. سپس 002 میکرولیتر محیط کشت محلول‌رویی جداسازی گردید و 002 میکرولیتر دی‌متیل‌سولفوکسید (OSMD) به هر چاهک به‏منظور محلول‌سازی بلورهای فورمازان افزوده شد و پس از 01 دقیقه جذب نمونه‌ها در 075 نانومتر در دستگاه الایزا ریدر  niapS (ledom 0012-xaF etatS) قرائت شد. مقدار رنگ تولید شده و جذب به‏طور مستقیم با تعداد سلول زنده متناسب بود. تمام آزمون‌ها در سه تکرار برای هر غلظت FSCG983TD انجام شد.

 

نتایج

تولید فرم محلول پروتئین DT389GCSF

طبق شرایط ذکر شده در قسمت مواد و روش‌ها، میزان بیان پروتئین DT389GCSF با استفاده از ژل SDS-PAGE مورد بررسی قرار گرفت. مشاهده‏ی باند 63 ~ کیلودالتونی بیان پروتئین هیبریدی DT389GCSF در زمان 4 ساعت پس از القا و عدم مشاهده‌ی باند در نمونه‌ی زمان صفر قبل از القا، که در شکل 2 نشان داده شده است، موید بیان پروتئین است. با استفاده از نرم افزار Image J، بیان 12 درصدی پروتئین هیبریدی DT389GCSF، پس از القا محاسبه و تخمین زده شد.

 

 

شکل2: ارزیابی بیان پروتئین DT389GCSF با استفاده از روش SDS-PAGE. M) مارکر وزن مولکولی پروتئینی. 1) باکتری نوترکیب در زمان صفر القا، 3) باکتری نوترکیب در زمان 4 ساعت پس از القا.

ازسوی‏دیگر روش‌های مختلفی جهت خالص‏سازی پروتئین‏های نوترکیب وجود دارد که در این پژوهش به‏دلیل برچسب هیستیدینی طراحی شده در ابتدای توالی ایمونوتوکسین، از روش کروماتوگرافی تمایلی نیکل جهت تخلیص فرم محلول DT389GCSF  بهره گرفته شد. بررسی میزان خلوص پروتئین DT389GCSF، پس از عبور از ستون نیکل-سفاروز، از ژل 10 درصد SDS-PAGE استفاده شد. همان‌طورکه در شکل 3 مشاهده می‌شود، از چاهک 5 به‏ سمت چاهک 8 با افزایش غلظت ایمیدازول، بر خلوص پروتئین افزوده شده است. با استفاده از نرم افزار Image J میزان خلوص نهایی DT389GCSF، 80 درصد برآورد شد.

 

 

شکل3: ارزیابی تخلیص پروتئین DT389GCSFبا استفاده ازروش SDS-PAGE. 1) نمونه ورودی به ستون،  2) نمونه خروجی از ستون، 3) مارکر وزن مولکولی برحسب کیلودالتون، 8-4) نمونه های خروجی از ستون حاوی DT389GCSF از شیب غلظت 50 میلی مولار تا غلظت 700 میلیمولار ایمیدازول.

 

ارزیابی عملکرد فرم محلول پروتئین  DT389GCSF

برای بررسی اثر سمیت‌ سلولیDT389GCSF خالص‌شده بر روی سلول‌های لوکمیای انسانی HL-60 که حامل گیرنده‌ی G-CSF هستند، از آزمونMTT استفاده شد. آزمون سنجش‌زیستی در شکل 4 برحسب میانگین جذب در570 نانومتر برای مقادیر (600 و 450 و 300 و 60 و0) میکروگرم DT389GCSF نشان داده شده است. (آزمایشات سه بار تکرار انجام شد.( نتایج بیان‏گر این بود که 48 ساعت بعد از تیمار تا میزان 60 میکروگرم DT389GCSF، تاثیر معنی‏داری بر مرگ سلولی نداشته اما پس از این مقدار، میزان بقای سلولی به‏ صورت وابسته به آن، کاهش داشته و میزان 600 میکروگرم از ایمونوتوکسین تولیدی  (6-10 مولار) نسبت به سایر غلظت‏ها، بیشترین سمیت را نشان داده است.

 

 

 

 

 

شکل 4: ارزیابی سمیت سلولی پروتئین  DT389GCSFتخلیص شده با استفاده از آزمون MTT. میانگین جذب خوانده شده در 570 نانومتر در مقادیر صفر تا 600 میکروگرم پروتئین. (آزمایشات با سه بار تکرار انجام شده است).


 


بحث

ایمونوتوکسین‌تراپی یک راهکار جدید و هوشمند برای مهار و غیرفعال‌سازی سلول‌های سرطانی محسوب می‌شود که می‌تواند برای درمان هدفمند سلول‌های سرطانی مورد استفاده قرار گیرد. پروتئین هیبریدی DT389GCSF، محصول فناوری DNA نوترکیب است که در آن G-CSF جایگزین دمین اتصالی توکسین طبیعی دیفتری شده است. براین اساس پروتئین طراحی شده از جایگاه گیرنده‌اش وارد سلول‌های حامل گیرنده‌ی G-CSF شده و به‏طور اختصاصی سبب مرگ سلول‏های سرطانی از جمله سرطان میلوئیدی حاد می‌شود. پروتئین DT389GCSF، اولین بار توسط چادویک در سال 1993 مورد مطالعه قرار گرفت. در آن تحقیق، توکسین دیفتری با توالی ناقص 486 آمینواسیدی به توالی کامل مربوط بهG-CSF ، از طریق رابط پپتیدی  HATPL متصل شده بود. وزن مولکولی پروتئینDT486GCSF، حدود 70 کیلو دالتون بود که در دمای 30 درجه سانتی‏گراد تولید و پس از خالص‌سازی، در معرض بلاست‌های AML با گیرنده‌ی G-CSF، با غلظت بالای 6-10  مولار اثر سمیت نشان داد و سبب مرگ سلولی شد (19). در تحقیق حاضر، پروتئین DT389GCSF با در نظر گرفتن ساختار ایمونوتوکسین تجاری شده‌ی اونتاک (DT389IL-2)، توکسین دیفتری دارای 389 ریشه‌ی آمینواسیدی است که از طریق رابط پپتیدی SG4SM به توالی کامل G-CSF اتصال یافته است و وزن مولکولی آن 63 کیلو دالتون  می باشد (8, 9, 11). طی مطالعه‌ی گذشته‌ توسط گروه تحقیقاتی پژوهش حاضر بر روی پروتئین‌ تلفیقی DT389GCSF، پیش بینی ساختاری آن در محیط رایانه با استفاده از نرم افزارهای مرتبط، انجام گرفت. صحت ساختار پروتئین DT389GCSF، از نظر خصوصیات صورت بندی و عملکردی، تایید شد (9). همچنین در تحقیق دیگر، پس از بیان پروتئین DT389GCSF به فرم اینکلوژن بادی در دمای 37 درجه سانتی‏گراد و خالص‌سازی آن از طریق شستشوی 3 مرحله‌ای با بافر تریس 50 میلیمولار حاوی اوره‌ی 3 مولار، بازتاخوردگی فرم اینکلوژن‌بادی پروتئین FSCG983TD در حضور سیستئین 52 مولار انجام گرفت. توسط فلوئورسانس نشر ذاتی‏، طیف‌سنجی دورنگ‌نمایی دورانی‏، عملکرد نوکلئازی بخش توکسینی و همچنین ارزیابی سمیت با آزمون TTM، پروتئین تولیدی مورد ارزیابی ساختاری و عملکردی قرار گرفت . نتایج بیان‏گر کسب ساختار و عملکرد مناسب FSCD983TD پس از مرحله‌ی بازتاخوردگی بود )01(.

یک مرحله‌ی گلوگاهی در طراحی زیست دارو‌ها که در باکتری E. coli تظاهر می‌یابند، بحث عملکرد پروتئین تولیدی است که البته عملکرد صحیح هر پروتئینی در گروی داشتن ساختار صحیح آن است. در سیتوپلاسم  E. coli به‌‏ دلیل‏ این‏که پروتئین‌ها بیان بالایی دارند و شرایط مناسبی برای تاخوردگی صحیح آن‏ها وجود ندارد به‏صورت ذرات نامحلول به‏نام اینکلوژن‌بادی در می‌آیند. به‏دلیل این‏که پروتئین حالت­های تاخورده‌ی نا­صحیح دارد نمی‏تواند فعالیت بیولوژیکی داشته باشد و بازتاخوردگی صحیح پروتئین به‏راحتی میسر نمی‌باشد. در نتیجه ممکن است در طی مراحل بازتاخوردگی با گونه­های دیگر پروتئین از جمله تجمعات پروتئینی و اشکال غیرطبیعی پروتئین همراه باشد. بنابراین به‌دست‌آوردن پروتئین با تاخوردگی صحیح طی روند بازتاخوردگی در شرایط خارج بدنی (in vitro) مشکل بوده و بازده پایینی دارد (20, 21). در پژوهشی، بازده بازتاخوردگی فرم اینکلوژن‌بادی GCSF به فرم فعال، 30 درصد عنوان شده‌ است (22). همچنین در مطالعه‌ی دیگر، طی انجام مراحل زمان‏بر و طولانی و مشکل و پرهزینه، به‏منظور بازتاخوردگی ایمونوتوکسین DT389IL2، میزان زیادی از پروتئین به تجمعات پروتئینی و اشکال غیرفعال پروتئین تبدیل شده بود (23). به‏منظور حذف مراحل زمانبر و پرهزینه‌ی بازتاخوردگی و افزایش بازده تولید پروتئین نوترکیب با ساختار و فعالیت بیولوژیکی صحیح، می‌توان از کشت باکتری در دمای پایین بهره برد. در این روش با پایین آوردن دمای کشت، سرعت بیان پروتئین توسط سلول باکتریایی کاهش یافته به‏گونه‏ای که پروتئین برای تاخوردگی صحیح فرصت پیدا می‏کند (5, 8, 18, 24).

به‏همین منظور، در مطالعه‌ی حاضر، پروتئین DT389GCSF در شرایط آزمایشگاهی در سویه‌ی بیانی  E. coli BL21(DE3) حاوی پلاسمید نوترکیب  pET-DT389GCSF در دمای 28 درجه سانتی‏گراد تحت تاثیر ماده القاگر IPTG، 1 میلی مولار قرار گرفت. نتایج حاصل از SDS-PAGE، بیان‏گر بیان مناسب (در حدود 12 درصد) ایمونوتوکسین نوترکیب بود. پروتئین نوترکیب بیان شده به‏صورت محلول، به‏دلیل دارا بودن توالی 6 آمینواسید هیستیدینی در انتهای N-ترمینال، به‏روش کروماتوگرافی تمایلی نیکل تخلیص شد و توسط روش الکتروفورز پلی‏آکریل‏آمید و با استفاده از نرم افزار Image J خلوص تقریبی 80 درصدی پروتئین محاسبه شد. سنجش سمیت ایمونوتوکسین نوترکیب بر روی رده‌ سلولی HL-60 که نوعی سلول لوکمیای انسانی است و حاوی گیرنده‌ی G-CSF است، انجام گرفت و میزان مرگ و میر سلول با آزمون MTT مورد ارزیابی و مقایسه قرار گرفت. نتایج بیان‏گر این مطلب بود که با افزایش غلظت DT389GCSF، میزان جذب در 570 نانومتر کاهش یافت. که این امر بیان‏گر کاهش در تعداد سلول‏های زنده می باشد. بررسی داده های حاصل از سنجش زیستی نشان داد که میزان 600 میکروگرم  بیشترین سمیت را داشته و میزان  IC50 (غلظت مورد نیاز DT389GCSF، برای کشته شدن 50 درصد سلول‏های HL-60) برابر 000019/0±00017/0 مولار محاسبه و تخمین زده شد. نتایج حاصله بیان‏گر این مطلب است که فرم محلول این ایمونوتوکسین دارای ساختار صحیح و عملکرد مناسب می‌باشد.

 

نتیجه­گیری

در نتیجه با بیان پروتئین DT389GCSF به‏شکل محلول، می‏توان با رفع مشکلات زیر هزینه‌های تولید را به‏حداقل رساند:

(1) بازتاخوردگی صحیح فرم غیرفعال اینکلوژن‌بادی پروتئین‌های نوترکیب بیان شده در پروکاریوت‏ها، به‏راحتی میسر نیست.

(2) امکان تشکیل گونه­های دیگر پروتئین از جمله تجمعات پروتئینی (آگریگاسیون) و اشکال غیرفعال پروتئین در طی مراحل بازتاخوردگی وجود دارد.

(3) مراحل پایین‌دستی بازتاخوردگی و اوره‌زدایی فرم اینکلوژن‌بادی منجر به از دست رفتن مقادیر زیادی از پروتئین طی این مراحل شده و باعث صرف زمان و هزینه‌ زیادی می‏شود.

 

تشکر و قدردانی

نویسندگان برخود لازم می‌دانند از دانشگاه صنعتی مالک‌ اشتر برای حمایت‏های مالی جهت انجام این پژوهش تشکر نمایند.

1.Kayastha N, Wolf SP, Locke SC, Samsa GP, El-Jawahri A, LeBlanc TW. The impact of remission status on patients’ experiences with acute myeloid leukemia (AML): an exploratory analysis of longitudinal patient-reported outcomes data. Supportive Care in Cancer 2018;26(5):1437-1445.

2. Giles FJ, Keating A, Goldstone AH, Avivi I, Willman CL, Kantarjian HM. Acute myeloid leukemia. ASH Education Program Book 2002;2002(1):73-110.

3. Ma G, Wang Y, Ahmed T, Zaslav A-L, Hogan L, Avila C, et al. Anti-CD19 Chimeric Antigen Receptor Targeting of CD19+ Acute Myeloid Leukemia. Leukemia Research Reports 2018.

4. Zarkar N, Khalili MA, Ahmadpour F, Khodadadi S, Zeinoddini M. In Silico and in Vitro Evaluation of Deamidation Effects on the Stability of the Fusion Toxin DAB389IL-2. Current Proteomics 2019;16(4):307-313.

5. Zarkar N, Khalili MAN, Khodadadi S, Zeinoddini M, Ahmadpour F. Expression and purification of soluble and functional fusion protein DAB389IL‐2 into the E. coli strain Rosetta‐gami (DE3). Biotechnology and applied biochemistry 2019.

 

6. Bayat S, Zeinoddini M, Azizi A, Khalili MN. Co-Solvents Effects on the Stability of Recombinant Immunotoxin Denileukin Diftitox: Structure and Function Assessment. Iranian Journal of Science and Technology, Transactions A: Science 2019:1-7.

7. Murphy JR. Mechanism of diphtheria toxin catalytic domain delivery to the eukaryotic cell cytosol and the cellular factors that directly participate in the process. Toxins 2011;3(3):294-308.

8. Moghaddas M, Zeinoddini M, Saeedinia A, Bayat S. Structural and Functional Assessment of Diphtheria Fusion Toxin: DT389GCSF. Journal of Bionanoscience 2018;12(2):240-244.

9. Siahmazgi M, Khalili M, Ahmadpour F, Khodadadi S, Zeinoddini M. In silico design of fusion toxin DT389GCSF and comparison of interaction it with GCSF receptor rather than DT486GCSF. Current computer-aided drug design 2018.

10. Siahmazgi MG, Khalili MAN, Zeinoddini M, Ahmadpour F, Khodadadi S. Purification and Characterization of DT 389 GCSF Fusion Protein: A Unique Immunotoxin Against the Human Granulocyte-Colony Stimulating Factor Receptor. International Journal of Peptide Research and Therapeutics 2019:1-8.

 

11. Babavalian E, Zeinoddini M, Saeedinia A, Mohammadi R, Xodadadi N. Design of a recombinant immunotoxin against the human granulocyte-colony stimulating factor receptor. Molecular biology reports 2018:1-5.

 

12. Donyapoor F, Zeinoddini M, Saeedinia AR. Cloning and Expression of Recombinant Immunotoxin using Diphtheria Toxin and Granulocyte Colony Stimulating Factor (G-CSF). Cloning 2016;19(110):42-50.

13. Naghoosi H, Behzadian F, Saeedinia A, Ghorashi SA. Site-directed mutagenesis in human granulocyte-colony stimulating factor, cloning and expression in Escherichia coli. Iranian Journal of Biotechnology 2008;6(4):229-234.

 

 

14. Rao DVK, Narasu ML, Rao AKSB. A purification method for improving the process yield and quality of recombinant human granulocyte colony‐stimulating factor expressed in Escherichia coli and its characterization. Biotechnology and applied biochemistry 2008;50(2):77-87.

 

15. Fallah M, Akbari B, Saeedinia A, Karimi M, Vaez M, Zeinoddini M, et al. Overexpression of recombinant human granulocyte colony-stimulating factor in E. coli. Iranian Journal of Medical Sciences 2015;28(3):131-134.

 

16. Frankel AE, Powell BL, Hall PD, Case LD, Kreitman RJ. Phase I trial of a novel diphtheria toxin/granulocyte macrophage colony-stimulating factor fusion protein (DT388GMCSF) for refractory or relapsed acute myeloid leukemia. Clinical Cancer Research 2002;8(5):1004-1013.

 

17. Urieto JO, Liu T, Black JH, Cohen KA, Hall PD, Willingham MC, et al. Expression and purification of the recombinant diphtheria fusion toxin DT388IL3 for phase I clinical trials. Protein expression and purification 2004;33(1):123-133.

 

18. Rabhi-Essafi I, Sadok A, Khalaf N, Fathallah DM. A strategy for high-level expression of soluble and functional human interferon α as a GST-fusion protein in E. coli. Protein Engineering, Design & Selection 2007;20(5):201-209.

 

19. Chadwick D, Williams D, Niho Y, Murphy J, Minden M. Cytotoxicity of a recombinant diphtheria toxin-granulocyte colony-stimulating factor fusion protein on human leukemic blast cells. Leukemia & lymphoma 1993;11(3-4):249-262.

20. Sivashanmugam A, Murray V, Cui C, Zhang Y, Wang J, Li Q. Practical protocols for production of very high yields of recombinant proteins using Escherichia coli. Protein Science 2009;18(5):936-948.

 

21. Huang C-J, Lin H, Yang X. Industrial production of recombinant therapeutics in Escherichia coli and its recent advancements. Journal of industrial microbiology & biotechnology 2012;39(3):383-399.

 

22. Ramya M, Selvarajan E. Purification of human recombinant granulocyte colony stimulating factor from Escherichia coli. African Journal of Biotechnology 2012;11(50):11104-11109.

 

23. Potala S, Verma RS. Modified DT–IL2 fusion toxin targeting uniquely IL2Rα expressing leukemia cell lines–Construction and characterization. Journal of biotechnology 2010;148(2-3):147-155.

 

24. Forrer P, Jaussi R. High-level expression of soluble heterologous proteins in the cytoplasm of Escherichia coli by fusion to the bacteriophage lambda head protein D. Gene 1998;224(1-2):45-52.